Desarrollo de una ciclodextrina ternaria - Coastwise Ventures Group Co., Ltd.

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1234 (2022) Citar este artículo

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El diseño de funcionalidades útiles en antibióticos antiguos clínicamente validados promete proporcionar la solución más económica para la falta mundial de antibióticos efectivos, que sin duda es una grave amenaza para la salud. Aquí mostramos que el uso de la química de superficie del ciclo de la ciclodextrina (βCD) y la arginina (arg) como enlazador proporciona un complejo antibiótico ternario más estable (βCD-arg-cpx). A diferencia de los complejos de inclusión clásicos menos estables, que solo modifican la solubilidad del antibiótico, el complejo ternario presentado aquí es más estable y controla la liberación del fármaco. Los componentes del complejo intensifican las interacciones con las membranas bacterianas y aumentan la disponibilidad del fármaco dentro de las células bacterianas, mejorando así su eficacia antimicrobiana y su perfil de seguridad. Los antibióticos multifuncionales, formulados como sistemas de administración de fármacos per se, que llevan el fármaco al sitio de acción, maximizan su eficacia y brindan detectabilidad óptica, se prevén como el futuro en la lucha contra las infecciones. Su papel como herramienta frente a cepas multirresistentes sigue siendo un interesante reto abierto a futuras investigaciones.

La disminución de los antimicrobianos eficaces plantea una amenaza muy grave para la salud mundial en el mundo moderno, como señaló recientemente la Organización Mundial de la Salud1. Solo unos pocos antibióticos nuevos han llegado al mercado en las últimas décadas, y no se ha descubierto ninguna clase completamente nueva de antibióticos desde 19802. Con costos enormes y beneficios impredecibles y a corto plazo, el descubrimiento de nuevos antibióticos no es una prioridad importante para la industria farmacéutica2,3. La readaptación, el rediseño o la reutilización de medicamentos clínicamente aprobados tiene ventajas importantes en tiempo y costo sobre el descubrimiento de nuevos candidatos a fármacos, especialmente en situaciones emergentes como las pandemias4,5. Los beneficios críticos son un perfil de seguridad predecible, conocimiento previo sobre los procedimientos de fabricación, protocolos de prueba establecidos, requisitos regulatorios más sencillos y períodos de comercialización más cortos, entre muchos otros6,7. Por lo tanto, no es de extrañar que aproximadamente un tercio de todos los medicamentos aprobados en la última década hayan sido medicamentos antiguos reutilizados, lo que representa el 25% de los ingresos de la industria farmacéutica7,8. Gran parte del esfuerzo en la actual cartera de antibióticos preclínicos se centra en modificar los antibióticos antiguos para aumentar su eficacia, especialmente en sinergia con otros fármacos o componentes auxiliares no farmacológicos9,10. Los principales desafíos científicos para lograr esto son la penetración, el flujo de salida y la toxicidad limitados asociados con el tratamiento con dosis altas9,10.

Un enfoque simple y muy efectivo para rediseñar antibióticos antiguos incluye la formación de complejos inestables que modifican propiedades como la solubilidad, la estabilidad, la biodisponibilidad y la permeabilidad, lo que influye directamente en su resultado terapéutico. En ese contexto, las ciclodextrinas (CD) son particularmente aplicables11,12. De estructura troncocónica, tienen una cubierta hidrófila (con 7 grupos primarios orientados hacia el borde estrecho y 14 grupos hidroxilo de azúcar secundarios orientados hacia el borde más ancho del cono, en el caso de β-CD) y un núcleo hidrófobo (con un esqueleto de carbono de 7 unidades de glucopiranosa que componen la estructura de β-CD) disponible para interacciones con moléculas de fármacos11,13,14. Más comúnmente, los antibióticos se formulan como complejos de inclusión cuando la parte hidrofóbica del fármaco interactúa con el área del núcleo interno hidrofóbico de la CD, lo que en consecuencia aumenta su solubilidad varias veces11. Este enfoque se ha aplicado a varios antibióticos (betalactámicos, microlidos, fluoroquinolonas, sulfonamidas, tetraciclinas y aminoglucósidos), y sus concentraciones inhibitorias mínimas (CMI) se redujeron por factores de 2 a más de 10011. Es un método impulsado por la entalpía. proceso, y el complejo CD-fármaco huésped-huésped está en equilibrio con el fármaco libre sin enlace químico12. Este enfoque se vuelve aún más efectivo si el excipiente de CD se combina con componentes auxiliares especialmente seleccionados (como polímeros hidrofílicos, aminoácidos o ácidos hidroxilados) para formar complejos ternarios15,16,17,18. La parte hidrófoba del fármaco forma un complejo de inclusión de fármaco CD, mientras que la parte hidrófila experimenta simultáneamente una reacción ácido-base con el componente auxiliar para formar una sal.

Un buen ejemplo es la arginina, un aminoácido básico, que forma sales con fármacos ácidos (p. ej., naproxeno, zoloprofeno, oxaprozina) complejados con CD16,17,18. Como resultado, se obtiene un importante aumento de la constante de estabilidad y de la eficacia de complejación. Por lo tanto, se espera que la combinación de un antibiótico con CD y arginina en un complejo ternario pueda influir fuertemente en su actividad antimicrobiana. Sin embargo, hasta el momento solo se han realizado unas pocas investigaciones de tales complejos, entre las cuales un estudio sobre cefuroxima ha demostrado un aumento drástico de la solubilidad después de la formación de complejos ternarios con CD y arginina19.

En lugar de los complejos de inclusión menos estables que se suelen formar para aumentar la solubilidad del fármaco, diseñamos un complejo antibiótico ternario β-ciclodextrina-arginina-ciprofloxacina (βCD-arg-cpx) más estable, en el que la ciprofloxacina (cpx) se une a la superficie hidrófila de βCD a través de un enlazador de arginina (arg). Con este enfoque, nuestro objetivo no era simplemente aumentar la solubilidad del fármaco como de costumbre. Aquí, nuestro sistema complejo sintetizado es más estable para controlar la liberación de antibióticos, permite interacciones mejoradas con la pared celular y las membranas bacterianas y proporciona una mayor permeabilidad y disponibilidad dentro de las bacterias, lo que mejora la eficacia del tratamiento antibacteriano. Junto con una eficacia antimicrobiana mejorada, se demostró una mejora considerable en el perfil de seguridad.

El complejo βCD-arg-cpx se ensambla en estructuras 3D bien organizadas (Fig. 1a) como varillas de unos pocos micrómetros de largo (Fig. 1b) con estructuras radiales altamente ordenadas compuestas de placas conectadas lateralmente de unas pocas decenas de nanómetros de espesor (Fig. 1c). Una mirada más cercana a las placas individuales y el patrón de difracción de electrones asociado (Fig. 1d) revela su naturaleza monocristalina. Morfológicamente, estos ensamblajes difieren de βCD-cpx, y los complejos βCD-arg se detectaron como partículas no ensambladas de forma irregular (Fig. 1e-g).

Ilustración de la estructura con un núcleo cristalino arg-cpx y βCD en la superficie (a). Morfología SEM que muestra estructuras largas, alineadas y similares a varillas del complejo βCD-arg-cpx (b) con bordes afilados y nanogruesos (c). Imagen TEM de mayor aumento de las varillas βCD-arg-cpx (d) y el patrón EDS que muestra su naturaleza cristalina (insertar en (d)). Estructuras TEM que revelan diferencias entre βCD-arg-cpx (e), βCD-cpx (f) y βCD-arg (g).

El mapeo elemental en un complejo βCD-arg-cpx de una sola barra (Fig. 2a1) detectó elementos C (Fig. 2a2), F (Fig. 2a3), N (Fig. 2a4) y O (Fig. 2a5) distribuidos homogéneamente a lo largo del gran área de un cristal. Se realizó un análisis adicional XPS de la composición de la superficie en la referencia del fármaco cpx, así como en el complejo βCD-arg-cpx antes y después del grabado suave con Arions. Dado que N está presente tanto en el antibiótico como en la arginina (no en CD), mientras que F está presente solo en cpx, la relación N/F más alta en un complejo en comparación con cpx se debió a la unión de arginina. Por otro lado, la disminución de las proporciones C/F y O/F desde la superficie hasta la mayor parte del complejo βCD-arg-cpx confirmó la βCD en la superficie. Como el lado F de cpx no está incluido en la complejación, el máximo a 687,5 eV en el espectro F1s (correspondiente a los enlaces CF)20 permanece sin cambios para los tres sistemas investigados (Fig. 2b2). Por otro lado, N1s (con dos máximos a 401,1 eV y 399,7 eV, correspondientes a enlaces CNC y C-NH20, Fig. 2b4) revela una mayor fracción de aminas principalmente en el complejo que en el fármaco libre de cpx que se debe a la unión de arginina parte. Su aumento se observa en el área masiva del complejo. El espectro C1s (con máximos en 287 eV, 285,8 eV y 284,8 eV correspondientes a C=O, CN y CC, respectivamente)20 y O1s (con máximos en 533,1 eV y 531,5 eV, correspondientes a CO y (C=O)- OH, respectivamente)20) muestran una disminución de las intensidades de los máximos pertenecientes a los grupos CO y CN en un complejo en comparación con la referencia cpx libre, lo que se debe a su participación en la complejación.

