La evolución de la resistencia a la cloroquina en Plasmodium falciparum está mediada por el supuesto transportador de aminoácidos AAT1

Nature Microbiology (2023)Citar este artículo

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Los parásitos de la malaria descomponen la hemoglobina del huésped en péptidos y aminoácidos en la vacuola digestiva para exportarlos al citoplasma del parásito para su crecimiento: la interrupción de este proceso es fundamental para el modo de acción de varios medicamentos antipalúdicos. Las mutaciones en el transportador de resistencia a la cloroquina (CQ), pfcrt, ubicado en la membrana de la vacuola digestiva, confieren resistencia a la CQ en Plasmodium falciparum y, por lo general, también afectan la aptitud del parásito. Sin embargo, el papel de otros locus de parásitos en la evolución de la resistencia a CQ no está claro. Aquí utilizamos una combinación de genómica de poblaciones, cruces genéticos y edición de genes para demostrar que un segundo transportador vacuolar desempeña un papel clave tanto en la resistencia como en la evolución compensatoria. Los análisis genómicos longitudinales de los parásitos gambianos revelaron firmas temporales de selección en una variante S258L del transportador de aminoácidos putativo (pfaat1), cuya frecuencia aumentó del 0 % al 97 % entre 1984 y 2014 en paralelo con la variante pfcrt1 K76T. Los cruces genéticos de parásitos luego identificaron un locus de rasgos cuantitativos del cromosoma 6 que contiene pfaat1 que se selecciona mediante el tratamiento con CQ. La edición de genes demostró que pfaat1 S258L potencia la resistencia a CQ, pero a costa de una aptitud física reducida, mientras que pfaat1 F313S, un polimorfismo común del sudeste asiático, reduce la resistencia a CQ y restaura la aptitud física. Nuestros análisis revelan una complejidad oculta en la evolución de la resistencia a CQ, lo que sugiere que pfaat1 puede ser la base de las diferencias regionales en la dinámica de la evolución de la resistencia y modular la resistencia o la aptitud del parásito mediante la manipulación del equilibrio entre el transporte de aminoácidos y fármacos.

La resistencia a los medicamentos en los patógenos microbianos complica los esfuerzos de control. Por lo tanto, la comprensión de la arquitectura genética y la complejidad de la evolución de la resistencia es fundamental para el seguimiento de la resistencia y el desarrollo de mejores estrategias de tratamiento. En el caso de los parásitos de la malaria, el despliegue de cinco clases de medicamentos antipalúdicos durante el último medio siglo ha dado como resultado barridos selectivos duros y blandos bien caracterizados asociados con la resistencia a los medicamentos, con una diseminación mundial y orígenes locales de resistencia que impulsan los alelos de resistencia a los medicamentos en todo el gama de Plasmodium falciparum1,2,3. La monoterapia con cloroquina (CQ) tuvo un papel central en un ambicioso plan para erradicar la malaria en el siglo pasado. La resistencia a CQ se observó por primera vez en 1957 en el sureste de Asia (SEA), y posteriormente llegó y se extendió por África a fines de la década de 1970, lo que contribuyó al final de este ambicioso esfuerzo de erradicación global4.

La resistencia a CQ se ha estudiado intensamente. El gen transportador de resistencia a CQ (pfcrt, cromosoma (chr.) 7) se identificó originalmente mediante un cruce genético de P. falciparum realizado entre un parásito SEA resistente a CQ y un parásito sudamericano sensible a CQ generado en un huésped chimpancé5,6. Veinte años de intensa investigación revelaron el papel mecánico del transportador de resistencia a la cloroquina (pfCRT) en la resistencia a los medicamentos7,8, su ubicación en la membrana de la vacuola digestiva y su función natural de transporte de péptidos cortos desde la vacuola digestiva al citoplasma9. CQ mata a los parásitos al interferir con la digestión de la hemoglobina en la vacuola digestiva, evitando la conversión del hemo, un subproducto tóxico de la digestión de la hemoglobina, en cristales inertes de hemozoína. Los parásitos que portan mutaciones de resistencia a CQ en pfCRT transportan CQ fuera de la vacuola del alimento, lejos del sitio de acción del fármaco7,8. El polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) pfcrt K76T se usa ampliamente como marcador molecular para la resistencia a CQ10, mientras que las variantes adicionales dentro de pfcrt modulan los niveles de resistencia a CQ11 y otras quinolinas12, y determinan los costos de aptitud asociados13. Si bien se ha demostrado que las mutaciones en un segundo transportador ubicado en la membrana de la vacuola alimentaria, el transportador de resistencia a múltiples fármacos (pfmdr1), modulan la resistencia a CQ en algunos antecedentes genéticos14, el papel de otros genes en la evolución de la resistencia a CQ sigue sin estar claro. En este artículo, buscamos comprender la contribución de loci de parásitos adicionales a la evolución de la resistencia a CQ mediante una combinación de genómica de poblaciones, cruces genéticos experimentales y edición de genes.

Los datos genómicos de población longitudinales pueden proporcionar pruebas convincentes de la evolución de los loci15 de resistencia a los medicamentos. Realizamos un análisis longitudinal de la secuencia del genoma completo de 600 genomas de P. falciparum recolectados entre 1984 y 2014 en Gambia para examinar las firmas de selección bajo la presión de las drogas (Tabla complementaria 1). Después de la filtración utilizando la ausencia de genotipos (<10 %) y la frecuencia de alelos menores (>2 %), conservamos 16 385 loci SNP bialélicos de 321 aislamientos (1984 (134), 1990 (13), 2001 (34), 2008 (75) y 2014 (65)). La mutación pfcrt K76T asociada con la resistencia a CQ aumentó del 0 % en 1984 al 88 % en 2014. En particular, también hubo un cambio rápido en la frecuencia del alelo en chr. 6: la diferenciación más fuerte se observa en una mutación S258L en un supuesto transportador de aminoácidos, pfaat1 (PF3D7_0629500, chr. 6), que aumentó durante el mismo período de 0 % a 97 % (Fig. 1a). Suponiendo un tiempo de generación (de mosquito a mosquito) de 6 meses para los parásitos de la malaria, estos cambios fueron impulsados ​​por coeficientes de selección de 0,18 para pfaat1 S258L y 0,11 para pfcrt K76T (datos extendidos, figura 1). Tanto las mutaciones pfaat1 S258L como pfcrt K76T estaban ausentes en las muestras de 1984, pero estaban presentes en 1990, lo que sugiere que surgieron y se propagaron en un período de tiempo breve. Tanto pfaat1 como pfcrt mostraron estructuras de haplotipos temporales similares en Gambia (datos extendidos, figura 2). Estos se caracterizaron por un reemplazo casi completo de haplotipos bien diferenciados en ambos loci entre 1984 y 2014. Durante este período, también observamos cambios temporales importantes en otro locus de resistencia a fármacos conocido (pfdhfr) (chr. 4)16 (Fig. 1b) . Que estos rápidos cambios en la frecuencia de alelos ocurran en pfcrt, pfaat1 y pfdhfr, pero no en otras partes del genoma (Fig. 1b), proporciona evidencia inequívoca de una fuerte selección direccional.

a, cambio temporal de la frecuencia del alelo en los SNP que codifican pfaat1 S258L y pfcrt K76T entre 1984 y 2014. El mapa y la región ampliada de África occidental muestran la ubicación de Gambia. b, Importancia de la diferenciación de haplotipos en poblaciones temporales de parásitos P. falciparum determinada mediante hapFLK. Los valores de P se corrigieron para pruebas múltiples usando el método BH. Los umbrales de significación en −log10 (tasa de falso descubrimiento (FDR)-valor P corregido) de 5 se indican con líneas horizontales de puntos rojos. Las regiones dentro del 1% superior de la cola de los valores de P corregidos por FDR están marcadas con símbolos genéticos. Las señales más fuertes observadas en todo el genoma están alrededor de pfcrt, pfaat1 y pfdhfr (que está involucrada en la resistencia a la pirimetamina). c, EII, cuantificada con la estadística isoRelate (iR), para poblaciones temporales muestreadas en Gambia. Los valores de P se corrigieron para pruebas múltiples usando el método BH. Los umbrales de significación en −log10 (valor P corregido por FDR) de 5 se indican con líneas horizontales de puntos rojos. Las regiones dentro del 1% superior de la cola de los valores de P corregidos por FDR están marcadas con símbolos genéticos. Se observan picos consistentemente altos de IBD alrededor de pfcrt y pfaat1 para las poblaciones de parásitos en todos los años de muestreo. La muestra de 1990 (n = 13) no se muestra en c.

Datos fuente

Más evidencia de una fuerte selección en pfaat1 y pfcrt provino del análisis de identidad por descendencia (IBD) en genomas de parásitos de Gambia. Vimos las señales más fuertes de EII en el genoma alrededor de pfaat1 y pfcrt (Fig. 1c). Estas señales son dramáticas, porque hay una EII mínima en otras partes del genoma, con la excepción de una señal fuerte centrada en pfdhfr después de 2008. Curiosamente, la EII fuerte se observa en las cuatro muestras temporales examinadas, incluida 1984, antes de la propagación de pfaat1 S258L o pfcrt K76T. Sin embargo, solo una única variante sinónima en pfaat1 (I552I) y ninguna de las variantes mutantes asociadas resistentes a CQ en pfcrt estaban presentes en ese momento. CQ fue el tratamiento de primera línea en África desde la década de 1950. Estos resultados son consistentes con la posibilidad de que los barridos selectivos impulsados ​​por CQ confieran resistencia a CQ de bajo nivel antes de 1984, tal vez dirigidos a regiones promotoras de genes asociados a la resistencia. pfaat1 también se ha seleccionado en otras ubicaciones globales: esto es evidente a partir de análisis genómicos de población anteriores de África17, SEA18 y América del Sur (SM)19. Los gráficos que resumen la EII en estas regiones se proporcionan en la Fig. 3 de datos ampliados.

