La lipoproteína de la pared celular CD1687 actúa como una proteína de unión al ADN durante la desoxicolato.

npj Biofilms and Microbiomes volumen 9, Número de artículo: 24 (2023) Citar este artículo

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La capacidad de los patógenos bacterianos para establecer infecciones recurrentes y persistentes se asocia frecuentemente con su capacidad para formar biopelículas. Las infecciones por Clostridioides difficile tienen una alta tasa de recurrencia y recaídas y se supone que las biopelículas están involucradas en su patogenicidad y persistencia. La formación de biopelículas por C. difficile aún no se conoce bien. Se ha demostrado que moléculas específicas como el desoxicolato (DCA) o el metronidazol inducen la formación de biopelículas, pero los mecanismos involucrados siguen siendo difíciles de alcanzar. En este estudio, describimos el papel de la lipoproteína CD1687 de C. difficile durante la formación de biopelícula inducida por DCA. Mostramos que la expresión de CD1687, que es parte de un operón dentro del grupo de genes CD1685-CD1689, está controlada por múltiples sitios de inicio de transcripción y algunos se inducen en respuesta a DCA. Solo se requiere CD1687 para la formación de biopelículas y la sobreexpresión de CD1687 es suficiente para inducir la formación de biopelículas. Usando el análisis RNAseq, mostramos que CD1687 afecta la expresión de los transportadores y las vías metabólicas e identificamos varios socios de unión potenciales mediante un ensayo desplegable, incluidas las proteínas extracelulares asociadas al transporte. Luego demostramos que CD1687 está expuesto en la superficie en C. difficile, y que esta localización es necesaria para la formación de biopelículas inducidas por DCA. Dada esta localización y el hecho de que C. difficile forma biopelículas ricas en eDNA, confirmamos que CD1687 se une al ADN de manera no específica. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que CD1687 es un componente de la respuesta posterior a DCA que conduce a la formación de biopelículas al promover la interacción entre las células y la matriz de biopelículas mediante la unión de eDNA.

Las infecciones gastrointestinales son un importante problema de salud pública. En los países de ingresos altos, el anaerobio grampositivo formador de esporas Clostridioides difficile es la principal causa de diarrea y colitis nosocomiales en adultos que reciben tratamientos con antibióticos1,2. Además, las infecciones por C. difficile (CDI) pueden ser persistentes, lo cual es un desafío importante en el manejo de la CDI después de anti-C. difícil tratamiento antibiótico. La ICD recurrente ocurre en más del 20% de los pacientes que reciben antibióticos para tratar su primer episodio de ICD y esta tasa aumenta después de nuevos episodios3,4. Las causas de las recurrencias no se han dilucidado completamente. La recurrencia puede ser causada por una reinfección con una nueva cepa o una recaída con la misma cepa, lo que sugiere que C. difficile puede persistir en el tracto gastrointestinal5. Las recaídas se correlacionaron inicialmente con la capacidad de C. difficile para esporular durante la infección y resistir el tratamiento con antibióticos6,7. Sin embargo, también se supone que las recaídas están asociadas con la persistencia de C. difficile como biopelícula8,9. Se sabe que las infecciones persistentes y crónicas causadas por diferentes patógenos están asociadas con la formación de biopelículas10. Se estima que al menos el 60% de todas las infecciones bacterianas nosocomiales y crónicas están asociadas a biopelículas11. En apoyo de esta hipótesis, recientemente se demostró que C. difficile integra biopelículas formadas por la microbiota colónica y esta biopelícula actuó como reservorio para la persistencia y recurrencia en un modelo de laboratorio de CDI9.

Los biofilms son comunidades estructuradas de microorganismos asociados con superficies y encerrados en una matriz extracelular de producción propia, que varía entre las especies bacterianas12. C. difficile puede formar biopelículas como una sola especie o con otras bacterias en varias superficies abióticas y varios sistemas in vitro9,13,14,15. Además, C. difficile puede integrar comunidades de múltiples especies in vivo durante una infección en ratones, lo que sugiere su capacidad para integrar biopelículas mucosas16. Además, C. difficile puede formar estructuras similares a biopelículas ricas en glicanos en parches en un modelo de ratón monoasociado17. Aunque C. difficile puede integrar biopelículas de múltiples especies en el tracto gastrointestinal, existe un conocimiento limitado sobre la biología de la formación de biopelículas de C. difficile en respuesta al entorno gastrointestinal. Durante una infección, los patógenos se encuentran con varios factores ambientales, incluida la presencia de antibióticos, sales biliares, presión osmótica y diversas fuentes de nutrientes, y se sabe que estos son señales importantes para la formación de biopelículas durante la colonización18,19. Curiosamente, C. difficile enfrentaría diferentes desafíos durante la disbiosis, ya que cambia el entorno nutricional, el metabolismo de las sales biliares y el estrés osmótico y oxidativo/nitrosativo20. Cualquiera de estos factores podría inducir la formación de biopelículas. Por ejemplo, las concentraciones subinhibitorias de los antibióticos utilizados para tratar la CDI mejoran la formación de biopelículas in vitro21,22. Además, recientemente demostramos que las concentraciones subinhibitorias de la sal biliar secundaria desoxicolato (DCA) mejoran la formación de biopelículas de C. difficile15. En la biopelícula inducida por DCA, las células vegetativas están protegidas de la toxicidad del DCA, así como de los antibióticos y péptidos antimicrobianos15. Mostramos que las biopelículas inducidas por DCA se forman debido a la adaptación y reprogramación metabólica que dependen de los nutrientes disponibles y los metabolitos excretados. En general, el piruvato excretado es fundamental para la inducción de la formación de biopelículas23.

Además de los factores ambientales que inducen la formación de biopelículas, se ha demostrado que varios factores celulares, incluidos los componentes y reguladores de la superficie celular, influyen en la formación de biopelículas por parte de C. difficile24. Entre los genes que aumentaron en respuesta a DCA, un gen que codifica una lipoproteína (CD1687) es esencial para la formación de biopelículas en respuesta a DCA15. El objetivo de este estudio fue caracterizar el papel de CD1687 durante la formación de biopelículas por C. difficile en respuesta a DCA. Demostramos que CD1687 está expuesto y activo en la superficie de la bacteria y que se une al ADN in vitro. Esto sugiere que CD1687 actúa como una proteína que ancla las células al ADN extracelular (eDNA) presente en la matriz del biofilm.