Imagen STEM (a1) con análisis de mapeo elemental correspondiente a carbono (C) (a2), oxígeno (O) (a3), nitrógeno (N) (a4) y flúor (F) (a5); Análisis XPS de la superficie y el volumen (obtenidos después de un grabado suave) del complejo βCD-arg-cpx en comparación con la referencia cpx prístina: espectros de alta resolución C1s (b1), F1s (b2), O1s (b3) y N1s (b4) .

Los ensamblajes complejos βCD-arg-cpx de alta relación de aspecto son altamente cristalinos, como lo indican sus máximos de difracción policristalinos nítidos (Fig. 1a complementaria). La estructura cristalina detectada es similar a la del cpx desprotonado básico (como se observa en la ref. 21), con máximos de difracción desplazados y la aparición de nuevos picos. También difiere ligeramente de la estructura detectada para el complejo βCD-NaOH-cpx (una referencia precipitada al reemplazar arg con NaOH) y coincide exactamente con la estructura de arg-cpx (una referencia correspondiente a la sal de ciprofloxacina-arginina) (Fig. 1a), que resulta de la reacción ácido-básica entre cpx y arg, formación de la sal y su cristalización. Por el contrario, la cristalización de los componentes cpx y arg separados dentro de los agregados complejos βCD-cpx y βCD-arg es baja, lo que da baja intensidad y amplios máximos de difracción (Fig. 1a complementaria). Debido a la ausencia del ensamblaje, el orden cristalino en estas estructuras se ve notablemente disminuido. Por lo tanto, la parte cristalina de βCD-arg-cpx consistía en una sal de arg-cpx con un componente βCD amorfo asociado a la superficie del cristal.

Se observaron grandes diferencias estructurales entre los diferentes tipos de complejos, particularmente en sus espectros FTIR (Figura complementaria 1b). El espectro FTIR del complejo de inclusión βCD-arg (Fig. 1b complementaria) mostró bandas típicas de βCD con un amplio estiramiento de OH a 3300 cm−1 y flexión de OH a 1640 cm−1, y estiramiento de CH a 2925 cm−1 y vibración de anillo bandas como estiramiento asimétrico de COC y CC a 1152 cm−1, 1026 cm−1 y 932 cm−1 17,22,23, y modos de estiramiento de guanidina CN de arginina a 1554 cm−1 (más detalles en la Fig. 2 complementaria) 24 La intensidad de los modos de estiramiento y flexión de OH de βCD se alteró en el espectro de βCD-arg, pero no se observaron bandas adicionales (Fig. 2 complementaria). En el complejo βCD-cpx, se observaron ligeros cambios de posición para las bandas correspondientes a las vibraciones del anillo aromático de cpx y βCD obtenidas debido a la incorporación de la molécula dentro del cono βCD, que es típico de los complejos de inclusión (Figura 3 complementaria)25 ,26. Además, la banda vibratoria del carboxilo C=O de cpx a 1708 cm−1 indicó una forma molecular neutra25,26. El complejo βCD-cpx no mostró bandas adicionales (Fig. 3 complementaria).

Se observó una situación completamente diferente para el complejo βCD-arg-cpx (Fig. 1b complementaria). El modo de vibración de estiramiento del carbonilo C=O, detectado a 1708 cm−1 en βCD-cpx y también en la mezcla física de los componentes βCD, arg y cpx, falta en los espectros de ambos complejos, βCD-arg-cpx y βCD-NaOH- cpx, mientras que la vibración de carboxilato asimétrica de los complejos (que faltaba en el caso de la mezcla física y βCD-cpx) aparece en 1578 cm−1, lo que indica formas cpx de zwitterión dentro de βCD-arg-cpx y βCD-NaOH-cpx (Figs. 3 y S4). En contraste con el espectro del complejo de inclusión βCD-cpx y el espectro de una mezcla física de componentes del complejo, en βCD-arg-cpx, faltaba la vibración de estiramiento cpx OH a 3526 cm−1, otra indicación de su desprotonación. forma dentro del complejo. Además, las bandas vibratorias típicas observadas en complejos anteriores aparecieron en el espectro de βCD-arg-cpx con mayor intensidad, relaciones de intensidad modificadas y mayor resolución, lo que indica un aumento en el orden estructural y la cristalinidad (como se observa en las vibraciones del grupo carbonilo en formulaciones que contienen semicristalino cpx)26. Se detectaron nuevas bandas vibratorias, particularmente en el área de la huella digital (Fig. 4 complementaria), que no pertenecían a ninguno de los componentes separados del complejo (por separado y en su mezcla física) sino que eran consecuencia de la nueva estructura del complejo. Fue interesante observar que la mayoría de las nuevas bandas obtenidas para βCD-arg-cpx también se detectaron en arg-cpx y βCD-NaOH-cpx, ajustadas al mismo pH usando arginina o NaOH, lo que además confirmó la estructura similar de complejos formados utilizando estos dos moduladores de la acidez. Sin embargo, la presencia de arginina dentro de βCD-arg-cpx afectó las vibraciones del anillo del ciclo de βCD, observadas como ausencia de vibraciones típicas de βCD en 1079 y 996 cm−1 y libertad de vibración adicional detectada a través de la nueva banda en 1178 cm−1 , que no se detectó en βCD-NaOH-cpx. Estas nuevas interacciones dentro de βCD-arg-cpx podrían ser una fuente de mejor estabilidad compleja, que se mostrará más adelante. Las investigaciones de las propiedades ópticas de los complejos βCD- permitieron comprender mejor sus características estructurales. Los espectros de emisión de fluorescencia de los complejos βCD-arg-cpx y arg-cpx (Fig. 1c complementaria) mostraron un cambio batocrómico cuando el componente βCD se unió a la sal arg-cpx. Se observó un cambio en ambos casos cuando βCD se unió al complejo βCD-arg-cpx o βCD-NaOH-cpx (Fig. 1c complementaria). Indirectamente, esta observación confirmó la presencia de este componente amorfo en la parte superior de los cristales cpx desprotonados (detectados en XRD y luego revelados en FTIR) y proporcionaron evidencia de la posición de unión. La fluorescencia observada se asignó a la molécula de antibiótico, con grupos donadores de electrones de piperazinilo y aceptores de electrones del ácido 4-oxoquinolina-3-carboxílico27. De forma similar, en el presente caso, cpx está enlazada vía arg a βCD vía un grupo piperazinilo con naturaleza donante de electrones. La unión de la molécula cpx sobre el enlazador de arginina a βCD (o directamente a la molécula de βCD) limita sus movimientos intramoleculares y elimina las relajaciones no radiantes, lo que permite la fluorescencia en el λmax desplazado en comparación con la forma de fármaco libre.

Monitorear el pH y el potencial zeta y reemplazar arg con NaOH como modificador de pH reveló pasos críticos hacia la formación de complejos (Fig. 3). Inicialmente, la mezcla de reacción tenía un pH de 7,5, en el que βCD tiene grupos OH disponibles, arg está en forma de ión híbrido con una carga catiónica en guanidina y grupos carboxilo desprotonados, y cpx tiene una amina catiónica en piperazinilo y grupos carboxilo desprotonados (como se ilustra en la Fig. 3a). La formación del complejo βCD-arg-Cpx comienza con una reacción a base de ácido en la que los grupos carboxilo en arg interactúan con la amina catiónica en el lado piperazinil cpx, formando una sal arg-cpx (Fig. 3b). El paso de cristalización por precipitación permite la formación de estructuras de varillas largas. La superficie de los cristales formados tiene grupos de guanidina libres disponibles para unir componentes βCD amorfos y ensamblar el complejo CD-arg-Cpx final (Fig. 3b). Las aminas del grupo funcional guanidina en la arginina tienen una afinidad muy alta por los enlaces de hidrógeno, con la posibilidad de formar hasta cinco enlaces que involucran aminas tanto protonadas como no protonadas28. Por lo tanto, en el complejo formado, la arginina tiene el papel de un enlazador, que utiliza grupos guanidina catiónicos para unir βCD a la superficie y grupos carboxilo iónicos para unir cpx. El potencial zeta de βCD (inicialmente a pH = 6) cambia después de agregar arginina (Tabla en la Fig. 3), lo que indica interacciones entre los grupos catiónicos del esqueleto de guanidina y los grupos OH en el lado externo hidrofílico de βCD.