Los patrones de desequilibrio de ligamiento (LD) proporcionan evidencia adicional de la vinculación funcional entre pfcrt y pfaat1. La señal más fuerte de todo el genoma de LD intercromosómica se encontró entre estos dos loci tanto en nuestros datos de Gambia (Fig. 1 complementaria) como en muestras de toda África20. La LD entre pfaat1 y pfcrt fue más fuerte en 2001 y luego decayó en 2008 y 2014 (Figs. 1 y 2 complementarias), en consonancia con el mantenimiento de la LD durante el uso intensivo de CQ y la disminución posterior de la LD después de que la monoterapia con CQ se reemplazó por sulfadoxina-pirimetamina + combinaciones de CQ en 2004, y luego con combinaciones de artemisinina en 2008 (ref. 16).

Se esperan correlaciones en las frecuencias alélicas entre pfcrt y pfaat1 si estos loci interactúan o se seleccionan conjuntamente. Las frecuencias del haplotipo CVIET para los aminoácidos 72–76 en pfCRT están significativamente correlacionadas con las frecuencias alélicas de pfaat1 S258L en África Occidental (WAF) (R2 = 0,65, P = 0,0017) y en todas las poblaciones africanas (R2 = 0,44, P = 0,0021 ) (Datos ampliados Fig. 4). Este análisis refuerza aún más el argumento de la coevolución o epistasis entre estos dos genes.

Examinamos la estructura del haplotipo de pfaat1 de los genomas de P. falciparum (versión 6 de MalariaGEN (ref. 21)) (Fig. 2 y Tabla complementaria 2). El SNP pfaat1 S258L tiene una alta frecuencia en SEA (58 %), pero se encuentra en haplotipos flanqueantes divergentes, lo que sugiere un origen independiente del pfaat1 S258L en Gambia y en otras partes de África (Fig. 2c, d y datos extendidos, Fig. 5). Hendon et al.18 llegaron a la misma conclusión para el chr. 6 región utilizando un análisis IBD de parásitos de ubicaciones globales. La evolución convergente de pfaat1 S258L proporciona evidencia adicional para la selección y contrasta con pfcrt y pfdhfr, donde los alelos de resistencia que se propagaron en África tenían un origen asiático1,2. La evolución de pfaat1 es más compleja en SEA que en otras partes del mundo. Hay tres cambios de aminoácidos derivados comunes adicionales en SEA. pfaat1 F313S se ha extendido cerca de la fijación en SEA (total 96 %, FST = 0,91 en comparación con muestras africanas) junto con pfaat1 S258L (55 %), Q454E (15 %) o K541N (22 %). El emparejamiento de F313S con tres mutaciones diferentes sugiere que F313S surgió primero. Especulamos que estos haplotipos de pfaat1 localizados geográficamente han tenido un papel importante en la evolución de la resistencia a CQ en SEA y también podrían reflejar diferencias geográficas en el uso histórico de otras drogas de quinolina (mefloquina, quinina, piperaquina y lumefantrina) en esta región22.

a, Distribución global de los alelos pfaat1. b, Mapas comparables que muestran porcentajes de haplotipos pfcrt para los aminoácidos 72–76. Los segmentos coloreados muestran los principales haplotipos pfcrt que varían en la mutación K76T. Utilizamos el conjunto de datos de la versión 6 de MalariaGEN para el análisis de frecuencia de alelos pfaat1 y pfcrt. Los datos utilizados para la figura se encuentran en la Tabla complementaria 2. Solo se incluyeron muestras con infecciones monoclonales (N = 4051) (1233 de África occidental (WAF), 415 de África oriental (EAF), 170 de África central (CAF), 994 del este de Asia sudoriental (ESEA), 998 del oeste de Asia sudoriental (WSEA), 37 del sur de Asia (SA), 37 de América del Sur (SM) y 167 de la región del Océano Pacífico (PO)). c, d, MSN de haplotipos coloreados por el alelo pfaat1 (c) y la ubicación geográfica (d), respectivamente. Las redes se construyeron a partir de regiones del genoma de 50 kb centradas por pfaat1 (25 kb hacia arriba y hacia abajo). Esto abarca las regiones del genoma que muestran LD alrededor de pfaat1 (Fig. 2 complementaria). Se utilizó un total de 581 genomas con la mayor cobertura de secuencia para generar el red. Las redes se generaron sobre la base de 1847 SNP (al menos un mutante en el conjunto de datos completo: versión 6 de MalariaGEN). El tamaño del círculo indica el número de muestras representadas (la más pequeña, 1; la más grande, 87). Haplotipos de la misma región ( Asia o África) se agruparon, lo que indica un origen independiente de los alelos pfaat1.

Los cruces genéticos de P. falciparum se pueden lograr con ratones quiméricos de hígado humano, reviviendo y mejorando esta poderosa herramienta para la genética de la malaria23,24, después de que se prohibiera el uso de grandes simios para la investigación. Utilizamos dos réplicas biológicas independientes de un cruce entre el parásito africano sensible a CQ, 3D7, y un parásito resistente a CQ recientemente aislado de la frontera entre Tailandia y Myanmar, NHP4026 (Tabla complementaria 3). Luego comparamos las frecuencias de alelos de todo el genoma en grupos de progenie tratados con CQ y tratados con control para identificar loci de rasgos cuantitativos (QTL) (Tabla complementaria 4). Este análisis segregante a granel (BSA)25 de los parásitos de la progenie identificó sólidamente el chr. 7 locus que contiene pfcrt como se esperaba, validando nuestro enfoque (Fig. 3a y Figs. Suplementarias 3 y 4). También nos intrigó ver un QTL significativo en chr. 6 en cada uno de los cruces replicados (Fig. 3, Figs. 3 y 4 complementarias y Fig. 6 de datos extendidos). Priorizamos los genes dentro del intervalo de confianza del 95% de cada QTL (Tabla complementaria 5) al inspeccionar los SNP e indels que diferenciaron a los dos padres (Tabla complementaria 6). El chr. 6 QTL abarcaron desde 1013 kb hasta 1283 kb (270 kb) y contenían 60 genes. De estos, 54 se expresan en estadios sanguíneos y 27 tienen mutaciones no sinónimas que diferencian 3D7 de NHP4026. pfaat1 se encuentra en el pico de la chr. 6 QTL (Fig. 3c). NHP4026 portaba dos mutaciones no sinónimas derivadas en pfaat1 (S258L y F313S) en comparación con 3D7, que porta el alelo ancestral. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que uno o ambos de estos SNP pfaat1 pueden estar impulsando el chr. 6 QTL.

a, Diagramas de frecuencia de alelos en todo el genoma antes y después del tratamiento con CQ. Las líneas con el mismo color indican los resultados de las réplicas técnicas. b, QTL identificados utilizando el enfoque G '. Las líneas con el mismo color indican los resultados de las réplicas técnicas. a y b incluyen los resultados de BSA con 48 h de tratamiento con CQ con muestras recolectadas en el día 4. Para ver el BSA completo de diferentes puntos de tiempo de recolección y la duración del tratamiento con diferentes concentraciones de CQ, consulte las Figs. 3 y 4. c, Mapeo fino del chr. 6 QTL. Los intervalos de confianza (IC) del 95 % se calcularon a partir de las muestras tratadas con CQ 250 nM, incluidos los datos de diferentes puntos temporales de recolección (día 4 para el tratamiento con CQ de 48 h y día 5 para el tratamiento con CQ de 96 h), grupos (grupo 1 y grupo 2 ), y duración del tratamiento farmacológico (48 h y 96 h). La sombra cian claro muestra los límites de los CI fusionados de todos los QTL. Cada línea indica un QTL; la línea discontinua negra indica el umbral para la detección de QTL (G′ = 20). La línea discontinua roja vertical indica la ubicación de pfaat1.