En experimentos transcriptómicos anteriores, observamos que la mayoría de los genes en el grupo CD1685-CD1689 estaban regulados positivamente en la biopelícula inducida por DCA de 48 h formada por C. difficile cepa 630∆erm15,23. Sin embargo, la inactivación de CD1687 pero no de CD1688 impidió la formación de biopelículas inducidas por DCA. Para verificar que los genes CD1685-CD1689 formaban un operón, se realizaron experimentos de RT-PCR con ARN extraído de células cultivadas en condiciones inductoras de biopelícula (BHISG con 240 µM DCA). Observamos una transcripción única que abarca desde CD1685 hasta CD1689, lo que sugiere la presencia de al menos un ARNm policistrónico en este locus (Fig. 1a). Luego realizamos qRT-PCR para confirmar que los cinco genes se regularon positivamente a las 48 h en presencia de DCA y solo se observaron pequeñas diferencias en los cambios de pliegue (Figura 1a complementaria).

a.RT-PCR realizada con los cebadores EA043 y EA027 (Tabla complementaria 1) de varias plantillas de ácido nucleico. El ADNc se obtuvo utilizando el cebador EA027 con el ARN total extraído de biopelículas de 48 h cultivadas en BHISG complementado con DCA (240 µM). b 5'RACE resulta de la amplificación del ADNc poliguanilado obtenido, respectivamente, con los cebadores EA021 y EA018 (Tabla complementaria 1), luego los cebadores P1686 o P1687 junto con el cebador de amplificación universal (AAP) del kit 5'RACE . El ARN se extrajo de cultivos celulares de 48 h cultivados en condiciones inductoras de biopelículas (BHISG + 240 µM DCA) o condiciones no inductoras de biopelículas (BHISG). c Organización del grupo CD1685-CD1689, la ubicación de los cebadores usados para RT-PCR y los amplicones de los resultados de 5'RACE usando los cebadores P1686 o P1687 (los tamaños de los amplicones se predijeron a partir del TSS identificado por Soutourina et al. (2020) ) y Fuchs et al. (2021). TSS: Sitio de inicio transcripcional; ADNc: ADN complementario; ADNg: ADN genómico. Las transferencias en a y b derivan de los mismos experimentos y no se procesaron.

Al observar nuestros experimentos anteriores de RNAseq, observamos un sesgo de mapeo de las lecturas de secuenciación que favorecen a CD1687, CD1688 y CD1689 (Figura complementaria 1b). Curiosamente, análisis recientes predijeron tres sitios de inicio de transcripción (TSS) para el locus CD1685-CD1689: uno aguas arriba del gen CD1685 (TSS1), uno aguas arriba del gen CD1686 (TSS2) y uno en la secuencia codificante de CD1686 (TSS3)25 ,26 (figura 1c). Para confirmar la existencia de múltiples TSS, se realizaron experimentos 5'-RACE con ARN total extraído de células cultivadas durante 48 h en BHISG con DCA (es decir, inductora de biopelícula) o sin DCA (es decir, no inductora de biopelícula). Las transcripciones inversas iniciales se realizaron con dos cebadores hibridando la secuencia codificante de CD1686 (P1686) o la secuencia codificante de CD1687 (P1687) (Fig. 1b, c). En ausencia de DCA, solo se observó un amplicón, que está asociado con el TSS dentro de CD1686. Este amplicón fue detectable cuando se usó el cebador P1686 pero no con el cebador P1687. En presencia de DCA, observamos amplicones correspondientes a los tres TSS predichos con cualquiera de los cebadores (P1686 o P1687) y se detectaron dos amplicones adicionales con P1687. Esto sugiere que estos dos TSS adicionales (TSSa y TSSb; Fig. 1c) están activos en presencia de DCA y uno de estos (TSSa) parece ser el más activo de todos los TSS (Fig. 1b). Se secuenció cada amplicón (Tabla complementaria 2) y la ubicación de TSS1, TSS2 y TSS3 coincidió estrechamente con su ubicación predicha. Sin embargo, la gran variación de las secuencias de TSSa y TSSb dificultó la identificación de su ubicación exacta. En general, la transcripción del operón CD1685-CD1689 se inicia a partir de múltiples TSS en presencia de DCA, lo que sugiere que se integran múltiples factores para regular la expresión del operón CD1685-1689 para reflejar el estado de la población bacteriana.

Anteriormente inactivamos CD1687 utilizando el sistema Clostron15, pero se sabe que este enfoque tiene algunas limitaciones. Para confirmar que solo se requería CD1687 para la formación de biopelículas, se generaron eliminaciones de CD1686, CD1687 y CD1688-CD1689 (Figura complementaria 2a). Como se observó anteriormente, solo la eliminación de CD1687 afectó negativamente la formación de biopelículas y la complementación restauró el fenotipo (Figura complementaria 2bc). Curiosamente, la eliminación de CD1686 eliminó TSS3, TSSa y TSSb, lo que sugiere que TSS1 y/o TSS2 son suficientes para la transcripción de CD1687 en presencia de DCA, lo que da como resultado la formación de biopelículas.

Dado que se requiere CD1687 para la formación de biopelículas inducidas por DCA y previamente localizado en la fracción de la pared celular15, planteamos la hipótesis de que CD1687 es una proteína detectora de DCA. Para probar esta hipótesis, verificamos la capacidad de CD1687 para interactuar directamente con DCA usando resonancia de plasmones de superficie. Mostramos que CD1687 puede interactuar con DCA (Figura 3 complementaria). Sin embargo, la constante de disociación es alta (Kd de 1,65 ± 0,58 mM), y la estequiometría estimada de la interacción es de 5 ± 1 moléculas DCA para una proteína CD1687, lo que implica que la interacción no es específica.