Estructuras moleculares de la mezcla precursora antes de la precipitación (pH 7.5), cambio de potencial zeta para diferentes componentes del complejo y precipitación después de 2 h de mezclado en el caso de ajuste de pH con arginina (y su retraso cuando se reemplaza arg por NaOH (βCD-NaOH- cpx)) (a). Precipitación (pH 6,5) que implica la formación de sal arg-cpx y unión βCD seguida de cristalización y ensamblaje (b).

La estructura del complejo CD-arg-cpx formado aparece como un precipitado de color blanco ópalo brillante dentro de las dos horas posteriores a la mezcla de todos los componentes. Cuando βCD se mezcla directamente con cpx sin agregar arginina, la solución permanece transparente sin precipitación. La medición del potencial zeta del polvo liofilizado da valores neutros correspondientes a agregados del complejo βCD-cpx inestables. Como se observó anteriormente, el complejo de inclusión βCD-cpx se forma mediante la incorporación de un resto de ácido 4-oxoquinolina-3-carboxílico hidrofóbico de la molécula cpx dentro del cono hidrofóbico de βCD29. Cuando se ajustó la acidez de la mezcla de reacción inicial usando NaOH (en lugar de arginina), la precipitación de βCD-NaOH-cpx como un complejo libre de arg fue mucho más lenta y no tuvo lugar después de dos horas de mezclado, como en el caso de βCD-arg-cpx (ilustrado en fotos en la Fig. 3a), pero se retrasó durante las siguientes 24 h. βCD-NaOH-cpx es un complejo de βCD-cpx con pH ajustado y carece de la estabilidad observada para βCD-arg-cpx.

Los ensamblajes βCD-arg-cpx emitieron una luz fluorescente azul intensa que apareció junto con sus estructuras en forma de varilla (Fig. 4a). También se observó una fluorescencia similar para βCD-cpx (siguiendo la estructura de forma irregular del agregado complejo) (Fig. 4b), pero no para βCD-arg (que también forma agregados irregulares) (Fig. 4c). Se ha observado previamente que los derivados de ciprofloxacina, en forma de nanoagregados esféricos que contienen anillos de perfluoroarilo y fenilo unidos por enlaces de amidina al grupo piperazinilo de la ciprofloxacina, muestran emisión inducida por agregación (AIE)27. Sin embargo, hasta donde sabemos, AIE en complejos de ciprofloxacina que contienen βCD no se ha detectado antes.

Fluorescencia azul de complejos que contienen cpx (βCD-arg-cpx y βCD-cpx) (no detectada para βCD-arg) (a). Espectros de fluorescencia de βCD-arg-cpx y cpx libre (y complejo βCD-cpx comparable) antes y después de disolverse en agua que confirman diferentes mecanismos de disolución (complejo disuelto frente a fármaco libre disuelto) (b). Detección de βCD-arg-cpx y de bacterias (100 μg/ml del complejo tras 10 min de exposición a P. aeruginosa PAO1 teñida con yoduro de propidio (PI, fluorescencia roja, detección de bacterias muertas) (c).

También se observaron diferencias en los espectros fluorescentes de los complejos βCD-arg-cpx y βCD-cpx, particularmente antes y después de disolverse en agua (Fig. 4b). En polvos sólidos, los espectros de fluorescencia de βCD-arg-cpx y cpx libre no eran los mismos, lo que revelaba un corrimiento hacia el azul en el espectro de la estructura complejada con arginina. Cuando se disolvió en agua, el espectro de βCD-arg-cpx siguió siendo el mismo que el de la forma de complejo sólido, mientras que los espectros del fármaco libre y el complejo de inclusión βCD-cpx menos estable se desplazaron hacia el rojo con exactamente la misma forma de fluorescencia. máximo. Un análisis adicional de los componentes disueltos en agua reveló cpx libre (y sus dímeros y trímeros identificados en los espectros de MS, Fig. 5a complementaria), mientras que en el caso de βCD-arg-Cpx, durante el envejecimiento en un ambiente acuoso, el complejo liberó cpx libre, cpx-arg, arg y βCD (Fig. 5b complementaria).

La fluorescencia azul intensa proporciona a βCD-arg-cpx una funcionalidad de detección adicional. Después de la exposición al complejo βCD-arg-cpx por un corto tiempo, la viabilidad de las bacterias se vio fuertemente afectada, como se detectó por la fluorescencia roja del yoduro de propidio en una alta fracción de células, que representan bacterias muertas. También pudimos detectar la fluorescencia azul de los ensamblajes en forma de varilla βCD-arg-cpx, que liberaron el complejo con una fuerte actividad antimicrobiana (Fig. 4c).

Incluso en un contexto cuantitativo, βCD-arg-cpx difería del complejo clásico βCD-cpx (Fig. 5a). Según lo determinado a partir de los espectros UV-vis de los cpx restantes en la solución después de la formación del complejo, βCD-arg-cpx contenía tres veces el contenido de cpx de βCD-cpx sin arginina. La presencia de arginina y su papel en la formación del complejo afectó el contenido de fármaco dentro del complejo. Se observó una diferencia de 1,5 veces en el contenido de cpx para βCD-cpx y βCD-NaOH-cpx (Fig. 5b), lo que muestra que una diferencia en el pH afectó el contenido del fármaco incluido en el complejo. Sin embargo, en el caso de βCD-arg-cpx, el efecto no se debió únicamente a la contribución del pH durante la formación del complejo, ya que el uso de arginina para modificar el pH al mismo nivel que para NaOH dentro del complejo βCD-NaOH-cpx resultó en un contenido de cpx dos veces mayor en βCD-arg-cpx.

Cpx en sobrenadantes obtenidos tras la síntesis del complejo (y contenido calculado de cpx en complejos βCD) (fármaco liberado del complejo CD-arg-Cpx indicado en azul, del complejo CD-NaOH-Cpx en naranja y del CD-Cpx en negro) (a ) y cinéticas comparativas de liberación de fármacos de βCD-cpx (negro), βCD-arg-cpx (gris oscuro) y βCD-NaOH-cpx (gris lítico) (b); n = 3; las barras de error se refieren a la desviación estándar de la liberación del fármaco.

Junto con su contribución a la formación, ensamblaje y contenido de fármaco incorporado, la arginina afectó la liberación del fármaco del complejo. En un complejo de inclusión clásica βCD-cpx, un equilibrio dinámico menos estable entre el fármaco y el cono hidrofóbico βCD, la liberación de cpx es rápida (Fig. 5b). Después de la incubación a 37 °C en tampón PBS, se liberó más del 60 % del fármaco después de 10 min de incubación. La descomposición completa del complejo y liberación de todos los cpx incorporados se produjo en las primeras 24 h. La cinética de liberación fue ligeramente más lenta en el caso de βCD-NaOH-cpx (Fig. 5b): la liberación inicial fue de aproximadamente un 40%, y al cabo de 24 h, el complejo liberaba hasta un 70% del fármaco incorporado.