Aislamos clones individuales de la progenie 3D7 × NHP4026 F1 a granel para recuperar clones con todas las combinaciones de alelos parentales en el chr. 6 y cr. 7 locus QTL. Clonamos parásitos tanto de un cultivo de progenie a granel que se seleccionó con CQ (96 ha 250 nM de CQ) como de un cultivo de control. Esto generó 155 descendientes clonales: 100 del cultivo seleccionado con CQ, 62 de los cuales eran genéticamente únicos, y 55 del cultivo de control no tratado, de los cuales 47 eran únicos (Fig. 4a). Comparamos las frecuencias alélicas entre estas dos poblaciones de progenie (Fig. 4b), revelando diferencias significativas en ambos chr. 6 y cr. 7 regiones QTL, paralelas a los resultados de BSA. Observamos un agotamiento dramático del alelo resistente a CQ NHP4026 en el chr. 7 QTL en cultivos tratados con control, consistente con una fuerte selección contra alelos pfcrt resistentes a CQ en ausencia de selección de CQ. Por el contrario, toda la progenie aislada después del tratamiento con CQ albergaba el alelo pfcrt resistente a CQ NHP4026. La herencia del locus pfcrt (chr. 7) y el locus pfaat1 (chr. 6) estaba estrechamente vinculada en los clones aislados (Fig. 4c). Para examinar más a fondo si los datos cruzados eran consistentes con la epistasis o la coselección, examinamos una muestra más grande de clones recombinantes aislados de cinco iteraciones independientes de este cruce genético en ausencia de selección CQ. Esto reveló una subrepresentación significativa de clones con genotipo pfcrt 76T y pfaat1 258S/313F (WT) (Tabla complementaria 7, χ2 = 12,295, P = 0,0005). Estos resultados son consistentes con el fuerte LD entre estos loci observados en la naturaleza (Datos extendidos Fig. 4 y Fig. 1 complementaria) 20 y sugieren una relación funcional entre los dos loci. Una posible explicación de los resultados observados es la función de pfaat1 S258L/F313S en la compensación de la aptitud reducida de los parásitos portadores de pfcrt K76T.

a, herencia alélica de 109 progenie recombinante única. Los bloques negros y rojos indican alelos de 3D7 y NHP4026, por separado. Las líneas grises verticales muestran regiones no centrales donde no se genotiparon SNP. Izquierda: se marcan los clones aislados de grupos de progenie recombinante con o sin tratamiento con CQ. Derecha: los alelos pfaat1 y pfcrt están etiquetados. WT indica alelos pfaat1 y pfcrt de 3D7 y MUT indica alelos de NHP4026. La ubicación de pfaat1 y pfcrt está marcada con triángulos negros en la parte superior del panel. b, Gráfica de frecuencia de alelos 3D7 de todo el genoma de una progenie única clonada de grupos después de 96 h de tratamiento con CQ (250 nM) (azul) o de grupos de control (dorado). c, Enlace entre loci en diferentes cromosomas medido por la prueba exacta de Fisher. La línea vertical punteada marca el umbral de significación corregido por Bonferroni (una cola), mientras que los puntos que se muestran en rojo son comparaciones entre los SNP que flanquean a pfaat1 y pfcrt. La Tabla complementaria 7 muestra asociaciones no aleatorias entre genotipos en clones de parásitos recuperados de cultivos no tratados.

A continuación, medimos los valores de concentración inhibitoria media máxima (IC50) de CQ in vitro para 18 parásitos (un conjunto de 16 descendientes y ambos padres), que portaban todas las combinaciones de chr. 6 y cr. 7 alelos QTL (Fig. 5 complementaria y Tabla complementaria 8). El padre NHP4026 fue el parásito más resistente a CQ probado. Toda la progenie que heredó NHP4026 pfcrt mostró un fenotipo resistente a CQ, mientras que toda la progenie que heredó 3D7 pfcrt fue sensible a CQ, de acuerdo con informes anteriores. El efecto de los alelos pfcrt sobre la resistencia CQ del parásito fue significativo sobre la base de una prueba de análisis de varianza de dos vías (P = 7.52 × 10−11). No vimos un efecto de los genotipos pfaat1 en los valores de IC50 en clones que portaban pfcrt 76T (P = 0,06) o pfcrt 76K (P = 0,19). Este análisis tiene un poder limitado porque solo se recuperaron dos parásitos de la progenie con pfaat1 258S/313F (WT) en combinación con pfcrt 76T (Fig. 4a y Fig. 5 complementaria), pero es consistente con el pfaat1 QTL impulsado por la aptitud del parásito en nuestro cruces genéticos. Por lo tanto, nos centramos en la manipulación de genes de parásitos isogénicos para el análisis funcional.

Utilizamos la modificación CRISPR-Cas9 del padre resistente a CQ NHP4026 para investigar los efectos de las mutaciones en pfaat1 en la respuesta al fármaco CQ IC50 y la aptitud del parásito (Fig. 5). NHP4026 pfaat1 lleva los dos cambios SEA no sinónimos más comunes (S258L y F313S) (Fig. 2), en relación con el padre sensible 3D7. Editamos estas posiciones de regreso al estado ancestral, tanto individualmente como en combinación, y confirmamos las modificaciones en tres a cinco clones aislados de ediciones independientes para cada cambio alelo (Fig. 5a). Luego determinamos los valores de CQ IC50 y medimos la aptitud mediante experimentos de competencia por pares para los padres NHP4026258L/313S, las mutaciones individuales NHP4026258L/313F, NHP4026258S/313S y el alelo ancestral NHP4026258S/313F. Esto reveló un impacto muy significativo de la mutación S258L, que aumentó los valores de CQ IC50 en 1,5 veces, y un impacto más moderado pero significativo de F313S y la doble mutación (S258L/F313S), en relación con el alelo ancestral (258S/313F) ( Figura 5b). La observación de que 258L muestra valores IC50 reducidos en combinación con la mutación F313S revela una interacción epistática entre estas variantes de aminoácidos (Fig. 5b).

a, edición de genes CRISPR-Cas9. Comenzando con el padre NHP4026, generamos todas las combinaciones de los estados SNP en pfaat1. b, Respuesta a fármacos. Cada punto indica una medición IC50 replicada: usamos de dos a cuatro clones independientes editados con CRISPR para cada haplotipo examinado. El número de réplicas biológicas se muestra encima del eje x. Realizamos pruebas t por pares (dos colas) para comparar los valores de IC50 entre líneas de parásitos, sin ajuste para comparaciones múltiples. Los haplotipos se muestran en el eje x y los aminoácidos derivados se muestran en rojo. Las barras muestran medias ± sem), mientras que se marcan diferencias significativas entre haplotipos. c, Aptitud. Las barras muestran la aptitud relativa media (±1 sem) medida en experimentos de competencia replicados, y los puntos representan la aptitud de las mediciones individuales. Realizamos tres experimentos de competencia independientes para cada grupo de parásitos editado en ausencia de CQ. Se usó la estadística F para comparar la aptitud entre las líneas de parásitos. Los resultados de los ensayos para cada grupo editado se combinaron mediante metanálisis con efectos aleatorios. Para conocer los cambios de frecuencia de alelos para cada experimento de competencia, consulte Datos ampliados, Fig. 10. NS, no significativo.

Datos fuente

También examinamos el efecto de las sustituciones S258L y F313S en las respuestas a otros fármacos de quinolina. Los resultados revelaron efectos significativos de las sustituciones de pfaat1 en las respuestas IC50 de quinina, amodiaquina y lumefantrina, y ningún efecto en la IC50 de mefloquina (Datos ampliados, Fig. 7). En particular, estos cambios en el valor de IC50 estaban muy por debajo del umbral asociado con la resistencia clínica. En consecuencia, aunque las mutaciones en pfaat1 pueden tener un impacto sutil en la susceptibilidad de una variedad de compuestos, estos resultados son consistentes con que el tratamiento con CQ sea la principal fuerza selectiva que impulsó las mutaciones de pfaat1 S258L y F313S junto con las de pfcrt.

Las mutaciones que confieren resistencia a los medicamentos a menudo conllevan costos de aptitud en ausencia de tratamiento farmacológico. Por lo tanto, examinamos la aptitud del parásito realizando experimentos de competencia por parejas con el parásito parental NHP4026 contra los mismos parásitos mutantes pfaat1 creados anteriormente. Esto reveló diferencias significativas en la aptitud (Fig. 5c). El alelo 258L/313F que mostró un barrido selectivo en Gambia fue el menos apto de todos los genotipos, el alelo ancestral (258S/313F) portado por el padre 3D7 fue el más apto, mientras que la mutación 258S/313S mostró una aptitud similar al Padre NHP4026 (258L/313S). Estos resultados también revelaron fuertes interacciones epistáticas en el estado físico. Mientras que el alelo 258L/313F que confirió valores altos de CQ IC50 (Fig. 5b) conllevaba una fuerte penalización de aptitud (Fig. 5c), la aptitud fue parcialmente restaurada por la mutación 313S en el alelo 258L/313S que predomina en SEA. Juntos, estos resultados muestran que la sustitución de pfaat1 S258L sustenta un aumento de 1,5 veces en la resistencia a CQ que probablemente impulsó su propagación selectiva en Gambia. Sin embargo, S258L conlleva un alto costo de aptitud que en los parásitos SEA probablemente fue mitigado por la sustitución, F313S. En general, estos resultados demuestran un gran efecto de las mutaciones de pfaat1 en la aptitud de los parásitos que portan alelos de resistencia pfcrt K76T.

Los experimentos de edición revelan que los clones que portan el alelo ancestral pfaat1 en combinación con pfcrt K76T muestran la mayor aptitud. Por el contrario, la estrecha asociación de pfaat1 S258L/F313S con pfcrt K76T en la progenie de los cruces genéticos reveló la relación opuesta. Especulamos que estos resultados opuestos pueden reflejar diferentes presiones de selección en parásitos en etapa sanguínea en el caso de experimentos CRISPR, o en las etapas del ciclo de vida del mosquito y el hígado en el caso de cruces genéticos. Los estudios de edición de genes se realizaron con un solo genotipo de parásito SEA (NHP4026). Mientras que los alelos africanos pfcrt CQR se originaron en SEA y comparten un ancestro común y una identidad en los aminoácidos 72–76, la mayoría de los parásitos SEA (incluido NHP4026) portan una o dos mutaciones adicionales en pfcrt (N326S e I356T) asociadas con valores más altos de CQ IC50 y reducción condición física13,26. El haplotipo pfcrt predominante en Gambia difiere del NHP4026 en un aminoácido, que porta el 326S ancestral, mientras que el NHP4026 porta la mutación 326N13. Será importante examinar el efecto de las mutaciones de pfaat1 en los antecedentes genéticos africanos en trabajos futuros.