Curiosamente, observamos un aumento en la formación de biopelículas en presencia y, hasta cierto punto, en ausencia de DCA cuando el mutante ∆1687 se complementó con un CD1687 transmitido por un plásmido inducible (pDIA6920) (Figura complementaria 2C). Aunque el aumento no fue significativo, sugirió que CD1687 podría inducir la formación de biopelículas en ausencia de DCA. Para probar esta hipótesis, se introdujo pDIA6920 en la cepa de tipo salvaje y se evaluó su capacidad para formar biopelículas en ausencia de DCA con y sin la adición del inductor ATC. Cuando se sobreexpresó CD1687, se detectó una biopelícula más fuerte a las 24 hy 48 h (Fig. 2). En conjunto, nuestros resultados sugieren que la expresión de CD1687 es fundamental para la formación de biopelículas que no requieren DCA para su actividad.

La formación de biopelículas se analizó 24 horas o 48 horas después de la inoculación en BHISG +/- ATC (100 ng/mL) con la cepa de tipo salvaje (630Δerm) que contenía un vector vacío de control (pDIA6103) o el vector que permitía la expresión de CD1687 bajo el promotor Ptet inducible (pDIA6920). Cada punto de datos representa una réplica biológica independiente compuesta de 2 a 4 réplicas técnicas. El diagrama de caja utilizado para representar datos cuantitativos representa la mediana, el mínimo, el máximo y los cuartiles superior e inferior. Los asteriscos indican significación estadística con una prueba ANOVA de una vía seguida de una prueba de comparación múltiple de Tukey (ns: no significativa; ****p < 0,0001).

Como CD1687 es esencial para la formación de biopelículas inducidas por DCA y su sobreexpresión puede inducir la formación de biopelículas en ausencia de DCA, buscamos identificar genes cuya expresión se modifica en presencia de CD1687 durante el proceso de formación de biopelículas. Para hacerlo, realizamos dos análisis transcriptómicos: uno comparando el tipo salvaje y el mutante ∆1687 cultivado en presencia de DCA durante 24 h, y el segundo comparando el tipo salvaje que contiene el plásmido inducible CD1687 (pDIA6920) o un vector vacío, ambos crecieron en ausencia de DCA y en presencia de ATC como inductor durante 24 h.

Un total de 527 genes tuvieron una expresión diferencial significativa con un cambio de veces <0,5 o >2 en la cepa de tipo salvaje en comparación con el mutante ∆1687 en condiciones inductoras de biopelículas (+DCA) (Fig. 3). En presencia de DCA, CD1687 parece regular principalmente a la baja la reticulación de la pared celular (vanY2Y3), así como varios reguladores no caracterizados (Figura 4 complementaria, Tabla complementaria 3). Parece haber un cambio en los transportadores de membrana que puede resultar en un aumento en la importación de aminoácidos de cadena ramificada, hierro y un cambio en el transporte de azúcar (Tabla complementaria 3). En términos de metabolismo, las células pasan de la utilización de succinato (CD2338-CD2344), la vía Wood-Ljungdahl y la biosíntesis de aminoácidos aromáticos a la fermentación de acetoína, leucina, aminoácidos de cadena ramificada y glicina (Figura 4 complementaria). , Tabla complementaria 3).

Diagrama de Venn de los genes regulados diferencialmente en los dos experimentos de transcriptómica realizados en este estudio (Tabla complementaria 4).

Cuando se sobreexpresó CD1687, 809 genes se expresaron diferencialmente, 343 genes se regularon al alza y 466 se regularon a la baja (Fig. 3). Como se describe en la Figura complementaria 4, los cambios en la expresión génica indican un cambio en los transportadores, el metabolismo y la regulación. Específicamente, la expresión de varios transportadores de azúcar aumenta, mientras que la expresión de los transportadores de aminoácidos de cadena ramificada, metionina, alanina y glicina está regulada a la baja (Tabla complementaria 3). En términos de metabolismo, los genes involucrados en la utilización de acetoína, las fermentaciones de Stickland que involucran aminoácidos aromáticos o leucina, la vía de Wood-Ljungdahl y la vía de las pentosas fosfato están reguladas al alza, así como aquellos involucrados en la biosíntesis de varios aminoácidos como histidina, isoleucina , valina y cisteína (Tabla complementaria 3). El operón dltABCD está regulado positivamente, lo que sugiere un aumento de la D-alanilación de los ácidos teicoicos (dltABCD). Curiosamente, notamos que el grupo de genes que codifica el flagelo y los genes asociados con la esporulación estaban regulados al alza.

Cuando comparamos ambos análisis transcriptómicos, pocos genes se superpusieron entre ambos análisis. Solo 69 genes cambiaron en la misma dirección mientras que 47 genes se regularon en dirección opuesta (Fig. 3). Los 1220 genes restantes se expresaron diferencialmente solo en cualquiera de las condiciones (Fig. 3). Los genes que se regularon en ambas condiciones incluyen los implicados en la síntesis de cisteína (cysE, cysK), la utilización de leucina en la fermentación de Stickland (hadABCI), la fermentación de acetoína (acoABCL), las proteínas de la pared celular (cwp9, cwp12), algunos transportadores (alsT que transportan alanina o glicina, rbsK transportando ribosa) y regulación (sinRR'). En general, esto sugiere que CD1687 induce la reorganización metabólica, incluidas las que ocurren en respuesta a DCA que conducen a la formación de biopelículas23.

Sin embargo, estos cambios no se alinean completamente con nuestros análisis previos23. Anteriormente observamos que el DCA provoca la regulación positiva del gen involucrado en las fermentaciones de butanoato, lactato y acetato, un cambio en las fermentaciones Stickland del uso de aminoácidos aromáticos al uso de aminoácidos de cadena ramificada y glicina, y la regulación negativa de genes implicados en la glucólisis, la ingesta de glucosa y la esporulación23. Estos cambios no se observaron cuando se sobreexpresó CD1687, lo que sugiere que CD1687 no está involucrado en esos procesos o no interviene en la respuesta inmediata a DCA. CD1687 es probablemente parte de la respuesta aguas abajo y puede interactuar con otras proteínas para promover estos cambios.