En los sistemas de administración de fármacos (como esferas poliméricas encapsuladas), la liberación del fármaco depende de las propiedades del portador del fármaco (es decir, degradación de la matriz polimérica, hinchamiento, respuesta dependiente de T/pH) que permite la liberación física o la desorción del fármaco atrapado. En el caso actual, el fármaco, como parte del complejo, forma parte del sistema de administración del fármaco y su liberación depende de la estabilidad y solubilidad del complejo. Debido a la diferencia en el ensamblaje, el complejo βCD-arg-cpx fue más estable que el complejo de inclusión de βCD-cpx y el complejo βCD-NaOH-cpx modificado con pH, mostrando la liberación más lenta (Fig. 5b). Se sabe que el autoensamblaje de las CD naturales y los complejos farmacológicos afecta a su solubilidad12. Inicialmente, este complejo liberaba solo el 20% del fármaco incorporado y la liberación continuaba lentamente, llegando a liberar hasta el 30% del fármaco a las 24 h. La aplicación de βCD como excipiente o la aplicación de arginina para crear una sal de fármaco dentro de complejos de βCD-fármaco es una forma conveniente de mejorar la solubilidad del fármaco. Por el contrario, el nuevo complejo βCD-arg-cpx se desensambla lentamente, disminuye la disolución del fármaco y permite controlar su liberación. La contribución observada a la solubilidad del fármaco es consecuencia de la diferente unión del fármaco a los otros dos componentes (como se ilustra en la Fig. 3). En lugar de incorporar la parte hidrofóbica del fármaco dentro del cono de βCD y unir la arginina a su parte hidrofílica, que generalmente permanece fuera del cono de βCD, el fármaco se une a la superficie de βCD a través de un conector de arginina, lo que hace que toda la estructura sea más estable contra disolución. Además, las fuerzas que mantienen unidos los ensamblajes en forma de barra larga de βCD-arg-cpx también contribuyen a un desensamblaje más lento y brindan control de liberación. En contraste con todas las plataformas asociadas a CD disponibles que se utilizan para modificar antibióticos, hasta donde sabemos, la posibilidad de usar arginina para crear un sistema de administración de fármacos antibióticos de liberación lenta a partir de βCD no se ha conferido antes.

Habiendo observado la solubilidad disminuida no convencional y la liberación lenta de antibióticos del ensamblaje βCD-arg-cpx, a continuación investigamos el efecto del complejo en las pruebas de toxicidad y eficacia antimicrobiana. En primer lugar, se investigaron la susceptibilidad y las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de los complejos βCD-arg-cpx y βCD-cpx y sus componentes precursores, βCD, βCD-arg y cpx, frente a varias cepas bacterianas, incluida la E. coli gramnegativa. MG1655 (ATCC 47076) y P. aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) y S. aureus Rosenbach grampositivo (ATCC 12600), como se resume en la Tabla 1. Ninguna de las cepas bacterianas investigadas mostró susceptibilidad a βCD o βCD-arg. Para βCD-cpx, encontramos valores de MIC de 0.056 μM para E. coli y 0.21 μM para P. aeruginosa y S. aureus (Tabla 1). Si tenemos en cuenta el 19 % en peso de contenido de cpx en βCD-cpx y hasta un 70 % de liberación de fármaco durante una incubación de 24 h a 37 °C (Fig. 5b), las CIM corresponden a 0,0074 μM y 0,028 μM de fármaco libre. equivalentes En relación con la referencia cpx, el complejo de inclusión βCD-cpx proporcionó aumentos de aproximadamente 28 veces en la actividad antimicrobiana para todas las cepas bacterianas analizadas. La eficacia antibacteriana de βCD-arg-cpx fue superior a la de los demás con CIM de 0,0045 μM para E. coli, 0,018 μM para P. aeruginosa y 0,060 μM para S. aureus. Con un contenido de cpx del 58 % en peso y hasta un 30 % de liberación de fármaco (Fig. 5b), la MIC fue equivalente a 0,0008 μM, 0,003 μM y 0,010 μM de equivalentes libres de cpx, respectivamente. En consecuencia, en comparación con la referencia cpx, βCD-arg-cpx tenía una actividad antimicrobiana aumentada 260 veces, 260 veces y 78 veces para las cepas bacterianas analizadas, respectivamente.

La citotoxicidad en células de mamífero se evaluó usando células epiteliales de pulmón (A549) (Tabla 1 y Fig. 6a). El complejo βCD-arg-cpx se caracterizó como no tóxico (con un alto valor de CC50 de 2000 μg/ml (1220 μM)). Solo las dosis de alta concentración (> 1000 μg / ml (610 μM)) de βCD-arg-cpx mostraron una reducción dependiente de la dosis en la viabilidad celular (Fig. 6b), que correspondía a CIM aproximadamente 100 000–800 000 veces más altas. La complejación de cpx a βCD disminuye la toxicidad (Tabla 1). Además, es importante señalar que el índice de selectividad (SI) aumentó en las diferentes pruebas bacterianas en comparación con el cpx soluble (13 veces para E. coli, 17 veces para P. aeruginosa y 42 veces para S. aureus) ( Tabla 1). En otras palabras, mientras que las concentraciones nanomolares exhibieron una actividad antimicrobiana eficiente, las concentraciones milimolares fueron necesarias para los efectos tóxicos, presentando una amplia ventana terapéutica para la aplicación segura del complejo y aumentando la posible eficacia in vivo en comparación con las cpx comerciales solubles.

Citotoxicidad de βCD-arg-cpx y sus componentes para las células A549 epiteliales de pulmón (a). El gráfico muestra el porcentaje de viabilidad de las células A549 después de la incubación con diferentes concentraciones de complejos βCD (0 mg/ml (negro), 0,5 mg/ml (estampado), 1 mg/ml (gris claro), 1,5 mg/ml (gris oscuro ) y 2 mg/ml (borde negro). Se usó DMSO como control positivo para la toxicidad, mientras que las monocapas de A549 no tratadas se usaron como control negativo para la citotoxicidad; n = 3; las barras de error se refieren a la DE de viabilidad en relación con las no tratadas Comparación del crecimiento de PAO1 de P. aeruginosa (blanco) en presencia de βCD-arg-cpx (0,03 μg/ml o 0,020 μM) (púrpura), βCD-NaOH-cpx (0,2 μg/ml o 0,132 μM) (verde ), βCD-cpx (0,2 μg/ml o 0,140 μM) (azul), βCD-arg (0,03 μg/ml o 0,0023 μM) (naranja) y βCD (0,03 μg/ml o 0,0026 μM) (rosa) (b) ; n = 3; las barras de error se refieren a la densidad óptica SD.

Luego investigamos la actividad antimicrobiana analizando los valores de MIC y la cinética en el crecimiento bacteriano, como se presenta en la Fig. 6b para el caso de P. aeruginosa. En la figura complementaria 6 se presentan más detalles sobre la prueba de microdilución realizada para los complejos βCD-arg-cpx y βCD-cpx, los componentes auxiliares CD-arg y CD, así como la comparación directa del fármaco βCD-arg-cpx con cpx libre. los componentes complejos, βCD y βCD-arg no alteraron el crecimiento bacteriano. Por otro lado, a 0,2 μg/ml, tanto βCD-cpx como βCD-NaOH-cpx (como versión βCD-cpx obtenida en medio alcalino) (con concentraciones molares de 0,140 μM y 0,132 μM, respectivamente) retardaron el crecimiento bacteriano con clara acción bacteriostática. efectos, mientras que βCD-arg-cpx permitió efectos bactericidas a 0,03 μg/ml (0,018 μM). Estos resultados proporcionaron una clara evidencia de que la mejora en la actividad antimicrobiana de βCD-arg-cpx no es una consecuencia del pH al que se forma el complejo (aunque βCD-NaOH y βCD-arg-cpx tienen estructuras similares). Además, refleja directamente el papel especial de la arginina como enlazador. La disminución de MIC entre el complejo de inclusión βCD-cpx menos estable clásico y el ensamblaje βCD-arg-cpx más estable puede ser una consecuencia de cómo se liberan y desensamblan. Debido a las débiles interacciones entre los antibióticos y la βCD en el complejo de inclusión, cuando se disuelven, el complejo se descompone, lo que permite la liberación del fármaco libre. Por otro lado, cuando la arginina conecta βCD y cpx, las fuerzas de unión son más fuertes, y el desensamblaje de las estructuras en forma de varilla da como resultado una liberación gradual de cpx libre y también de cpx-arg como una forma de fármaco más activa.