Para comprender mejor cómo pfaat1 S258L afecta el fenotipo del parásito, utilizamos un sistema de expresión heterólogo de levadura. WT pfaat1 se expresa en la membrana plasmática de la levadura27, donde aumenta la captación de quinina y CQ, lo que confiere sensibilidad a los fármacos de quinolina, lo que reduce el crecimiento. Anteriormente se demostró que la absorción de CQ se inhibía competitivamente por el aminoácido aromático triptófano, lo que sugiere un papel para pfaat1 en el transporte de fármacos y aminoácidos27. Por lo tanto, expresamos pfaat1 S258L en levadura, que restauró el crecimiento de la levadura en presencia de altos niveles de CQ (Datos extendidos Fig. 8). Curiosamente, la expresión de otra variante de aminoácido (T162E), responsable de la resistencia a CQ en parásitos de malaria de roedores (Plasmodium chabaudi)28, también previene la acumulación de fármacos de quinolina dentro de las células de levadura y restaura el crecimiento celular en presencia de CQ27 1 mM. Juntos, estos resultados nuevos y publicados sugieren que la expresión de levadura de las mutaciones de pfaat1 afecta la resistencia y la aptitud al alterar las tasas de transporte de aminoácidos y quinolina.

Evaluamos modelos estructurales tridimensionales basados ​​en la secuencia de aminoácidos 3D7 PfAAT1 utilizando AlphaFold29 e I-TASSER30 (datos extendidos, figura 9). Mientras que pfCRT tiene 10 hélices que atraviesan la membrana31, pfAAT1 tiene 11; esto se corroboró utilizando la herramienta de predicción de topología de membrana basada en secuencias TOPCONS32. Las mutaciones comunes de pfAAT1 S258L, F313S y Q454E están situadas en dominios que abarcan la membrana, mientras que K541L está en un bucle que une los dominios 9 y 10. La ubicación de estos cambios no sinónimos de alta frecuencia en los dominios que abarcan la membrana tiene fuertes paralelismos con pfCRT evolution31 y es consistente con un papel funcional de estos aminoácidos en la función del transportador.

La identificación de pfcrt como el principal determinante de la resistencia a la CQ fue un gran avance que transformó el panorama de la investigación de la resistencia a los medicamentos contra la malaria, pero la contribución de factores genéticos adicionales en la evolución y el mantenimiento de la resistencia a la CQ seguía sin estar clara26,33. Al combinar el análisis genómico longitudinal de la población que abarca la aparición de la resistencia a la CQ en Gambia, el análisis de las poblaciones masivas y la progenie de los cruces genéticos controlados y la validación funcional utilizando P. falciparum y levadura, encontramos pruebas convincentes de que un segundo locus, pfaat1, ha tenido un papel importante en la evolución de la resistencia a CQ. Esta poderosa combinación de enfoques nos permitió examinar variantes críticas de pfaat1 que contribuyen a la arquitectura de la resistencia a CQ y las interacciones entre pfcrt y pfaat1.

Nuestros resultados proporcionan evidencia convincente que consolida observaciones dispares de varios sistemas que sugieren un papel para pfaat1 en la evolución de la resistencia a los medicamentos. En el parásito de la malaria de roedores P. chabaudi, se encontró que una mutación (T162E) en el gen ortólogo (pcaat1) es un determinante de la resistencia CQ de bajo nivel en la resistencia evolucionada en laboratorio28. En estudios de asociación de todo el genoma de P. falciparum, la mutación S258L de pfaat1 se asoció con la resistencia a CQ en aislamientos de campo recolectados a lo largo de la frontera entre China y Myanmar34, mientras que pfcrt K76T y pfaat1 S258L muestran la LD más fuerte entre cromosomas físicamente no vinculados en todo el genoma20. Además, las mutaciones en pfaat1 se han relacionado con la evolución in vitro de la resistencia en P. falciparum a tres andamios de fármacos diferentes35. El trabajo anterior identificó fuertes firmas de selección reciente en parásitos en África en las regiones que rodean pfcrt, pfaat1 y otros loci16,17,36 de resistencia a los medicamentos; Se observan firmas de selección similares en Asia y SM18,19, mientras que pfaat1 se destacó en una lista de genes de P. falciparum que muestran una diferenciación geográfica extrema21.

Los diferentes haplotipos de pfaat1 en África y Asia pueden ser en parte responsables de la evolución contrastante de la resistencia a CQ en estos dos continentes. Los parásitos resistentes a CQ que portaban tanto pfcrt K76T como pfaat1 S258L se extendieron por África, pero después de la eliminación de CQ como fármaco de primera línea, la prevalencia de parásitos resistentes a CQ disminuyó en muchos países37,38,39. Esto es consistente con la baja aptitud de los parásitos portadores de pfcrt K76T y pfaat1 S258L en ausencia de la presión de las drogas y la intensa competencia dentro de la infección por parásitos de la malaria en África40.

Por el contrario, pfcrt K76T ha permanecido en o cerca de la fijación en muchos países SEA21,41 (Fig. 2). En la frontera entre Tailandia y Myanmar, la resistencia a la CQ ha permanecido fija desde 1995, cuando se eliminó la CQ como tratamiento de primera línea para la malaria por P. falciparum41. Nuestros resultados de mutagénesis de pfaat1 demuestran que los parásitos que portan pfaat1 258L/313S muestran valores de IC50 reducidos pero una aptitud física elevada en relación con pfaat1 258L/313F. Especulamos que la restauración de la aptitud por F313S puede ayudar a explicar la retención de alelos pfcrt K76T resistentes a CQ en SEA. La hipótesis alternativa (que las altas frecuencias de las mutaciones F313S están impulsadas por el uso generalizado de otros fármacos asociados con quinolinas en SEA42) no está respaldada porque solo observamos impactos menores de esta sustitución en la respuesta a lumefantrina, quinina, mefloquina y amodiaquina (figura de datos ampliada). 7).

Las mutaciones en pfcrt confieren resistencia a CQ al permitir la salida de CQ a través de la membrana de la vacuola digestiva, lejos de su sitio de acción8. pfAAT1 también se encuentra en la membrana de la vacuola digestiva35, donde probablemente actúa como transportador bidireccional de aminoácidos aromáticos9,43. Dada la similitud estructural de los fármacos de quinolina y los aminoácidos aromáticos, las mutaciones de pfaat1 pueden modular la capacidad de pfAAT1 para transportar CQ y/o aminoácidos27,43. La mutación pfaat1 S258L podría potenciar la resistencia al aumentar la salida de CQ fuera de la vacuola digestiva o al reducir la tasa de entrada a la vacuola. Dado que esta mutación pfaat1 bloquea la entrada de fármacos de quinolina en las células de levadura cuando se expresan heterólogamente en la membrana de la célula de levadura27, planteamos la hipótesis de que la mutación pfaat1 S258L reduce la captación de CQ en la vacuola alimentaria (Fig. 6). Nuestros análisis de mutagénesis muestran que el alelo S258L tiene un alto costo de aptitud, quizás debido a una menor capacidad de transporte de aminoácidos desde la vacuola. Curiosamente, la comparación del haplotipo pfaat1 S258L/F313S que se segrega en nuestro cruce genético con el alelo WT pfaat1 generado mediante la edición de genes reveló solo aumentos marginales en los valores de IC50 y reducciones limitadas en la aptitud. Esto es consistente con la mutación F313S que restaura la función natural de transporte de aminoácidos pfaat1, lo que reduce el estrés osmótico y la inanición, mientras que también reduce parcialmente los niveles de resistencia a CQ (Fig. 6). El hecho de que este haplotipo haya alcanzado una alta frecuencia en SEA puede contribuir al mantenimiento de los alelos pfcrt K76T mucho después de la eliminación de CQ como fármaco de primera línea. Este modelo (Fig. 6) proporciona una hipótesis de trabajo que se puede probar en trabajos futuros que examinen el papel de pfAAT1 y pfCRT.

pfCRT (rojo) y pfAAT1 (azul) están situados en la membrana de la vacuola digestiva (DV). a, WT pfCRT y pfAAT1 transportan péptidos y aminoácidos aromáticos, respectivamente, así como CQ. b, pfCRT K76T exporta CQ desde el DV lejos de su sitio de acción, lo que genera una resistencia elevada, pero transporta péptidos de manera ineficiente, lo que conduce a una pérdida de aptitud. c, pfAAT1 S258L reduce la entrada de CQ en el DV, lo que lleva a una resistencia elevada, pero el flujo de aminoácidos se ve afectado, lo que lleva a una pérdida de aptitud. d, la doble mutación pfAAT1 S258L/F313S aumenta la entrada de CQ en comparación con S258L solo, pero se restablece la función de transporte de aminoácidos, lo que conduce a valores reducidos de IC50 y una mayor aptitud física en ausencia de tratamiento farmacológico.

Nuestros resultados revelan una complejidad oculta en la evolución de la resistencia a CQ: el tratamiento farmacológico ha impulsado barridos selectivos globales que actúan sobre mutaciones en un transportador adicional (pfAAT1) ubicado en la membrana de la vacuola digestiva de P. falciparum, que afinan el equilibrio entre el transporte de nutrientes y fármacos, revelando evidencia para la epistasis y la compensación, e impactando tanto en la resistencia a los medicamentos como en el estado físico.

El estudio se realizó de acuerdo con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de EE. UU. El Seattle Children's Research Institute (SCRI) tiene una Garantía del Servicio de Salud Pública a través de la Oficina de Bienestar de los Animales de Laboratorio para trabajos aprobados por su Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. Todo el trabajo realizado en este estudio fue revisado y aprobado específicamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SCRI.