Dado que CD1687 es una proteína de la pared celular15 que no tiene un dominio transmembrana pero que probablemente está anclada a la membrana de la superficie celular a través de un ancla de miristoilo27, planteamos la hipótesis de que CD1687 induce cambios transcripcionales al transmitir señales externas al interactuar con proteínas de membrana. Para encontrar estas proteínas potenciales, realizamos un ensayo desplegable utilizando extractos crudos de células de C. difficile que sobreexpresan un CD1687 marcado con hexahistidina C-terminal en BHISG sin DCA (Tabla complementaria 5). Se compararon con extractos de control recogidos de un mutante ∆1687 de C. difficile con el vector vacío en las mismas condiciones. Entre las 43 proteínas identificadas solo en las muestras de prueba y no en las muestras de control, que incluían la proteína CD1687 (Tabla complementaria 5), se prevé que cuatro sean proteínas de membrana e incluyan un componente del transportador de azúcar (CD2667) y un simportador de sodio ( CD2693). También identificamos cuatro proteínas que pertenecen a la gran familia de proteínas de unión a solutos asociadas con los transportadores ABC y una fosfodiesterasa de nucleótidos (CD0689). Estas cinco proteínas podrían estar involucradas en el transporte de señales y la respuesta celular, lo que lleva a la adaptación en diferentes condiciones ambientales28,29. Entre las proteínas de membrana, también encontramos una lipoproteína putativa (CD0747) y una proteína de la familia LCP (LytR-CpsA-Psr) (CD2766) involucradas en el ensamblaje de polisacáridos de la pared celular30. Notamos que solo un gen codificante de proteínas asociadas (CD0037) estaba regulado al alza en ambos transcriptomas (Tabla complementaria 5), que generalmente se localiza en el citoplasma. Dado que la mayoría de las proteínas de membrana identificadas por el experimento desplegable son proteínas de la pared celular involucradas en el transporte de membrana, es posible que CD1687 afecte directamente el transporte de diferentes nutrientes y sea consistente con el efecto observado en nuestros transcriptomas.

Dado que se detectó CD1687 en la fracción de la pared celular15, nos preguntamos si CD1687 está expuesto en la superficie celular. Para verificar esto, realizamos un análisis de microscopía de epifluorescencia de la cepa 630Δerm de C. difficile y sus derivados utilizando anticuerpos policlonales de conejo producidos contra CD1687. Cuando se cultivó 48 h en BHISG con o sin DCA, no se observó señal en el mutante ∆1687 que confirma la especificidad de nuestro anticuerpo (Fig. 4 y Figura 5 complementaria). Para la cepa de tipo salvaje, observamos una señal débil cuando se cultivó en ausencia de DCA, lo que confirma que esta proteína se expresa en niveles bajos en condiciones que no inducen biopelículas. En presencia de DCA, la señal fue más fuerte en presencia de DCA, aunque la expresión de CD1687 no fue homogénea en la población. Por el contrario, la señal para CD1687 es homogénea en la población de la cepa ∆1687 complementada (Fig. 4 y Figura 5 complementaria). Como las células no se permeabilizaron durante el experimento y la PFA no afecta significativamente la permeabilidad de la membrana31, llegamos a la conclusión de que CD1687 se exporta a la pared celular y se expone en la superficie celular.

El análisis de microscopía de epifluorescencia in situ se realizó en biopelículas de 48 h cultivadas en BHISG + ATC (100 ng/mL) en presencia o ausencia de DCA (240 µM) como se indica. Las cepas analizadas fueron la cepa de tipo salvaje (630Δerm) que portaba el vector de control pDIA6103 y la cepa ∆1687 que portaba el plásmido con un CD1687 inducible (pDIA6920) o el plásmido de control (pDIA6103). El ADN se tiñe con DAPI (azul) y el CD1687 se marca con anticuerpos de conejo anti-CD1687 específicos detectados con un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con TexasRed (rojo). Las imágenes son representativas de tres réplicas biológicas y se tomaron con un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti (Nikon, Japón). Barra de escala: 10 µm.

Basándonos en la localización celular de CD1687, nos preguntamos si la adición de anticuerpos anti-CD1687 durante el crecimiento podría prevenir la formación de biopelículas inducidas por DCA. Como se muestra en la Fig. 5a, la adición de anticuerpos policlonales anti-CD1687 a células cultivadas en condiciones inductoras de biopelículas (BHISG + DCA 240 µM) inhibió fuertemente la formación de biopelículas de una manera dependiente de la dosis. No se observó ningún efecto inhibitorio cuando se usó un anticuerpo no específico no publicado a la concentración más alta de anti-CD1687 que inhibía la formación de biopelículas (datos no mostrados). Además, el crecimiento bacteriano no se vio afectado por los anticuerpos, independientemente de la concentración utilizada en los ensayos de biopelícula (Fig. 5b). Por lo tanto, la inhibición de la función extracelular de CD1687 previene la formación de biopelículas, lo que indica que CD1687 está expuesto en la superficie celular y que su presencia en la superficie de la pared celular es crítica para la formación de biopelículas inducidas por DCA.

Se analizó la formación de biopelículas de la cepa 630Δerm durante 48 h en BHISG con cultivos DCA (240 µM) en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpos de conejo anti-CD1687 (0,05 mg/ml a 0,2 mg/ml). b Cinética de crecimiento (OD600nm) del WT (630Δerm) en medio BHISG con PBS o DCA suplementado con diferentes concentraciones de anticuerpos de conejo anti-CD1687 (0.05 mg/mL a 0.2 mg/mL). Ac: anticuerpo; nsAb: anticuerpo no específico. c La estructura predicha de alphafold2 de CD1687 muestra un péptido señal N-terminal S (rojo) conectado al dominio α beta (púrpura) por un péptido enlazador (verde), con otro dominio β beta similar (amarillo) en la región C-terminal . d 48 h biopelículas formadas por varias cepas Δ1687 complementadas con un vector vacío (pDIA6103) o plásmidos que sobreexpresan el CD1687 completo (pDIA6920) o CD1687 truncado que carece de uno de los dos dominios eliminados (pDIA7242 y pDIA7243, Tabla complementaria 1) cultivados en BHISG con ATC (100 ng/ml) y DCA (240 µM). Cada punto de datos representa una réplica biológica independiente compuesta de 2 a 4 réplicas técnicas. Los diagramas de caja utilizados para representar datos cuantitativos representan la mediana, el mínimo, el máximo y los cuartiles superior e inferior. Los asteriscos indican significación estadística con una prueba ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunnett (a) (ns: no significativa; **p < 0.01) o la prueba de comparación múltiple de Tukey (d) (ns: no significativa; *** *p < 0,001).