En un contexto morfológico, después del tratamiento con cpx y βCD-arg-cpx de bacterias gramnegativas (E. coli y P. aeruginosa), observamos filamentación bacteriana (Figs. 7 y 8, respectivamente). Esta fue una evidencia de que el mecanismo antibacteriano primario de cpx no cambió, y también se observó cuando el fármaco estaba dentro del ensamblaje del complejo βCD-arg-cpx. Es bien sabido que Cpx afecta la replicación del ADN al actuar sobre la ADN girasa, que inhibe la división celular bacteriana30,31. Bajo estrés inducido por antibióticos, las bacterias que detienen la división celular continúan su crecimiento inhibiendo la tabicación celular, aumentando su longitud y formando filamentos largos32. Dependiendo de las condiciones de estrés, las bacterias dentro de los filamentos pueden sobrevivir o morir30. Si las unidades celulares individuales conectadas dentro de un filamento siguen siendo viables y forman largas cadenas multicelulares, se produce un alivio del estrés en la cepa resistente a los antibióticos en evolución31. En ese contexto, las concentraciones subinhibitorias de cpx inducen la filamentación de bacterias en forma de bastón como un paso de transición hacia su evolución hacia cepas resistentes a cpx32. Después del tratamiento con concentraciones de cpx subinhibitorias muy bajas, 0,003 μg/ml (0,008 μM) en E. coli y 0,03 μg/ml (0,08 μM) en P. aeruginosa, observamos una filamentación muy intensa y larga en E. coli (Fig. 7b, e, h) (compárese con la referencia no tratada (Fig. 7a, d, g), mientras que P. aeruginosa mostró solo elongación celular con pocos casos de filamentos muy largos (Fig. 8b, e, h) (que fue no detectado en la referencia (Fig. 8a, d, g)). Los tabiques de división conectados, observados en imágenes SEM, resultaron de la inhibición bacteriana de la división celular. Solo algunas células filamentosas estaban muertas, como lo revela la tinción viva/muerta, mientras que la mayoría permaneció vivo y sobrevivió al estrés inducido por la baja concentración de cpx (Figs. 7e, 8e).La membrana celular bacteriana permaneció intacta (como se muestra al teñir con FM464 solo en la superficie) y mostró claramente varios nucleosomas a lo largo de los filamentos (teñidos con DAPI) (Figs. 7h, 8h) También observamos bacterias de tamaño normal conectadas a los extremos de los filamentos (Fig. 7h), lo que indica depuración y la posible formación de cepas resistentes a los antibióticos.

Morfología y superficie de las células de E. coli antes (a) y después de la exposición a una concentración baja de cpx (0,003 μg/ml o 0,008 μM) (b) y equivalente de cpx en βCD-arg-cpx (0,003 μg/ml o 0,002 μM) (C); E. coli viva teñida con tintes vivos/muertos (d) y fracción de células de E. coli viables tratadas con 0,003 μg/ml (0,008 μM) cpx (e) y βCD-arg-cpx (0,002 μM) (f). Estructura de membrana de E. coli de tipo salvaje teñida con colorantes FM464/DAPI (g) y bacterias tratadas con 0,003 μg/ml cpx puro (0,008 μM) (h) y complejo CD-arg-cpx (0,002 μM) (i).

Morfología y superficie de las células PAO1 antes (a) y después de la exposición a una concentración baja de cpx (0,03 μg/ml o 0,08 μM) (b) y cpx equivalente en βCD-arg-cpx (0,03 μg/ml o 0,02 μM) (c) . Live P. aeruginosa PAO1 teñido con colorantes Live/Dead (d) y fracción de células viables tratadas con 0,03 μg/ml cpx (0,08 μM) (e) y βCD-arg-cpx (0,02 μM) (f). Estructura de la membrana de P. aeruginosa PAO1 de tipo salvaje teñida con colorantes FM464/DAPI (g) y bacterias tratadas con 0,03 μg/ml cpx puro (0,08 μM) (h) y complejo βCD-arg-cpx (0,02 μM) (i) .

Se observó una situación completamente diferente al tratar a las mismas concentraciones del complejo βCD-arg-cpx utilizado para cpx soluble (Figs. 7, 8). En E. coli, una concentración muy baja de cpx (0,003 μg/ml (0,002 μM) del complejo βCD-arg-cpx detuvo de forma efectiva el crecimiento bacteriano y disminuyó el número de células filamentosas (Fig. 7c). Los filamentos contenían membranas celulares intactas y entidades multinucleosomales (Fig. 7i). Lo que es más importante, se confirmó que todas las bacterias detectadas, de tamaño normal y filamentosas, estaban muertas (Fig. 7f). Se obtuvo un resultado similar para P. aeruginosa expuesta a una concentración baja de cpx (0.03 μg/ml (0.02 μM)) del complejo βCD-arg-cpx. Aunque el número de filamentos formados aumentó, una mirada más cercana a su superficie reveló un fuerte daño, mientras que su entorno mostró muchos fragmentos celulares que quedaron después de la descomposición (Fig. 8c) Se detectó una descomposición similar de P. aeruginosa después de la exposición a una dosis alta de cpx (0,2 μg/ml (0,52 μM), lo que resultó en una mayor formación de vesículas de membrana inducida por un mecanismo de lisis celular explosivo30. Como se observó en E. coli, todos los filamentos de P. aeruginosa estaban muertos (Fig. 8f). FM646/DAPI reveló su estructura multinuclear y la deformación de la membrana en vesículas (Fig. 8i). La deformación de la membrana, la formación de vesículas y el daño celular por lisis celular explosiva fueron progresivos y dependieron de la concentración del complejo βCD-arg-cpx (Fig. 7 complementaria). A concentraciones más bajas (0,03 μg/ml (0,02 μM), se detectaron filamentos y células de tamaño normal. Todas tenían paredes celulares dañadas que contenían pequeños orificios y se descompusieron parcialmente en vesículas (200 nm de tamaño). arg-cpx (0,1 μg/ml (0,06 μM)), ya no se detectaron filamentos y todas las células restantes de tamaño normal se lisaron por completo en fragmentos de pared celular similares a vesículas de aproximadamente 100 nm de tamaño. Se indicó daño celular progresivo. su respuesta al estrés creciente inducido por el cpx cargado en el complejo Cambios similares que incluyen deformaciones intensas en la membrana, daño a la estructura de las células y, finalmente, actividad antimicrobiana cuando el complejo βCD-arg-cpx se usó en concentraciones mucho más bajas. que el fármaco cpx libre también se observaron para S. aureus, una cepa grampositiva (Fig. 8 complementaria).

La toxicidad y la eficacia in vivo del complejo βCD-arg-cpx se investigaron en gusanos Galleria mellonella (Fig. 9) como un modelo animal previamente optimizado para evaluar la eficacia antibacteriana y la toxicología33,34. Se investigó la toxicidad a altas concentraciones del complejo (hasta 2421 mg/kg) y se observó un 100 % de supervivencia para todas las concentraciones investigadas. Para el estudio de eficacia antibacteriana, los gusanos fueron preinfectados con P. aeruginosa PAO135. Sin ningún tratamiento se obtuvo el 100% de muerte a las 24 h. El tratamiento posterior a la infección con βCD-arg-cpx en concentraciones de 5 mg/kg (3,3 mM) y 10 mg/kg (6,6 M) dio como resultado una supervivencia del 100 %. Como referencia, el tratamiento con 5 mg/ml (13,3 mM) de cpx libre dio como resultado solo un 20 % de supervivencia. La mejor eficacia del tratamiento con el complejo βCD-arg-cpx en comparación con el fármaco libre se ve respaldada por el hecho de que el complejo contiene solo un 58 % en peso de cpx, que se libera lentamente de las estructuras ensambladas (como se muestra en la Fig. 5) .

Toxicidad del complejo βCD-arg-cpx que muestra una supervivencia larvaria muy alta para todo el rango de concentración probado (hasta 2421 mg/kg) (a). Estudio comparativo de eficacia antibacteriana en larvas infectadas con PAO1 (azul oscuro) y tratadas con el complejo βCD-arg-cpx (verde claro y marrón) y fármaco cpx libre (verde oscuro y morado) (contenido cpx equivalente de 5 y 10 mg cpx/ kg de larva, respectivamente) que muestra una mayor supervivencia de los gusanos preinfectados después del tratamiento con el complejo (b). Asteriscos: diferencias estadísticamente significativas frente al control PAO1 de P. aeruginosa en una prueba de rango logarítmico (**valor de p < 0,01); n = 5. Esta figura representa el mismo experimento repetido varias veces, que arrojó resultados idénticos cada vez.

El mecanismo subyacente básico de la acción antimicrobiana en el fármaco complejado βCD-arg-cpx ensamblado sigue siendo el mismo que el de su fármaco de forma libre. El complejo βCD-arg-cpx tiene la misma capacidad para inhibir el progreso de la división celular que normalmente se obtiene con cpx libre, así como para inducir cambios similares relacionados con el estrés en las bacterias, como la filamentación y la lisis explosiva impulsada por la formación de vesículas de membrana. Aunque estas dos formas de fármaco utilizan el mismo mecanismo de acción, es evidente una diferencia en su eficacia y podría atribuirse a una diferencia en su biodisponibilidad. La presencia del componente βCD, con la capacidad conocida de aumentar las interacciones con los componentes de la pared celular12, ciertamente promueve la transferencia de fármacos a través de las membranas y, en consecuencia, aumenta la eficacia antimicrobiana en las concentraciones disponibles dentro de la célula bacteriana. Sin embargo, como se ha visto después de la comparación directa de la inclusión βCD-arg menos estable y los complejos βCD-arg-cpx más estables, el efecto no puede atribuirse únicamente a la presencia de βCD. Debido a la naturaleza reversible de la unión en los complejos de inclusión, la solubilización proporciona la forma de fármaco libre en equilibrio con las moléculas de βCD. Este tipo de equilibrio mejora la transferencia del fármaco a través de la membrana, pero es mucho menos eficaz en forma de complejo βCD-arg-cpx más estable. βCD-arg-cpx más estable, en el que βCD y cpx están unidos a través de un conector de arginina, permite que βCD actúe como un componente de construcción de la molécula del fármaco. Junto con la βCD, la transferencia del fármaco a través de la membrana también se ve afectada por la presencia de arginina y su unión a la molécula del fármaco.