El diseño del proyecto se resume en la figura complementaria 6. En resumen, utilizamos (1) análisis genómicos de población, (2) cruces genéticos y análisis de genética cuantitativa seguidos de (3) análisis funcionales para investigar el papel de loci adicionales en la resistencia a CQ.

Muestras de sangre infectadas con P. falciparum recolectadas en Gambia central (Farafenni) y costera (Serrekunda) en 1984 y 2001, se procesaron para ADN de sangre completa y genomas de P. falciparum y se secuenciaron en profundidad en el Wellcome Trust Sanger Institute. Los datos de aislamientos recolectados en la costa de Gambia en 2008 y 2014 se publicaron anteriormente44,45 (Tabla complementaria 1). Antes de la secuenciación, los genomas de P. falciparum se amplificaron a partir del ADN de sangre completa de cada muestra de 1984 y 2001 mediante la amplificación selectiva del genoma completo (WGA) y luego se secuenciaron (lecturas de extremos emparejados) en la plataforma Illumina HiSeq46. Las lecturas se asignaron al genoma de referencia 3D7 de P. falciparum utilizando bwa mem (http://bio-bwa.sourceforge.net/). Los archivos de asignación (mapa de alineación binaria) se clasificaron y desduplicaron con las herramientas de Picard v2.0.1 (http://broadinstitute.github.io/picard/), y SNP e indel se llamaron con GATK HaplotypeCaller (https://software.broadinstitute. org/gatk/) siguiendo las mejores prácticas (https://www.malariagen.net/data/pf3K-5). Los archivos de formato de llamada variante (VCF) fueron generados por cromosoma, combinados con bcftools (https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html) y filtrados con vcftools (https://vcftools.sourceforge.net/). Después de la filtración, solo se conservaron las variantes de SNP bialélico con una puntuación VQSLOD de ≥2, una calidad de mapa >30 y ≥5 lecturas admitidas por variante alélica. Los SNP con una frecuencia de alelo menor <2 % se eliminaron de nuestro análisis. También eliminamos muestras con >10% de genotipos faltantes. En el conjunto de datos final, había un total de 16 385 loci SNP bialélicos y 321 aislamientos (1984 (134), 1990 (13), 2001 (34), 2008 (75) y 2014 (65)). La complejidad de la infección (monogenómica o poligenómica) se estimó como el coeficiente de consanguinidad Fws del archivo VCF fusionado utilizando el paquete R Biomix. Los datos de secuencia de lectura corta analizados se enumeran en la Tabla complementaria 1.

Para cada muestra con una complejidad de infección superior a 1, el alelo con más lecturas se retuvo para los genotipos de alelos mixtos para crear un conjunto de datos de variación del genoma haploide virtual. Las frecuencias de alelos se calcularon en plink, y Fst estimó las diferencias por pares entre poblaciones temporales y grupos genéticos utilizando el método de Weir y Cockerham aplicado en el paquete hierfstat en R. La prueba de razón de probabilidad para la diferencia de frecuencia de alelos pFST se calculó adicionalmente usando vcflib. Para un valor pFST P combinado, se realizó el método de Fisher en el paquete R metaseq. Los valores de P resumidos se corrigieron para pruebas múltiples utilizando el método de Benjamini-Hochberg (BH). Para examinar el intercambio de haplotipos en pfaat1 (Pf3D7_06_v3:1,213,102-1,217,313) y pfcrt (Pf3D7_07_v3:403222-406317) entre aislamientos de los diferentes años de muestreo en Gambia, extrajimos la matriz IBD usando el paquete isoRelate R18 para todos los pares de aislamientos para regiones genéticas abarcando 25 kb adicionales en cada flanco. Generamos redes de relación usando el paquete R igraph siguiendo los scripts del paquete isoRelate R18. Los aislamientos están conectados si muestran >90 % de EII.

Consideramos las muestras recolectadas en el mismo año como una sola población, independientemente del lugar de recolección. Usamos el enfoque hapFLK para detectar firmas de selección positiva a través de la diferenciación de haplotipos después de la agrupación jerárquica de grupos de población temporal de Gambia en comparación con un grupo externo de Tanzania, como se describió anteriormente47. Los valores de P se calcularon para cada valor específico de SNP utilizando el script Python proporcionado con el programa hapFLK, y los valores se corrigieron para múltiples pruebas utilizando el método BH. En segundo lugar, utilizamos la relación por pares basada en la identidad por descendencia para derivar una estadística de iR para cada SNP según lo implementado por el paquete IsoRelate18 en R. Las regiones con valores de iR superpuestos y hapFLK −log10 P> 5 se consideraron como regiones de interés.

Incluimos dos conjuntos de datos en este estudio: (1) genotipos de 7000 muestras de P. falciparum en todo el mundo del proyecto comunitario MalariaGEN Pf (versión 6.0) (ref. 21). Este conjunto de datos incluye muestras de América del Sur (SM), África occidental (WAF), África central (CAF), África oriental (EAF), Asia meridional (SA), la parte occidental del sudeste asiático (WSEA), la parte oriental del sureste Asia (ESEA) y la región de Oceanía del Pacífico (PO). (2) También incluimos 194 muestras de Tailandia con datos de secuenciación del genoma completo disponibles de Cerqueira et al.15, y las fusionamos con la población de WSEA. Las secuencias duplicadas se eliminaron de acuerdo con la identificación original de la muestra (hipercódigo). Solo las muestras con infecciones de un solo parásito (diversidad dentro del huésped FWS > 0,90) y >50 % de los loci SNP genotipados se incluyeron para análisis adicionales. Quedaron un total de 4051 muestras después de la filtración (Tabla complementaria 2). Los SNP no bialélicos y las llamadas variantes heterocigóticas se eliminaron aún más del conjunto de datos. Luego extrajimos los datos del genotipo en las regiones de los genes pfaat1 y pfcrt y calculamos las frecuencias alélicas (Fig. 2a).

Para minimizar el efecto de la recombinación, extrajimos 1847 SNP distribuidos en 25 kb aguas arriba y 25 kb aguas abajo del gen pfaat1. Solo se utilizaron muestras con todos los 1847 SNP genotipados (581/4051) para el análisis evolutivo. Para visualizar la estructura de la población, calculamos la distancia genética por pares entre las muestras y generamos una red de expansión mínima (MSN; Fig. 2b y Extended Data Fig. 5), utilizando el paquete R poppr. Comparamos secuencias genómicas (PlasmoDB, versión 46) entre P. falciparum y Plasmodium reichenowi y extrajimos genotipos en 1803/1847 loci comunes. Luego construimos un método de grupo de pares no ponderado con un árbol de media aritmética (UPGMA) enraizado por P. reichenowi usando los 581 haplotipos y 1,803 SNP (Datos extendidos Fig. 5), usando los paquetes R ape y phangorn bajo parámetros predeterminados. La red MSN y el método de grupo de pares no ponderados con árbol de media aritmética se trazaron con ggplot2.

Generamos cruces genéticos entre el parásito 3D7 y NHP4026 (ref. 48), utilizando ratones FRG NOD huHep con hígados quiméricos humanos y mosquitos Anopheles stephensi como se describió anteriormente23,24,25,49,50. 3D7 es un parásito de origen africano51 que se ha mantenido en el laboratorio durante décadas y es sensible a CQ, mientras que NHP4026 fue clonado de un paciente que visitó la clínica de la Unidad de Investigación de Malaria de Shoklo en la frontera entre Tailandia y Myanmar (2007) y es resistente a CQ (Suplementario). Tabla 3). Generamos tres grupos recombinantes usando jaulas independientes de mosquitos infectados: estos son grupos independientes de recombinantes48. El número estimado de genotipos recombinantes en cada grupo fue ~2800 (ref. 48). Utilizamos dos grupos (grupo 1 y grupo 2) mantenidos en medio de cultivo basado en AlbuMAX para este estudio.

Para cada grupo recombinante, el cultivo de parásitos se expandió en condiciones de cultivo estándar25. Brevemente, los cultivos se mantuvieron en medio completo al 5 % de hematocrito en glóbulos rojos O+ (RBC) (Biochemed Services) a 37 °C, pH de 7,0 a 7,5, 5 % de CO2, 5 % de O2 y 90 % de N2. Se realizaron cambios de medio cada 48 h y se expandieron los cultivos para mantener la parasitemia en ~1%. Una vez expandido, cada grupo recombinante se dividió en 16 alícuotas de 0,5 ml mientras se diluía hasta un 1 % de parasitemia. Las alícuotas se mantuvieron en placas de 48 pocillos y se trataron con CQ (Fig. 7 complementaria). En total, tuvimos 32 cultivos: 2 grupos × 4 concentraciones de CQ (0 (control), 50, 100 o 250 nM) × 2 tiempo de duración del fármaco (48 h o 96 h) × 2 repeticiones técnicas. Definimos el día en que se aplicó el fármaco como el día 0. Después de 2 días (48 h) de tratamiento con fármaco, los glóbulos rojos infectados se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato para eliminar el fármaco residual. Para la placa asignada para el tratamiento con CQ de 48 h (placa 1 de 48 pocillos), los cultivos se mantuvieron en medio completo; y las muestras se recolectaron los días 0, 4 y 7. Para la placa asignada para el tratamiento con CQ de 96 h (placa 2 de 48 pocillos), se volvió a agregar CQ fresco al medio de cultivo y se trató durante otras 48 h; y después de un total de 96 h de tratamiento con CQ, se eliminó el fármaco y se recogieron muestras los días 0, 5 y 10. Se disolvió CQ en H2O y se diluyó en medio incompleto (Gibco, Life Technologies). El medio de cultivo se cambió cada 48 h. La parasitemia se controló utilizando portaobjetos teñidos con Giemsa al 20 % y los cultivos se diluyeron al 1 % de parasitemia si la parasitemia era superior al 1 %. Se recogieron aproximadamente 15 μl de glóbulos rojos empaquetados por muestra.