Para obtener información sobre la estructura-función de CD1687, utilizamos el software AlphaFold232 para predecir la estructura de la proteína 3D de CD1687. Como se muestra en la Fig. 5c, CD1687 tiene un péptido señal N-terminal de hélice alfa y dos dominios beta putativos. Para buscar posibles funciones de los dominios beta, se analizó la estructura putativa de CD1687 en la base de datos Ekhidna a través del servidor Dali33, pero no se detectó ninguna función. Dado que la función de CD1687 podría asignarse a uno de los dos dominios beta, complementamos el mutante ∆1687 sobreexpresando CD1687 con cualquiera de los dos dominios eliminados y cultivando estas cepas en condiciones inductoras de biopelículas (BHISG + 240 µM DCA. Complementación del mutante no se observó, lo que indica que C. difficile necesita ambos dominios beta de CD1687 para formar biopelículas inducidas por DCA (Fig. 5d).

Dado que no identificamos una función potencial de la estructura de CD1687, buscamos determinar si CD1687 tiene una actividad de unión al ADN como se observa para las lipoproteínas de Staphylococcus aureus que promueven la formación de biopelículas dependientes de eDNA34. Dado que la matriz de biopelícula de C. difficile se compone principalmente de eDNA15, probamos la capacidad de CD1687 para unirse al ADN mediante la realización de un ensayo de cambio de electromovilidad (EMSA). Cuando la proteína CD1687 purificada se incubó con el plásmido pUC9 de ADN de E. coli o un amplicón generado por PCR producido a partir de ADN de C. difficile (de una secuencia en la región de CD1438), observamos que la migración del ADN se desplazó por la la presencia de CD1687 y el aumento de la concentración de CD1687 se correlaciona con una mayor retención (Fig. 6a, b). Sin embargo, no observamos un cambio cuando CD1687 se inactivó con calor o si se usó BSA como control a la concentración más alta de CD1687 que cambia fragmentos de ADN. Para probar si CD1687 permite el anclaje de las bacterias al eDNA, realizamos un experimento de unión al ADN utilizando bacterias C. difficile completas (Fig. 6d). Vinculamos covalentemente el mismo amplicón utilizado en EMSA (Fig. 6b) a una placa de microarrays antes de agregar la cepa ∆1687 pDIA6920 (Tabla complementaria 1) que produce o no CD1687. Luego contamos las bacterias unidas al ADN después de agregar ADNasa I en los pocillos (Fig. 6d). Encontramos que las bacterias se adhirieron más al ADN en los pozos cuando se produjo CD1687 que cuando el ADN o CD1687 estaban ausentes (Fig. 6c). Por lo tanto, con este experimento y los resultados de EMSA, concluimos que CD1687 puede unirse a eDNA de manera no específica. Es probable que esta actividad de unión permita que C. difficile se ancle al eDNA en la biopelícula.

El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA) se realizó con un plásmido pUC9 de E. coli o b ADN de C. difficile (amplicón de PCR de 450 pb) mezclado con varias concentraciones de CD1687 (hasta 16 µM), con 16 µM de inactivado por calor ( HI) CD1687 o BSA utilizados como controles. c CFU de C. difficile medidas a partir del ensayo de adhesión. Se usó la cepa Δ1687 pDIA6920 que expresaba o no CD1687 en respuesta a ATc como se describe en (d). Esquema del ensayo de adhesión. Comparamos la adhesión de bacterias que expresan CD1687 o no en pocillos que contienen o no ADN unido covalentemente. Este esquema fue hecho con biorender.com. El diagrama de caja utilizado para representar datos cuantitativos representa la mediana, el mínimo, el máximo y los cuartiles superior e inferior. Cada punto de datos representa una réplica biológica independiente. Los asteriscos indican significación estadística con una prueba ANOVA de una vía seguida de la prueba de comparación múltiple de Dunnett (**p < 0,01; ***p < 0,001). Las transferencias en ayb se derivan de los mismos experimentos y no se procesaron.

En este estudio, confirmamos que solo se requería CD1687 en el grupo CD1685-CD1689 para la formación de biopelículas inducidas por DCA y esto requería la localización de CD1687 en la superficie celular.

De hecho, esta proteína se detecta en la pared celular15 así como en la superficie celular (Figs. 4 y 5a), pero se ha detectado y descrito como una lipoproteína anclada a la membrana27. El pequeño tamaño de la proteína y su estructura prevista implican que esta proteína debería estar más cerca de la membrana que de la superficie de la pared celular. Dado que CD1687 se puede recuperar fácilmente de la fracción de la pared celular, esto sugiere que existen posibles modificaciones postraduccionales aún no descritas en CD1687 que escindirían su ancla de miristoilo, permitiendo que la proteína se una a la pared celular. Notamos que existe una heterogeneidad significativa en la respuesta a DCA para la expresión y localización de CD1687 en la superficie celular en la población según se observa por microscopía (Fig. 4 y Figura 5 complementaria). Esto explicaría el nivel transcripcional relativamente bajo del grupo de genes CD1685-CD1689 a nivel de población15. Curiosamente, cuanto más CD1687 se exprese homogéneamente en la población celular, mayor será la biopelícula formada (Fig. 4, Figura complementaria 2c). Hasta donde sabemos, la heterogeneidad de expresión de los componentes críticos del biofilm aún no se ha informado en C. difficile. La heterogeneidad fenotípica en las biopelículas está bien caracterizada en varias otras especies bacterianas, lo que da como resultado la diversificación fenotípica y la división del trabajo en una población bacteriana clonal35. Por ejemplo, una subpoblación de células sintetiza la matriz de exopolisacáridos durante la formación de biopelículas en B. subtilis36. Se ha descrito heterogeneidad fenotípica en células planctónicas de C. difficile y esto afectó la expresión del flagelo y toxinas37. En este caso, la heterogeneidad está controlada por un evento de recombinación de ADN específico mediado por RecV38 y el factor Rho39. Además, la morfología de las colonias de C. difficile también está sujeta a la heterogeneidad fenotípica que da como resultado cambios en la fisiología y patogenia bacterianas y esto ocurre a través de la variación de fase de la expresión del sistema de transducción de señales CmrRST40,41.