En consecuencia, la cpx complejada se transfirió de manera más efectiva a su objetivo (la ADN girasa) y pudo inducir el mismo nivel de estrés que concentraciones mucho más altas de cpx libre. Si las concentraciones del complejo eran lo suficientemente altas (mucho más bajas que las concentraciones efectivas del fármaco libre), las interacciones de la βCD y la arginina unidas al fármaco con los componentes de la pared bacteriana eran suficientes para desintegrar la estructura celular bacteriana e inducir un proceso de lisis explosivo. Todos estos hechos indican que el estrés inducido a concentraciones muy bajas de βCD-arg-cpx permite una mejora importante en la actividad antimicrobiana. Las investigaciones detalladas del potencial de la forma de fármaco complejado para prevenir los procesos evolutivos adaptativos que producen cepas resistentes siguen siendo un desafío interesante para el futuro.

Este tipo innovador de complejos βCD, en los que se utilizan enlazadores para hacer conexiones más estables entre βCD y un fármaco, tiene potencial para mejorar la eficacia de los antibióticos previamente aprobados y utilizados clínicamente. Producidos utilizando una química muy simple, tecnológicamente no exigente y altamente económica, estos complejos podrían ser herramientas muy prometedoras para reutilizar, volver a perfilar o reutilizar diferentes medicamentos. La investigación futura en esta área debe centrarse en explorar todas las posibilidades disponibles introducidas al mejorar la biodisponibilidad de los fármacos dentro de este tipo de complejo, incluida su capacidad para desarrollar y afectar cepas resistentes a los antibióticos, mitigar la toxicidad de los fármacos y mejorar la biocompatibilidad. Dichos complejos pueden ofrecer opciones adicionales en la tubería de antibióticos y alentar a la industria farmacéutica a explorar formas más efectivas de antibióticos antiguos y a participar activamente en la resolución de la falta global de antibióticos efectivos como un problema de salud persistente y muy grave en la era moderna.

El complejo se formó utilizando L-arginina (arg, ácido L-2-amino-5-guanidinopentanoico, C16H14N4O2, Sigma–Aldrich, Alemania), clorhidrato de ciprofloxacina (cpx, Cayman Chemical Company) y β-ciclodextrina (βCD, Sigma– Aldrich C4805, Alemania). Todos los químicos y reactivos utilizados fueron de grado analítico. Todos los experimentos se realizaron con agua ultradestilada producida en laboratorio.

Antes de formar el complejo, se disolvieron en agua arginina (50 ml, 0,4 mg/ml) y ciclodextrina (50 ml, 2 mg/ml) con agitación continua (200 rpm) durante 15 ha temperatura ambiente. Las soluciones premezcladas se añadieron a una solución acuosa de ciprofloxacina (0,8 mg/ml) y se continuó agitando (200 rpm) durante las siguientes 24 h. El precipitado blanco apareció 2 h después de la adición de ciprofloxacino. Después de 24 h de mezclado, el sobrenadante se separó por centrifugación (8000 rpm) y el precipitado se redispersó en 5 ml de agua destilada. La dispersión se congeló en hielo seco (durante 3 h) y se liofilizó (24 h, Christ Alpha 1–4, Martin Christ). Las muestras de control se formaron siguiendo el mismo protocolo pero reemplazando la arginina con una solución acuosa de NaOH para formar βCD-NaOH-cpx y reemplazando la arginina con agua destilada para formar βCD-cpx. Debido a la falta de precipitación en las muestras de control, el volumen total de la mezcla se congeló y liofilizó. Todos los polvos se mantuvieron en recipientes de vidrio cubiertos y se almacenaron en condiciones ambientales para realizar más pruebas.

Los análisis de difracción de rayos X en polvo (pXRD) se realizaron en el rango de 2 a 70° 2Θ con un tamaño de paso de 0,02° y un registro de 2 s por paso utilizando un difractómetro Bruker AXS D4 Endeavor. Las investigaciones espectroscópicas infrarrojas por transformada de Fourier (FTIR) se realizaron con un espectrofotómetro Perkin Elmer Spectrum 400 MIR utilizando la técnica DRIFT. Los espectros se registraron en polvos obtenidos al mezclar 5 mg de muestras con 80 mg de KBr. La espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS) se realizó con el Versaprobe 3 AD (Phi, Chanhassen, EE. UU.) utilizando una fuente de rayos X monocromática Al-Kα. Para cada medición, los espectros se adquirieron en un tamaño de punto de 200 µm con el neutralizador de carga encendido, ya que los gránulos se colocaron en una cinta doble no conductora. Los espectros de la encuesta se midieron con una energía de paso de 280 eV y un paso de 1 eV, mientras que los espectros de alta resolución se midieron con una energía de paso de 27 eV y un paso de 0,025 eV. Se utilizó la neutralización de carga, por lo que la escala de energía de los espectros XPS se corrigió cambiando el pico de carbono C1s a una energía de enlace de 284,8 eV. Los datos de XPS se analizaron con el software PHI Multipak. Con el fin de eliminar la capa superficial del sedimento para examinar la superficie subyacente, se usó la pulverización catódica de la muestra con grupos de argón. La muestra se bombardeó durante 1 min a 5 kV y 20 nA en un área de 2 × 2 mm, seguido de un análisis puntual de alta resolución de 200 µm. Los productos de disolución se identificaron mediante espectrometría de masas. Las mediciones se realizaron utilizando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de aceleración ortogonal híbrido Q-Tof PremierTM (Waters-Micromass, Manchester, Reino Unido) equipado con fuentes de ionización a presión atmosférica (API) y acoplado con un cromatógrafo líquido de ultra rendimiento (TOF MS/ UpLC). La detección se realizó a través de una fuente de ionización por electropulverización (ESI) en modo positivo. Para microscopía electrónica de barrido morfológico (SEM, Nova NanoSEM), los polvos se dispersaron en agua y se depositaron en membranas de filtro de 50 nm pegadas en cinta de carbón y recubiertas con carbón de 5 nm. Se realizaron análisis de microscopía electrónica de transmisión estructural (TEM, Tecnai Spirit 120 kV) en muestras dispersas en agua y depositadas en rejillas de cobre. Las imágenes STEM se tomaron con un microscopio electrónico de barrido (SEM) Verios 4 G HP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) en modo STEM. Para el mapeo de EDS se utilizó el sistema de espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDXS) con detector Ultim Max 65 y software AZtec (Oxford Instruments Abingdon, Reino Unido). Las imágenes de fluorescencia se realizaron en polvos dispersos en agua que se dejaron caer sobre portaobjetos de microscopio usando un microscopio de fluorescencia invertido Nikon ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) acoplado con una cámara Nikon DS-Qi2. Los potenciales zeta se midieron usando un Mavern Nanosizer.

Las pruebas antibacterianas se realizaron con Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) y Staphylococcus aureus Rosenbach (ATCC 12600). Las cepas se cultivaron durante la noche a 37 °C en medio de crecimiento líquido (Luria Bertani, LB) (Scharlab, España) para E. coli y P. aeruginosa y caldo de soja tríptico (TSB) (Scharlab, España) para S. aureus. Las muestras bacterianas se dispersaron ultrasónicamente en medio de cultivo durante 30 s (A = 18 %, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) para formar stocks de 2 mg/ml, que se diluyeron aún más a las concentraciones probadas. Se inocularon pocillos de placas de microtitulación (placa de ensayo de 96 pocillos, poliestireno tratado con cultivo tisular; Costar 3595, Corning Inc., Corning, NY) con 100 μl de bacterias (OD550 = 0,05) y 100 μl de las diluciones en serie específicas de los muestras Los controles incluyeron medio de crecimiento y bacterias sin tratamiento. La incubación se realizó en un lector de microplacas multimodo Infinite M200 Pro (Tecan) a 37 °C durante 14 h con agitación orbital continua. El crecimiento bacteriano se evaluó midiendo la densidad óptica a 550 nm cada 15 min. Todas las concentraciones se probaron repetidamente en tres repeticiones (n = 3).