Preparamos bibliotecas de Illumina y secuenciamos a ambos padres y los 96 grupos segregantes recolectados. Extrajimos el ADN genómico con el mini kit de ADN de Qiagen y cuantificamos el ADN con el ensayo Quant-iT PicoGreen (Invitrogen). Para muestras con <50 ng de ADN obtenido, realizamos WGA52. Los productos WGA se limpiaron con KAPA Pure Beads (Roche Molecular Systems) en una proporción de 1:1. Preparamos bibliotecas de secuenciación usando 50–100 ng de ADN o producto WGA usando el kit KAPA HyperPlus siguiendo las instrucciones con tres ciclos de PCR. Todas las bibliotecas se secuenciaron en un extremo de par de 150 pb utilizando secuenciadores Illumina Novaseq S4 o Hiseq X, para obtener una cobertura genómica >100x por muestra.

Mapeamos las lecturas de secuenciación contra el genoma de referencia 3D7 (PlasmoDB versión 46) usando BWA mem (http://bio-bwa.sourceforge.net/), y deduplicamos y transformamos los archivos de alineación usando picard tools v2.0.1 (http ://broadinstitute.github.io/picard/). Recalibramos la puntuación de calidad base en función de un conjunto de variantes conocidas verificadas53 utilizando BaseRecalibrator, y llamamos variantes a través de HaplotypeCaller. Ambas funciones eran de Genome Analysis Toolkit GATK v3.7 (https://software.broadinstitute.org/gatk/). Solo las variantes ubicadas en las regiones centrales del genoma (definidas en la referencia 53) fueron llamadas y utilizadas para análisis posteriores.

Fusionamos las llamadas de los dos padres usando GenotypeGVCFs en GATK, y aplicamos la filtración estándar al conjunto de datos de variante sin procesar como se describe en la ref. 54. Recalibramos las puntuaciones de calidad variantes y eliminamos los loci con puntuación de calidad variante <1. Las variantes finales en formato VCF se anotaron utilizando snpEff v4.3 (https://pcingola.github.io/SnpEff/) con 3D7 (PlasmoDB, versión 46) como referencia. Después de la filtración y la anotación, seleccionamos loci SNP que son distintos en los dos padres y usamos esos SNP para más BSA.

Utilizamos métodos estadísticos descritos en las refs. 25,48,50 para BSA. Las llamadas variantes de los grupos de progenie segregantes se fusionaron. Además, se eliminaron los loci SNP con cobertura <30x. Contamos las lecturas con los genotipos de cada progenitor y calculamos las frecuencias alélicas. Las frecuencias alélicas de 3D7 se trazaron en todo el genoma y los valores atípicos se eliminaron siguiendo la regla de Hampel55 con un tamaño de ventana de 100 loci. Realizamos el BSA utilizando el paquete R QTLseqr56. Los QTL extremos se definieron como regiones con G '> 20 (ref. 57). Una vez que se detectó un QTL, calculamos un intervalo de confianza aproximado del 95 % utilizando el método de Li58 para localizar los genes causales.

La progenie individual se clonó mediante dilución limitante a 0,3 células por pocillo de cultivos a granel el día 10 después de 96 h de tratamiento con control/CQ 250 nM. Los pocillos individuales con parásitos se determinaron mediante qPCR (como se describió anteriormente49) y se expandieron a cultivos más grandes en condiciones de cultivo estándar para obtener suficiente material tanto para la crioconservación como para la secuenciación del genoma.

La progenie clonada se secuenció y genotipificó como se describe en la sección 'Cruce genético y BSA', con estas modificaciones: (1) la progenie clonada se secuenció con una cobertura genómica de 25x; (2) Las llamadas SNP se eliminaron si la cobertura era de más de tres lecturas por muestra.

Se identificó una progenie recombinante única a partir de toda la progenie clonada usando una tubería descrita previamente49. La progenie no clonal se identificó sobre la base del número y la distribución de llamadas SNP heterocigóticas. Se identificó que la progenie autofecundada tenía más del 90% de similitud de secuencia con cualquiera de los padres. La progenie recombinante única que se muestreó varias veces se identificó como grupos de progenie clonal individual con una similitud de secuencia superior al 90 %. Trazamos frecuencias de alelos 3D7 en todo el genoma en poblaciones de progenie con y sin tratamiento con CQ. Se generaron mapas de calor para visualizar patrones de herencia en progenie recombinante individual única (Fig. 4a). Seleccionamos 16 progenies recombinantes únicas con diferentes combinaciones de alelos en las regiones QTL del cromosoma 6 y el cromosoma 7 para una mayor medición de los valores de CQ IC50 v (Fig. 5 complementaria).

Se usó la prueba exacta de Fisher para probar la unión entre todos los pares de loci intercromosómicos en el conjunto de 109 progenie recombinante única. La distribución del -log de los valores de P resultantes se representó en la Fig. 4c, y el límite de significación se calculó sobre la base de una corrección de Bonferroni para el número de loci.

Los stocks criopreservados de la progenie 3D7, NHP4026, 3D7xNHP4026 se descongelaron y se cultivaron en medio completo en condiciones de cultivo estándar como se describe anteriormente. Los cultivos se mantuvieron por debajo del 3% de parasitemia con cambios de medio cada 48 h. Los valores IC50 de los progenitores y la descendencia se evaluaron mediante un ensayo de fluorescencia estándar SYBR Green 1 de 72 h59. Los cultivos se evaluaron diariamente para determinar la parasitemia y el estadio. Los cultivos que tenían al menos un 70 % de anillo se cargaron en ensayos de dosis-respuesta de CQ de una serie de diluciones dobles del fármaco en diez pocillos con una parasitemia del 0,15 %. Se prepararon stocks de fármacos (1 mg ml-1) para CQ en H2O como alícuotas de un solo uso y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Las diluciones del fármaco se prepararon en medio incompleto. Las réplicas biológicas se realizaron con al menos dos ciclos de cultivo entre las fechas de carga. Los valores de IC50 se calcularon en GraphPad Prism 8 utilizando una curva de cuatro parámetros de dos réplicas técnicas cargadas por placa.

Diseñamos plásmidos para la edición CRISPR-Cas9 como se describió anteriormente60. El ARN guía (GAAATTAAATACATAAAAGA) fue diseñado para apuntar a pfaat1 en NHP4026. Las ediciones (258L/313F, 258S/313S y 258S/313F, Fig. 5a) se introdujeron en NHP4026 a través de la secuencia del brazo de homología con mutaciones objetivo y de escudo. No se generaron mutantes de control del sitio de unión, ya que P. falciparum carece de unión final no homóloga propensa a errores61. Los parásitos se transfectaron en etapas de anillo con 100 µg de ADN plasmídico y los transfectantes exitosos se seleccionaron mediante tratamiento con WR99210 24 nM (obsequio de Jacobus Pharmaceuticals) durante 6 días. Los parásitos se recuperaron después de ~3 semanas. Para determinar si los parásitos recuperados contenían las mutaciones esperadas, amplificamos la región objetivo (cebador directo, AGTACGGTACTTTTTATATGTACAGCT; cebador inverso, TGCATTTGGTTGTTGAGAGAAGG) y confirmamos la mutación con secuenciación de Sanger. Clonamos parásitos de experimentos de transfección exitosos: se recuperaron parásitos editados de forma independiente (de diferentes experimentos de transfección) para cada genotipo pfaat1. Los parásitos editados se secuenciaron en el genoma para identificar ediciones fuera del objetivo en otras partes del genoma. No pudimos encontrar ningún cambio de SNP o indel entre el NHP4026 original y ningún parásito editado por CRISPR que no sean las mutaciones de destino y escudo.

Se midieron los valores de CI50 del parásito para CQ, amodiaquina, lumefantrina, mefloquina y quinina para dos a cuatro clones por línea modificada con CRISPR-Cas9 y para NHP4026 en múltiples fechas de carga como se describe anteriormente para la progenie clonada, excepto que cada placa incluía dos réplicas técnicas de NHP4026 como controles. Esta replicación del genotipo dentro de cada fecha de carga permitió la detección de efectos de lote debido a la fecha de carga.

Se utilizó el análisis de varianza para tener en cuenta los efectos de los lotes y para probar las diferencias en los valores de IC50 entre todos los grupos de genotipos y para cada contraste entre cada línea modificada con CRISPR-Cas9 y NHP4026 para cada fármaco probado62. Se utilizó un modelo lineal con fecha de carga (lote) y genotipo como variables explicativas para generar valores IC50 corregidos por lotes para la visualización del impacto de las modificaciones CRISPRCas9 (Fig. 5b y datos extendidos Fig. 7).