Dado que CD1687 forma un operón con un sistema regulador de dos componentes (CD1688-1689) y que CD1687 es una proteína de la pared celular, primero planteamos la hipótesis de que CD1687 estaba involucrado en la transducción de señales que conduce a modificaciones transcripcionales en respuesta a DCA. Sin embargo, CD1687 no se unió a DCA, lo que elimina el supuesto papel de CD1687 como proteína detectora de DCA. Además, con la excepción de la esporulación, los genes regulados por CD168842 tienen una superposición limitada, lo que sugiere que CD1687 puede no ser parte de la cascada de señalización de CD1688-CD1689. Esto es consistente con la ausencia de CD1689 y CD1688 en nuestro ensayo desplegable. Sin embargo, se aislaron varias proteínas de unión a solutos y proteínas asociadas a transportadores en un ensayo desplegable. Esto y el análisis transcripcional proporcionan evidencia de que CD1687 influye en el metabolismo de C. difficile. En apoyo de esto, los reguladores (Spo0A, CodY y SinRR') que gestionan las prioridades metabólicas durante las fases de crecimiento se regularon de manera diferencial cuando se sobreexpresó CD168743,44,45. Además, la expresión del gen que codifica la toxina y los implicados en la esporulación también se vieron afectados y se sabe que estos procesos dependen del estado metabólico de C. difficile. Cuando comparamos los genes regulados diferencialmente en ausencia de CD1687 bajo condiciones inductoras de DCA con aquellos regulados diferencialmente cuando CD1687 se sobreexpresaba en ausencia de DCA, solo había 69 genes comunes, que incluían genes involucrados en diferentes vías metabólicas y transporte. Sin embargo, estos cambios en los genes asociados al metabolismo no se superpusieron con nuestros análisis previos sobre la expresión génica durante la formación de biopelículas inducidas por DCA23, lo que sugiere que CD1687 no es parte de la respuesta inmediata a DCA y probablemente juega un papel en la respuesta posterior. En conjunto, nuestros datos sugieren que CD1687 ayuda a reorganizar las prioridades metabólicas en respuesta a DCA, pero esta hipótesis por sí sola no explica el papel de CD1687 en la formación de biopelículas sin DCA. Por lo tanto, CD1687 puede tener funciones adicionales.

Curiosamente, muchas proteínas que se encuentran en la superficie celular bacteriana interactúan con el eDNA que se encuentra en la matriz del biofilm y esto contribuye a la organización y estabilidad estructural del biofilm46. Ya se ha demostrado que las lipoproteínas de membrana interactúan directamente con el eDNA y participan en la arquitectura del biofilm. En S. aureus, se ha identificado que varias lipoproteínas unidas a la membrana que interactúan con el eDNA de la matriz del biofilm promueven la formación del biofilm de S. aureus34. Aquí confirmamos que CD1687 interactúa in vitro con el ADN de manera no específica tanto con la proteína purificada como con las bacterias productoras de CD1687, cuyo nivel de producción es suficiente para aumentar la adhesión bacteriana al eDNA. Estos resultados respaldan la hipótesis de que CD1687 actúa como una proteína de unión a eDNA durante la formación de biopelículas mediante la creación de puntos de anclaje para eDNA en la superficie celular. De manera similar a nuestra observación con CD1687, la sobreexpresión de proteínas de unión a eDNA en S. aureus dio como resultado una mayor retención de eDNA de superficie y una biomasa de biopelícula mejorada. Sin embargo, la eliminación de las lipoproteínas de S. aureus tuvo un impacto mínimo en la formación de biopelículas, pero aumentó la porosidad de la biopelícula, lo que indica que las interacciones de la lipoproteína con el eDNA contribuyen a la estructura general de la biopelícula. A diferencia de la lipoproteína que se encuentra en S. aureus, una eliminación o inactivación de CD1687 abolió la formación de biopelículas34. La interacción de CD1687 con eDNA parece ser una parte esencial de la formación de biopelículas inducidas por DCA. Otras estructuras también pueden interactuar con eDNA. Recientemente, se demostró que dos subunidades menores (PilW y PilJ) de C. difficile T4P interactúan directamente con eDNA para promover la formación de biopelículas47. Ninguna subunidad tiene un motivo de unión al ADN predicho como se observa con CD1687. El T4P es una estructura que promueve la formación de biopelículas en ausencia48,49 o presencia de DCA23. En presencia de DCA, PilW aumenta pero no es necesario para la formación de biopelículas15,23. Además, el gen pilW estaba regulado de manera diferente en nuestro transcriptoma; regulado al alza en el WT frente a Δ1687 con análisis DCA (significativamente pero por debajo del umbral) y regulado a la baja en el CD1687 sobreexpresado frente a WT sin análisis DCA. Por lo tanto, CD1687 y T4P pueden tener un papel complementario y la falta de unión a eDNA por parte de uno de estos componentes puede cambiar el comportamiento de C. difficile durante la formación de biopelículas.