Para evaluar la viabilidad bacteriana, las muestras analizadas se dispersaron en medio de cultivo LB o TSB durante 30 s (A = 18 %, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) y se mezclaron con bacterias hasta un volumen final de 1 ml. (DO550 = 0,3). Después de 12 h de incubación, se centrifugaron 100 μl durante 5 min a 6000 rpm y se reemplazó el sobrenadante con 25 μl de prueba de viabilidad bacteriana Live/Dead BacLight (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) que contenía SYTO9 y yoduro de propidio (PI) en 1X. Solución salina tamponada con fosfato (PBS) en una proporción de 1:1 y una concentración de 3 × 10−6 mg/ml. Fue seguido por una incubación de 15 min en la oscuridad para teñir las bacterias. Las bacterias fluorescentes se visualizaron mediante un microscopio de fluorescencia invertido Nikon ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) acoplado con una cámara Nikon DS-Qi2 (Nikon).

Para evaluar la integridad de la membrana, las muestras analizadas se dispersaron en medio de cultivo LB o TSB durante 30 s (A = 18 %, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) y se mezclaron con bacterias hasta un volumen final de 1 ml. (DO550 = 0,3). Después de 12 h de incubación, se centrifugaron 100 μl durante 5 min a 6000 rpm y se reemplazó el sobrenadante con 50 μl de FM 464 (N-(3-trietilamonio propil)-4-(6-(4-(dietilamino)fenilo dibromuro de )hexatrienil)piridinio, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)/DAPI (diamidino-2-fenilindol (DAPI; Biotium, Fremont, CA) en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) (que contiene 0,4 μl de 5 mg ml-1 FM 464 y 1 μl de 125x DAPI) Las muestras se tiñeron durante 15 min en hielo, se protegieron de la luz y posteriormente se analizaron con un microscopio fluorescente Nikon ECLIPSE Ti-S/L100.

Los análisis morfológicos de las células bacterianas afectadas por el complejo investigado se realizaron utilizando FEISEM (Nova NanoSEM). Cien microlitros de bacterias incubadas con el complejo durante 12 h se centrifugaron durante 5 min a 6000 rpm y se fijaron después de reemplazar el medio de crecimiento con 50 μl de glutaraldehído (3% en peso). El paso de fijación se realizó durante 3 horas a temperatura ambiente. Las bacterias fijadas se depositaron en membranas porosas mediante filtración bajo vacío suave, se lavaron tres veces con PBS (durante 15 min para cada lavado) y se deshidrataron en etanol diluido en serie (30, 50, 70, 90 y 100 % en peso, 30 min a cada concentración). Las muestras se secaron en los puntos críticos.

Las pruebas se realizaron en células A549 epiteliales de pulmón humano (ATCC® CCL-185™). Las células se cultivaron en DMEM/F-12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific) suplementado con penicilina-estreptomicina al 1 % (v/v) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) y suero fetal bovino descomplementado al 10 % (v/v) (Gibco, Thermo Fisher Scientific) y cultivadas en una incubadora humidificada (Memmert) a 37 °C y 5 % (v/v) de CO2. El complejo analizado se dispersó ultrasónicamente en DMEM durante 30 s (A = 18 %, W = 250 W, encendido: apagado = 2:1 s) para formar una solución madre (2 mg/ml). Las células que crecieron hasta la confluencia en una placa de 96 pocillos se trataron con diluciones en serie del complejo y se incubaron a 37 °C en CO2 al 5 % durante 24 h. El ensayo de citotoxicidad se realizó agregando 20 μl de 10 reactivos de viabilidad celular Presto blueTM (Molecular Probes, Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific) por pocillo, incubando durante 30 min y registrando la fluorescencia con excitación λ = 560 nm y emisión λ = 590 nm. . Las referencias incluyeron el complejo sin células en DMEM, el tinte puro en DMEM, células sin complejo (como control negativo) y células con DMSO (como control positivo). Todas las concentraciones se probaron repetidamente por triplicado (n = 3). La viabilidad se ha normalizado a las células sin tratamiento (% de viabilidad al control negativo).

Las larvas de Galleria mellonella, utilizadas como modelo in vivo35, se cultivaron a 34 °C hasta alcanzar un peso de 200-250 mg. El complejo investigado se dispersó en PBS durante el estudio de toxicidad mediante ultrasonidos (30 s, A = 18 %, W = 250 W, encendido:apagado = 2:1 s) para formar una solución madre de 5 mg/ml. Se inyectó un inóculo de 10 μl de la dispersión compleja (en diferentes concentraciones) en el área de la propata superior derecha de las larvas utilizando una jeringa de calibre 22 de Hamilton. Cada concentración del complejo se inyectó en cinco larvas por grupo de prueba (n = 5). El grupo de control se inoculó con 10 μl de 1x PBS (Fisher Scientific) de la misma manera. Después de la inoculación, las larvas se mantuvieron a 37 °C hasta por 72 h. La mortalidad de las larvas se observó cada 16-24 h. La prueba se hizo repetidamente. Las curvas de supervivencia se trazaron utilizando el análisis de Kaplan-Meier y las diferencias estadísticamente significativas se determinaron mediante la prueba de rango logarítmico unilateral (software GraphPad 9.0).

Durante el estudio de eficacia, se preinyectaron larvas de G. mellonella con 10 μl de una dosis infectiva de P. aeruginosa (PAO1) (6,4 × 103 ufc/ml) en el área superior derecha de la propierna. Una hora después de la infección, se inyectó en la propata superior izquierda un inóculo de 10 μl que contenía diferentes concentraciones del complejo analizado disperso en PBS. El siguiente procedimiento fue el mismo que para el estudio de toxicidad. Los controles fueron larvas inyectadas con PBS 1x (control negativo) y larvas inyectadas con ciprofloxacina (sin complejo) a 10 mg/kg (control positivo). Cada grupo probado contenía cinco larvas (n = 5).

Los experimentos se realizaron al menos por triplicado y se repitieron 2 o 3 veces (depende del experimento). Los resultados se presentan como valor medio ± SD. Las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de rango logarítmico unilateral (Software GraphPad 9.0).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Los archivos fuente detrás de las Figs. 2, 4, 5, 6 y 9 se presentan en los archivos de datos complementarios 1 a 5, respectivamente. Los archivos fuente detrás de las figuras complementarias. 1–4 y 6 se proporcionan en los archivos de datos complementarios 6–10, respectivamente.

El mundo se está quedando sin antibióticos, confirma el informe de la OMS, Informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) https://www.who.int/news/item/20-09-2017-the-world-is-running-out-of -antibióticos-quien-reporta-confirma (2019).

Plackett, B. No hay dinero para nuevos medicamentos. Naturaleza 586, S50–S53 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Farha, MA & Brown, ED Reutilización de fármacos para el descubrimiento de antimicrobianos. Nat. Microbiol. 4, 565–577 (2019).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Guy, RK, DiPaola, RS, Romanelli, F. & Dutch, RE Reutilización rápida de medicamentos para COVID-19. Ciencia 368, 829–830 (2020).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Zhou, Y., Wang, F., Tang, J., Nussinov, R. y Cheng, F. Inteligencia artificial en la reutilización de fármacos para la COVID-19. Dígito de lanceta. Salud 2, e667–e676 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Talevi, A. & Bellera, CL Desafíos y oportunidades con la reutilización de medicamentos: encontrar estrategias para encontrar usos alternativos de la terapéutica. Opinión de experto. Descubrimiento de drogas 15, 397–401 (2020).

Artículo PubMed Google Académico

Agrawal, P. Ventajas y desafíos en el reperfilado de fármacos. Farmacovigilia S2, e002 (2015).

Google Académico

Naylor, S., Kauppi, DM & Schonfeld, JP Reutilización, reposicionamiento y rescate de fármacos terapéuticos, parte II: descripción general. Descubrimiento de drogas Mundo 16, 57–72 (2015).

Google Académico

Brown, D. Rompedores de resistencia a los antibióticos: ¿pueden los medicamentos reutilizados llenar el vacío de descubrimiento de antibióticos? Nat. Rev. 14, 821–832 (2015).

CAS Google Académico

Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A. y Karlén, A. La tubería antibacteriana preclínica global. Nat. Rev. 18, 275–285 (2020).