Los parásitos se sincronizaron con esquizontes en etapa tardía usando un gradiente de densidad63. La capa superior de esquizontes en etapa tardía se eliminó y se lavó dos veces con medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Los cultivos sincronizados se suspendieron en 5 ml de medio completo con un hematocrito del 5% y se les permitió volver a invadir durante la noche con agitación suave. La parasitemia y el estadio del parásito se cuantificaron mediante citometría de flujo. Brevemente, 80 μl de cultivo y un control de RBC se tiñeron con SYBR Green I y SYTO 61 y se midieron en un Guava easyCyte HT (Luminex). Se registraron un total de 50.000 eventos para determinar la parasitemia relativa y el estadio. Cuando el 80% de los parásitos estaban en la etapa de anillo, se establecieron los experimentos de competencia cabeza a cabeza64. Se establecieron ensayos de competición entre parásitos editados con CRISPR-Cas9 y NHP4026 en una proporción de 1:1 con una parasitemia del 1 % en una placa de 96 pocillos (200 μl por pocillo) y se mantuvieron durante 30 días. Cada uno de los ensayos contenía tres réplicas biológicas (tres clones independientes de diferentes experimentos de edición CRISPR-Cas9) y dos réplicas técnicas (dos pocillos de cultivo). Cada 2 días, la parasitemia se evaluó por microscopía utilizando portaobjetos teñidos con Giemsa, se tomaron muestras y se almacenaron a -80 °C y los cultivos se diluyeron al 1 % de parasitemia con glóbulos rojos frescos y medio. La proporción de parásitos en cada competición (Datos ampliados, Fig. 10) se midió mediante un ensayo rhAmp SNP (Integrated DNA Technologies) con cebadores dirigidos a la región editada con CRISPR-Cas9 en pfaat1.

Medimos el (los) coeficiente (s) de selección ajustando un modelo lineal entre el logaritmo natural de la proporción de alelos (frecuencia (parásito editado con alelo)/frecuencia (NHP4026)) y el tiempo (medido en ciclos asexuales de parásitos de 48 h). La pendiente del modelo lineal proporciona una medida de la conducción s de cada mutación65. Para comparar la aptitud relativa de los parásitos que portan diferentes alelos pfaat1, normalizamos la aptitud de NHP4026 a 1 y usamos la pendiente + 1 para cuantificar la aptitud de los parásitos editados con CRISPR-Cas9 (Fig. 5c).

Para generar la levadura que expresa pfAAT1, el plásmido que lleva la secuencia codificante de pfaat1 se transformó en la levadura Saccharomyces cerevisiae (BY4743) como se describió previamente27. El tiempo de duplicación (h) se midió para las cepas que portan el vector vacío, WT pfAAT1 o pfAAT1 mutante S258L. Medimos el tiempo de duplicación en dos condiciones de cultivo: control o con CQ 1 mM. Se realizaron tres experimentos independientes para cada ensayo.

Los modelos de homología tridimensional para pfAAT1 se predijeron utilizando AlphaFold29,66 e I-TASSER30,67,68 y se analizaron con el software PyMol (v2.3.0; Schrödinger, LLC). En el nivel de secuencia primaria, usamos TOPCONS32 para predecir la topología de hélice transmembrana para comparar. Trazamos una versión de dibujos animados de la topología transmembrana de la proteína basada en las estructuras predichas computacionalmente y la topología de la membrana (Datos extendidos Fig. 9). Los modelos se truncaron para excluir los residuos amino-terminales 1–166, probablemente ubicados fuera de la membrana, porque AlphaFold asigna poca confianza a este tramo N-terminal. Además, las mutaciones de interés se asignan solo a las hélices transmembrana según los modelos 3D y TOPCONS. I-TASSER generó modelos con una topología similar a AlphaFold con las variaciones más altas en las regiones de baja confianza de AlphaFold 1–166 y 475–516. Los cinco mejores modelos I-TASSER se superponen al modelo AlphaFold con un rango de desviación cuadrática media de 2,4–2,8 Å sobre 303–327 de 440 residuos alineados utilizando el servidor PDBeFold (http://www.ebi.ac.uk/msd -srv/ssm). Los cuatro SNP comunes (S258L, F313S, Q454E y K541L) se superponen estrechamente entre los modelos de homología. Evaluamos el efecto de diferentes mutaciones en la estabilidad de la proteína utilizando la función de mutagénesis en PyMol.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de secuenciación sin procesar se enviaron al Archivo de lectura de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica (SRA, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) o al Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con números de acceso disponibles en Tablas complementarias 1 y 2. Todos los demás datos están disponibles en el texto principal o en materiales complementarios. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código utilizado en el análisis y los datos analizados están disponibles en GitHub a través de los siguientes enlaces: https://github.com/emilyli0325/CQ.AAT1.git (XL), https://github.com/MPB-mrcg?tab= repositorios (AA-N.) y https://github.com/kbuttons/CQ.AAT1.progeny.git (KAB-S.).

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Agradecemos al personal anterior y actual y a los investigadores visitantes de la Unidad MRC en Gambia involucrados en estudios de los cuales se archivaron muestras, incluidos aquellos bajo las direcciones anteriores de B. Greenwood y T. Corrah. El trabajo en el Instituto de Investigación Biomédica de Texas se llevó a cabo en instalaciones construidas con el apoyo de la subvención C06 RR013556 del Programa de Mejoramiento de Instalaciones de Investigación. Shoklo Malaria Research Unit es parte de la Mahidol Oxford University Research Unit apoyada por Wellcome Trust of Great Britain. Agradecemos al personal de las instalaciones de Informática, Secuenciación y Logística de Muestras del Instituto Wellcome Trust Sanger por sus contribuciones. El Núcleo de Biología Estructural del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio es parte de los Núcleos de Investigación Institucional respaldados por la Oficina del Vicepresidente de Investigación, el Instituto de Investigación del Cáncer Infantil Greehey y el Centro de Cáncer Mays, Descubrimiento de Fármacos y Biología Estructural de Recursos Compartidos (Subvención NIH P30 CA054174). Financiamiento: NIH subvención P01 12072248 (MTF); subvención NIH R37 AI048071 (TJCA); Beca de desarrollo profesional MRC MC_EX_MR/K02440X/1 (AA-N.); subvención del programa de malaria MRC MC_EX_MR/J002364/1 (UDA); Subvención del Consejo Europeo de Investigación AdG-2011-294428 (DC y AA-N.); Subvención MRC MR/S009760/1 (DC); Wellcome Trust (206194 y 204911) y la Fundación Bill & Melinda Gates (OPP1204628 e INV-001927) (DK); Beca del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas BB/M022161/1 (SVA); y Wellcome Trust (número de concesión 220221) (FHN). Para fines de acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío.

Estos autores contribuyeron igualmente: Alfred Amambua-Ngwa, Katrina A. Button-Simons, Xue Li, Sudhir Kumar, Katelyn Vendrely Brenneman.

Unidad MRC Gambia en la Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres, Banjul, Gambia

Alfred Amambua-Ngwa y Umberto D'Alessandro

Instituto Eck para la Salud Global, Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Notre Dame, Notre Dame, IN, EE. UU.

Katrina A. Button-Simons, Katelyn Vendrely Brenneman, Lisa A. Checkley, Douglas A. Shoue, Haley Dalhoff, James K. Larbalestier y Michael T. Ferdig

Programa de Prevención e Intervención de Enfermedades, Instituto de Investigación Biomédica de Texas, San Antonio, TX, EE. UU.

Xue Li, Marco Ferrari, Marina McDew-White, Ann Reyes, Elizabeth Delgado y Timothy JC Anderson

Centro para la Investigación Global de Enfermedades Infecciosas, Instituto de Investigación Infantil de Seattle, Seattle, WA, EE. UU.

Sudhir Kumar, Meseret T. Haile, Stefan HI Kappe y Ashley M. Vaughan

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Nottingham, Nottingham, Reino Unido

Sarah M. Tindall y Simon V. Avery

Instituto Wellcome Sanger, Hinxton, Reino Unido

Roberto Amato, Richard D. Pearson y Dominic Kwiatkowski

Departamento de Bioquímica y Biología Estructural, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio, Antonio, TX, EE. UU.

alexander b taylor

Unidad de Investigación de Malaria Shoklo, Unidad de Investigación de Medicina Tropical Mahidol-Oxford, Universidad de Mahidol, Mae Sot, Tailandia

François H. Nosten

Centro de Medicina Tropical y Salud Global, Departamento de Medicina de Nuffield, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

François H. Nosten

Programa de Interacciones entre Patógenos y Huéspedes, Instituto de Investigación Biomédica de Texas, San Antonio, TX, EE. UU.

Ian H. Cheeseman

Departamento de Pediatría, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Stefan HI Kappe y Ashley M. Vaughan

Departamento de Salud Global, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Capa Stefan HI

Departamento de Biología de Infecciones, Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres, Londres, Reino Unido

David J. Conway

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AA-N., KAB-S., XL, SK y KVB contribuyeron igualmente a este trabajo. Conceptualización: MTF, TJCA, IHC, AMV, AA-N. y DJC Metodología: AMV, SK, SVA y ABT Investigación: AA-N., UD, DK, DJC, RA, RDP, KAB-S., KVB, MM-W., MTH, LAC, HD, JKL, AR, Análisis ED, SK, DAS, SMT, MF, ABT y TJCA: XL, KAB-S. y AA-N. Visualización: XL, KAB-S. y AA-N. Adquisición de fondos: MTF, TJCA, DJC, AA-N., DK, SVA y FHN Administración de proyectos: MF, DK, AA-N., DJC y SVA Supervisión: MF, AMV, TJCA, IHC, SHIK, SVA, DK y Redacción de DJC: borrador original: KVB, TJCA, KAB-S. y XL Redacción: revisión y edición: MTF, AMV, IHC, SK, AA-N., DJC, DK, UD, RDP, SHIK, FHN, ABT y TJCA

Correspondencia a Ashley M. Vaughan, Michael T. Ferdig o Timothy JC Anderson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Liwang Cui, Carol Sibley y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

p es la frecuencia de los alelos mutantes (pfaat1 S258L o pfcrt K76T) como se indica en la Fig. 1a, y q (= 1-p) es la frecuencia inferida de los alelos de tipo salvaje (3D7). El eje x indica las generaciones de parásitos (etiquetadas con el año de recolección de la muestra). Estimamos los coeficientes de selección (s) basados ​​en la frecuencia alélica de los años 1990 y 2001, ya que la monoterapia con CQ se detuvo en Gambia en 2004. s indica los cambios en el crecimiento relativo por generación de parásitos (es decir, la duración del ciclo de vida completo tanto en mosquitos como en mosquitos). huésped humano). El cálculo se basó en estimaciones de 2, 4 o 6 generaciones por año.