A pesar del papel potencial de CD1687 como proteína de unión a eDNA y en el metabolismo, no podemos excluir que la sobreexpresión de CD1687 modifique las propiedades de la pared celular a través de las interacciones de CD1687 con otras proteínas de membrana y transportadores (Tabla complementaria 5). Estas interacciones podrían ser detectadas por diferentes sensores, que activarían un circuito de retroalimentación para modificar la pared celular y la composición de las proteínas de la superficie celular. Por ejemplo, el operón dltABCD aumentó cuando se sobreexpresó CD1687 en ausencia de DCA. Las proteínas DltABCD son responsables de la D-alanilación de los ácidos teicoicos, lo que cambia las cargas eléctricas de la pared y superficie celular50. La sobreexpresión de CD1687 también afectó a la morfología celular; en respuesta a DCA, las células que expresan altos niveles de CD1687 muestran una distorsión de tamaño y forma reducida (Fig. 4 y Figura 5 complementaria). En general, la sobreexpresión de CD1687 puede tener efectos posteriores en la fisiología de C. difficile y estos cambios pueden contribuir a la formación de biopelículas.

Finalmente, nuestra hipótesis es que el mecanismo para la formación de biopelículas en presencia de DCA es diferente al mecanismo cuando DCA está ausente y CD1687 está sobreexpresado. En presencia de DCA, sabemos que C. difficile pasa por una reorganización metabólica23 y, según nuestros datos, CD1687 ayudaría con las prioridades metabólicas para la adaptación a largo plazo. Una vez que haya suficiente eDNA, CD1687 interactuaría con la unión de eDNA y serviría como punto de anclaje. Cuando CD1687 se sobreexpresa independientemente de DCA, aumenta la homogeneidad de la localización superficial de CD1687 en la población y sirve como múltiples sitios de anclaje para eDNA, lo que da como resultado una biopelícula fuertemente adherente. Como se observó en S. aureus, otras lipoproteínas pueden unirse al eDNA en C. difficile y varias se regulan positivamente en respuesta a DCA23. A diferencia de las lipoproteínas caracterizadas en S. aureus, la lipoproteína CD1687 probablemente tiene una función crítica en el metabolismo en respuesta a DCA y otras lipoproteínas no proporcionan redundancia funcional. Esto destaca la importancia de CD1687 en la promoción de la formación de biopelículas. Se necesitará más investigación para comprender el papel y la contribución de estas otras lipoproteínas a la biopelícula.

Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla complementaria 1C. difficile se cultivaron anaeróbicamente (5 % H2, 5 % CO2, 90 % N2) en medio TY (30 g/L de triptona, 20 g/L de extracto de levadura) o en medio BHISG (BHI con 0,5 % (p/v) de levadura extracto, cisteína 0,01 mg/mL y glucosa 100 mM) y suplementado con cefoxitina (250 μg/ml), D-cicloserina (8 μg/ml) y tiamfenicol (15 μg/ml) cuando sea necesario. Además, se añadieron 100 ng/ml de anhidrotetraciclina (ATC) para inducir el promotor Ptet de los derivados del vector pRPF185 en C. difficile. Las cepas de E. coli se cultivaron en caldo LB suplementado con cloranfenicol (15 µg/mL) y ampicilina (100 µg/mL).

Los cultivos de C. difficile cultivados durante la noche en medio TY con antibióticos apropiados se diluyeron a 1/100 en BHISG fresco que contenía los complementos deseados (240 µM DOC, 100 ng/mL ATC o ambos). Dependiendo del ensayo, los cultivos diluidos se dividieron en alícuotas con 1 ml por pocillo en placas de 24 pocillos (placas tratadas con cultivo de tejido de poliestireno, Costar, EE. UU.) o con 200 µl en placas de 96 pocillos (placas de cultivo de tejido negro de poliestireno placas tratadas, Greiner Bio One, Austria). Las placas se incubaron a 37 °C en un ambiente anaerobio durante 48 h. La biomasa del biofilm se midió en las placas de 24 pocillos utilizando un método establecido15. Para los ensayos de biopelículas en placas de 96 pocillos utilizadas para microscopía, se eliminó cuidadosamente el medio gastado mediante pipeteo y se agregaron 200 µl de PBS suplementado con un 4 % de paraformaldehído (PFA). Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente y luego se extrajo cuidadosamente el medio pipeteando antes de agregar PBS durante 48 horas a 4 °C. En todos los ensayos, se utilizó medio estéril como control negativo y blanco para los ensayos.

La eliminación de genes en C. difficile se realizó como se describe en Peltier et al.51. Las regiones aguas arriba y aguas abajo de los genes de interés se amplificaron por PCR usando los pares de cebadores descritos en la Tabla complementaria 1. Los fragmentos de PCR y el pDIA675451 linealizado se mezclaron y ensamblaron usando Gibson Assembly (NEB, Francia) y se transformaron por choque térmico en E. coli NEB 10β cepa. Las construcciones de plásmidos se verificaron mediante secuenciación y los plásmidos con las secuencias correctas se transformaron en E. coli HB101 (RP4). Las cepas resultantes se usaron como donantes en un ensayo de conjugación con las cepas de C. difficile relevantes. A continuación, se obtuvieron mutantes por deleción utilizando una contraselección como se describe en Peltier et al.51.

Las cepas de C. difficile se cultivaron anaeróbicamente durante 48 h en cultivos BHISG de 20 ml con ATC en tubos. Las células y las biopelículas se recolectaron por centrifugación (10 min; 14 000 × g; 4 °C) y se lavaron en un tampón de fosfato frío (50 mM; pH = 7,0; 4 °C). A continuación, las células se resuspendieron en 1 ml del mismo tampón de fosfato que contenía el dominio catalítico purificado de la endolisina CD27L (3 µg/ml) y la suspensión se incubó durante 1 hora a 37 °C para lisar las células bacterianas. Luego, los extractos totales se agitaron durante 1 min y se usaron para el ensayo desplegable con perlas de Ni-NTA como se describe a continuación para la purificación de CD1687 a partir de la expresión de E. coli. Se usaron cinco réplicas biológicas de cada condición en el ensayo desplegable (Tabla complementaria 5).