Google Académico

Wong, CE, Dolzhenko, AV, Lee, SM & Young, DJ Ciclodextrinas: un arma en la lucha contra la resistencia a los antimicrobianos. J. Molec. Ing. Mate. 5, 1740006 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Saokham, P., Muankaew, C., Jansook, P. & Loftsson, T. Solubilidad de ciclodextrinas y complejos de fármaco/ciclodextrina. Moléculas 23, 1161 (2018).

Artículo PubMed Central Google Académico

Uekama, K., Hirayama, F. e Irie, T. Sistemas transportadores de fármacos con ciclodextrina. química Rev. 98, 2045–2076 (1998).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Nardello-Rataj, V. & Leclercq, L. Encapsulación de biocidas por ciclodextrinas: hacia efectos sinérgicos contra patógenos. Beilstein J. Org. química 10, 2603–2622 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Redenti, E., Szente, L. & Szejtli, J. Complejos de ciclodextrina de sales de fármacos ácidos. Propiedades termodinámicas, características estructurales y aplicaciones farmacéuticas. J. Pharm. ciencia 90, 979–986 (2001).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Mura, P. et al. Caracterización del estado sólido y propiedades de disolución del sistema ternario naproxeno-arginina-hidroxipropil-b-ciclodextrina. EUR. J. Pharm. Biofarmacia 59, 99–106 (2005).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Sherje, AP, Patel, F., Murahari, M., Suvarna, V. & Patel, K. Estudio sobre el efecto de la L-arginina en la solubilidad y disolución de Zaltoprofeno: preparación y caracterización de complejos de inclusión de ciclodextrina binarios y ternarios. química física Letón. 694, 120–128 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Mennini, N., Maestrelli, F., Cirri, M. & Mura, P. Análisis de las propiedades fisicoquímicas de los sistemas ternarios de oxaprozina con ß-ciclodextrina metilada aleatoriamente y L-arginina con el objetivo de mejorar la solubilidad del fármaco. J. Pharm. biomedicina Anal. 129, 350–358 (2016).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Sapte, S. & Pore, Y. Complejos de inclusión de cefuroximeaxetilo con β-ciclodextrina: caracterización fisicoquímica, modelado molecular y efecto de la L-arginina en la formación de complejos. J. Pharm. Anal. 6, 300–306 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Rincón-Ortiz, SA, Botero, MA & Ospina, R. Caracterización XPS de comprimidos de ciprofloxacino. Navegar. ciencia Espectros 29, 014020 (2022).

Artículo Google Académico

Al-Omar, MA Ciprofloxacina: perfil físico. Perfiles Droga Subst. excl. 31, 163–178 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Sambasevam, KP, Mohamad, S., Sarih, NM & Ismail, NA Síntesis y caracterización del complejo de inclusión de β-ciclodextrina y azometina. En t. J. Mol. ciencia 14, 3671–3682 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Kacso, I., Borodi, G., Fărcaş, SI & Bratu, I. Compuesto de inclusión de vitamina B13 en β-ciclodextrina. investigaciones estructurales. J. Phys.: Conf. Ser. 182, 012009 (2009).

Google Académico

Sosa, LV et al. La estructura, la dinámica molecular y la energía del complejo Centrin-Melittin. Proteínas 79, 3132–3143 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Bhongade, B., Talath, S. y Dhaneshwar, S. Un método validado para la cuantificación de clorhidrato de ciprofloxacina mediante espectroscopia de transformada de Fourier infrarroja de reflectancia difusa. En t. J. Spectrosc. DNI 2014, 294612 (2014).

Google Académico

Mesallati, H., Umerska, A., Paluch, KJ y Tajber, L. Sales de fármacos poliméricos amorfos como formas de dispersión sólida iónica de ciprofloxacina. mol. Farmacéutica 14, 2209–2223 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Xie, S. et al. Diseño y síntesis de nanofármacos antibióticos teranósticos que muestran actividad antibacteriana mejorada y luminiscencia. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 114, 8464–8469 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Neves, MAC, Yeager, M. & Abagyan, R. Formaciones inusuales de arginina en la función y ensamblaje de proteínas: anillos, cuerdas y pilas. J. física. química B 116, 7006–7013 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Zhang, F., Gu, S., Ding, Y., Zhang, Z. y Li, L. Un nuevo sensor basado en la electropolimerización de β-ciclodextrina y l-arginina en electrodo de pasta de carbono para la determinación de fluoroquinolonas. Anal. química Acta 770, 53–61 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Hooper, DC Mecanismos de resistencia a las fluoroquinolonas. Resistencia a las drogas. Actualizar 2, 38–55 (1999).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Bos, J. et al. Aparición de resistencia a los antibióticos a partir de filamentos bacterianos multinucleados. PNAS 112, 178–183 (2015).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Turnbull, L. et al. La lisis celular explosiva como mecanismo para la biogénesis de vesículas de membrana bacteriana y biopelículas. Nat. Com. 7, 11220 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Moya-Andérico, L. et al. Utilidad de las larvas de Galleria mellonella para evaluar la toxicología de nanopartículas. Chemosphere 266, 129235 (2021).

Artículo PubMed Google Académico

Blanco-Cabra, N. et al. Nuevos derivados del ácido oleanólico y maslínico como un tratamiento prometedor contra el biofilm bacteriano en infecciones nosocomiales: un estudio in vitro e in vivo. ACS Infectar. Dis. 5, 1581–1589 (2019).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Moya-Andérico, L., Admella, J., Fernandes, R. & Torrents, E. Monitorización de la expresión génica durante una infección bacteriana por Galleria mellonella. Microorganismos 8, 1798 (2020).

Artículo PubMed Central Google Académico

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Los autores agradecen a Angel Blanco Blanes y al Dr. Samuel Sanchez del grupo Smart Nano-Bio-Devices del Instituto de Bioingeniería de Cataluña por las mediciones del potencial zeta, así como al Dr. Dušan Žigon del Centro de Espectrometría de Masas del Instituto Jozef Stefan por Análisis ToF MS. La Comisión Europea ha financiado este trabajo bajo el esquema COFUND de Acciones Marie Skłodowska-Curie de Horizonte 2020 (Convenio de subvención n.º 712754) y por el programa Severo Ochoa del Ministerio de Ciencia y Competitividad de España (Subvención SEV-2014-0425 (2015-2019) ). ET contó con el apoyo de subvenciones del Ministerio de Economía y Competitividad de España (MINECO/FEDER) (RTI2018-098573-B-100), la Generalitat de Catalunya (2017SGR-1079 y programa CERCA), las asociaciones catalanas de Fibrosis Quística y la Fundación La Caixa . Se ha proporcionado apoyo financiero adicional a MV mediante subvenciones de la Agencia de Investigación de Eslovenia (ARRS) (subvenciones J2-8169, N2-0150 y P2-0091).

Departamento de Materiales Avanzados, Instituto Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Eslovenia

Marija Vukomanovic, Lea Gazvoda, Mario Kurtjak y Blaž Jaklic

Escuela Internacional de Posgrado de Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Eslovenia

Marija Vukomanovic, Lea Gazvoda y Blaž Jaklic

Centro de Microscopía Electrónica y Microanálisis (CEMM), Instituto Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Eslovenia

Jitka Hrescak

Infecciones bacterianas: terapias antimicrobianas, Instituto de Bioingeniería de Cataluña (IBEC), Instituto de Ciencia y Tecnología, Baldiri Reixac 15-21, 08028, Barcelona, España

Laura Moya-Andérico, María del Mar Ceniza & Eduard Torrents

Sección de Microbiología, Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona, Av. Diagonal 643, 08028, Barcelona, España

Eduard Torrents

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Concepto de investigación de MV, síntesis y caracterización, redacción del primer borrador; Análisis LG XRD y FTIR, análisis MK TEM y EDS, análisis JH STEM y mapeo elemental, análisis BJ XPS, LM-A. estudio in vivo, toxicidad in vitro de CM, tutoría y financiación de ET. Todos los autores contribuyeron a la edición del texto a la versión final.

Correspondencia a Marija Vukomanovic o Eduard Torrents.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a John-Sigurd Svendsen y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Christina Karlsson Rosenthal.

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Reimpresiones y permisos

Vukomanovic, M., Gazvoda, L., Kurtjak, M. et al. Desarrollo de un complejo antimicrobiano ciclodextrina-arginina-ciprofloxacina ternario con mayor estabilidad. Commun Biol 5, 1234 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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Recibido: 12 mayo 2022

Aceptado: 31 de octubre de 2022

Publicado: 12 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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