Las relaciones de haplotipos se basaron en la identidad por descendencia de los segmentos del genoma que abarcan 25 kb a cada lado de cada gen (ver métodos). Los haplotipos unidos por líneas indican >90 % de EII. Cada punto representa un aislamiento con puntos de colores que representan los años de los que fueron muestreados. Los puntos cuadrados representan infecciones complejas y los círculos representan monoclonales. MOI, multiplicidad de infección.

Los paneles AH muestran la proporción de pares de IBD representados en el genoma para parásitos de diferentes regiones geográficas (marcados en la parte superior izquierda de cada panel). Para las muestras en las que >90 % de los genomas son EII, solo se seleccionó y utilizó para el análisis de EII una muestra representativa con la tasa de genotipos más alta. Los números de muestra se muestran en cada panel. Los límites cromosómicos se indican con líneas verticales discontinuas grises. La ubicación de pfaat1 y pfcrt se indica con flechas rojas en la parte superior de cada panel. El pico de chr 10 (África Occidental, A) contiene pfmspdbl2 asociado con una menor sensibilidad a la halofantrina, la mefloquina y la lumefantrina69. El pico de chr 8 (África Oriental y Asia (CH)) contiene dihidropteroato sintasa (resistencia a la sulfadoxina)70 y el pico de chr 12 (DF) contiene GTP ciclohidrolasa I, un locus compensatorio para los fármacos antifolatos71. Véanse también los análisis de Amambua-Ngwa et al.17, Hendon et al.18 y Carrasquilla et al.19.

A. Distribución del alelo pfcrt en los países africanos. Distribución del alelo B. pfaat1 en países africanos. C. Correlaciones en las frecuencias alélicas entre pfcrt (CVIET) y pfaat1 (S258L). Las frecuencias del haplotipo CVIET para los aminoácidos 72-76 en pfcrt están significativamente correlacionadas con las frecuencias alélicas de pfaat1 S258L en África occidental (R2 = 0,65, p = 0,0017, línea discontinua roja) o en todas las poblaciones africanas (R2 = 0,44, p = 0,0021). El tamaño del punto indica los números de muestra, mientras que el color indica las ubicaciones de muestreo. Usamos la prueba t para establecer si el estadístico r de Pearson difiere significativamente de cero.

El árbol estaba enraizado con Plasmodium reichenowi (no se muestra en el árbol). WAF: África occidental, EAF: África oriental, CAF: África central, SM: América del Sur, ESEA: Sudeste (SE) asiático oriental, SA: Asia meridional, WSEA: Sudeste asiático occidental, PO: región del Océano Pacífico.

Datos fuente

Los tratamientos con CQ se aplicaron a las agrupaciones el día 0 a 0 (control), 50, 100 o 250 nM. CQ se eliminó el día 2 (tratamiento de 48 horas) o el día 4 (tratamiento de 96 horas), sombreado con azul claro. Para los tratamientos de CQ de 48 horas, se recogieron muestras los días 0, 4 y 7; mientras que para el tratamiento CQ de 96 horas, las muestras se recolectaron los días 0, 5 y 10. Las líneas continuas o discontinuas son resultados de diferentes réplicas técnicas. Las frecuencias del alelo 3D7 en los grupos tratados con CQ disminuyen en las regiones QTL chr.6 y chr.7. En la región QTL chr.14, las frecuencias alélicas no muestran cambios tras el tratamiento farmacológico, lo que sugiere que este QTL no está relacionado con el tratamiento farmacológico.

La edición de genes CRISPR/Cas9 resultó en pequeñas diferencias en IC50 para quinina (QN), lumefantrina (LUM) y amodiaquina (AMD), pero no hubo cambios significativos para mefloquina (MQ). Sin embargo, todos los IC50 estuvieron por debajo de los niveles de importancia clínica para estos fármacos (umbrales clínicos: QN = 600 nM72; MQ = 30 nM72, AMD = 60 nM72), o en el extremo inferior del rango in vitro (0-150 nM) en el caso de LUM73. El número de réplicas biológicas se muestra encima del eje x. Los valores de P indican niveles de significación y se basan en análisis ANOVA de dos vías. Los datos se presentan como valores medios +/− SEM.

Datos fuente

El tiempo de duplicación de la levadura se calculó a partir de la porción lineal del crecimiento exponencial. Los datos se mostraron como medias de 3 experimentos independientes ± SEM, y la significación se calculó de acuerdo con comparaciones múltiples (con correcciones de Turquía) de ANOVA de dos vías. El crecimiento de las células de levadura que expresan pfaat1 de tipo salvaje (WT) se ve gravemente afectado por el tratamiento con CQ (CQ 1 mM a través de los experimentos), pero se recupera en levaduras que expresan pfaat1 S258L. Los resultados publicados demuestran que AAT1 se expresa en la membrana celular de levadura27, mientras que pfAAT1 se localiza en la membrana vacuolar digestiva43 y también puede estar presente en la membrana plasmática35.

(A) Modelo AlphaFold de PfAAT1 (izquierda), modelo I-TASSER representativo de PfAAT1 (centro), superposición estructural del modelo AlphaFold (verde azulado) y modelo I-TASSER (gris, derecha). Las predicciones de topología de hélice transmembrana (TM) de TOPCONS se asignan a los modelos en azul oscuro (izquierda, centro). Los modelos AlphaFold e I-TASSER se alinean con un RMSD de 2,5 Å sobre 327 de 440 residuos. Los residuos amino-terminales 1-166 se excluyeron de todos los modelos debido a la baja confianza en la predicción de la estructura. (B) Vista detallada de las mutaciones en la estructura tridimensional de PfAAT1 predicha utilizando el modelo AlphaFold. La vista derecha está relacionada con la izquierda por una rotación de 45° sobre el eje que mira hacia abajo a la figura seguida de una rotación de 90° sobre el eje horizontal. Los cuatro SNP que se muestran como modelos que llenan el espacio están dispuestos dentro de un plano a un lado del modelo, perpendicular a la membrana. S258L (hélice 3) y F313S (hélice 5) están ubicados uno frente al otro con la hélice 8 en el medio. Dadas las interacciones epistáticas entre los SNP PfAAT1 S258L y F313S evidentes a partir de nuestros análisis funcionales, la sustitución de F313S de la voluminosa fenilalanina hidrofóbica con la serina polar más pequeña puede compensar una interrupción en la región transmembrana que incluye las hélices 3, 5 y 8 permitiendo potencialmente la restauración parcial de la actividad de transporte de aminoácidos predicha. Q454E está ubicado en la hélice 8 cerca de la superficie TM y K541N está ubicado en un bucle que conecta las hélices 9 y 10. (C) Topología de PfAAT1 inferida usando una estructura 3D. Hay once hélices transmembrana (TM). Tres de las mutaciones están ubicadas en las hélices TM, mientras que K541N está ubicada en un bucle que conecta las hélices 9 y 10. El esquema de colores coincide con el esquema en el Panel B. El triángulo azul indica los residuos amino-terminales 1-166 que fueron excluidos de la estructura predicción.

Usamos tres clones independientes editados con CRISPR/Cas9 para cada genotipo y dos réplicas técnicas para cada experimento de competencia (valores promedio trazados).

Figs suplementarias. 1–7.

Tabla complementaria 1. Números de acceso, ID de muestra y alelos para las muestras de Gambia en el codón 258 de pfaat1 y el codón 76 de pfcrt, respectivamente. Tabla complementaria 2. Muestras utilizadas en el estudio de evolución y alelo pfaat1. Tabla complementaria 3. Resumen de los genotipos de parásitos parentales. Tabla complementaria 4. Información y números de acceso para muestras cruzadas. Tabla complementaria 5. Genes dentro de las regiones QTL. Tabla complementaria 6. SNP e indels dentro de las regiones chr.6 QTL. Tabla complementaria 7. Progenie recombinante única del cruce genético 3D7 × NHP4026 sin selección de CQ. Tabla complementaria 8. Datos de CQ IC50 para progenie seleccionada.

Recuento de alelos y proporciones de mutantes por año de muestreo en Gambia para los codones pfaat1 258 y pfcrt 76. Datos de IC50 para el parásito editado con CRISPR/Cas9. Datos de IC50 de amodiaquina, mefloquina, lumefantrina y quinina para parásitos editados con CRISPR/Cas9. Tiempos de duplicación de células (h), determinaciones por triplicado.

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Reimpresiones y permisos

Amambua-Ngwa, A., Button-Simons, KA, Li, X. et al. La evolución de la resistencia a la cloroquina en Plasmodium falciparum está mediada por el supuesto transportador de aminoácidos AAT1. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01377-z

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Recibido: 26 julio 2022

Aceptado: 29 de marzo de 2023

Publicado: 11 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01377-z

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