La cepa Bli5 de E. coli que contiene un plásmido derivado de pET20 que lleva el gen CD1687 (Tabla complementaria 1) se usó para sobreexpresar la proteína CD1687 etiquetada con hexahistidina sin su péptido señal. Las células se cultivaron durante la noche a 37 °C en LB complementado con glucosa (1 % p/v) y antibióticos (ampicilina 100 µg/mL y cloranfenicol 15 µg/mL). El cultivo de toda la noche se transfirió (1/100) en 1 L del mismo medio y se incubó a 37 °C. Una vez que el cultivo alcanzó una DO600nm de 0,5, se añadió IPTG (concentración final de 0,1 mM) y el cultivo se incubó durante 3 h más. Luego, las células se recolectaron por centrifugación (5000 × g, 10 min, 4 ° C) y el sedimento se lavó con PBS frío. Después de la centrifugación, se descartó el sobrenadante y el sedimento resultante se congeló a -20 °C. A continuación, el sedimento se resuspendió en 15 ml de tampón de lisis (fosfato sódico 50 mM, pH = 8,0; NaCl 300 mM) y se sonicó. Después de la centrifugación (5000 × g, 10 min, 4 °C), se recogió el sobrenadante y se mezcló con perlas de Ni-NTA y se incubó una hora a 4 °C. A continuación, las perlas se transfirieron a una columna de elución y se lavaron con tampón de lavado (fosfato sódico 50 mM pH = 8,0; NaCl 300 mM; imidazol 10 mM). Las proteínas se eluyeron con 2 ml de tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH = 8,0) complementado con NaCl 300 mM y un gradiente de imidazol que oscilaba entre 50 mM y 500 mM. Las proteínas eluidas se analizaron mediante inmunotransferencia y las fracciones que contenían CD1687 se dializaron en tampón TAE (Tris-base (20 mM); ácido acético (10 mM); EDTA (0,5 mM); pH = 8,5) utilizando unidades de diálisis Slide-A-Lyzer (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Para generar anticuerpos anti-CD1687 policlonales, se inyectaron cuatro veces a dos conejos hembra (blanco de Nueva Zelanda) 50 µg de CD1687 (His6) purificado (0,5 ml de antígeno con 0,5 ml de adyuvante completo de Freund en D0, D14, D28 y D42). ) con la empresa Covalab (Francia). Los anticuerpos se purificaron en D53 de inmunización.

Todos los experimentos se realizaron en un instrumento Biacore T200 (Cytiva, EE. UU.) equilibrado a 25 °C en tampón TAE (base Tris 20 mM, ácido acético 10 mM, EDTA 0,5 mM, pH = 8,5). Se capturó CD1687(His6) (100 µg/ml) durante 600 s a 2 µl/min en un sensorchip NTA cargado con NiCl2, alcanzando una densidad superficial de 1000–1200 RU (unidades de resonancia; 1RU ≈ 1 pg/mm2). A continuación, se inyectó DCA (16–2000 µM) a 10 µl/min durante 120 s, simultáneamente en la superficie del CD1687 y en un chip de referencia vacío del que se restaron las señales no específicas.

Las proteínas se redujeron utilizando TCEP 5 mM durante 30 min a temperatura ambiente. La alquilación de los puentes disulfuro reducidos se realizó utilizando yodoacetamida 10 mM durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, las proteínas se digirieron en dos pasos, primero con 250 ng de r-LysC Mass Spec Grade (Promega) durante 4 h a 30 °C, luego las muestras se diluyeron por debajo de urea 2 M con Tris HCl 100 mM, pH 8,5 y 500 ng de tripsina modificada de grado de secuenciación. se añadió para la segunda digestión durante la noche a 37 °C. La proteólisis se detuvo mediante la adición de ácido fórmico (FA) a una concentración final del 5%. Los péptidos resultantes se limpiaron con cartuchos AssayMAP C18 en la plataforma AssayMAP Bravo (Agilent) según las instrucciones del fabricante. Los péptidos se concentraron hasta sequedad y se resuspendieron en acetonitrilo (ACN) al 2 % y FA al 0,1 % justo antes de la inyección por LC-MS.

El análisis LC-MS/MS se realizó en un espectrómetro de masas Q ExactiveTM Plus (Thermo Fisher Scientific) acoplado con un Proxeon EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific). Se inyectaron 500 ng de péptidos en una columna C18 casera de 37 cm (partículas de 1,9 μm, tamaño de poro de 100 Å, ReproSil-Pur Basic C18, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Alemania). El equilibrio de la columna y la carga de péptidos se realizaron a 900 bares en tampón A (0,1% FA). Los péptidos se separaron con un gradiente de varios pasos del 3 al 6 % de tampón B (80 % ACN, 0,1 % FA) en 5 min, del 6 al 31 % de tampón B en 80 min, del 31 al 62 % de tampón B en 20 min a una caudal de 250 nL/min. La temperatura de la columna se ajustó a 60 °C. Los datos de MS se adquirieron usando el software Xcalibur usando un método dependiente de datos. Los escaneos MS se adquirieron a una resolución de 70.000 y los escaneos MS/MS (primera masa fija 100 m/z) a una resolución de 17.500. El objetivo de AGC y el tiempo de inyección máximo para los escaneos de inspección y los escaneos MS/MS se establecieron en 3E6, 20 ms y 1E6, 60 ms, respectivamente. Se activó una selección automática de los 10 iones precursores más intensos (Top 10) con una exclusión dinámica de 30 s. La ventana de aislamiento se fijó en 1,6 m/z y la energía de colisión normalizada se fijó en 27 para la fragmentación HCD. Utilizamos una relación de subllenado de 1,0% correspondiente a un umbral de intensidad de 1,7E5. Se rechazaron los estados de carga de iones precursores no asignados, así como los estados cargados 1, 7, 8 y >8 y se desactivó la coincidencia de péptidos.

Los datos sin procesar adquiridos se analizaron utilizando el software MaxQuant versión 2.1.1.052 utilizando el motor de búsqueda Andromeda53,54. Los espectros MS/MS se buscaron en la base de datos C.difficile 630 (3957 entradas).

Todas las búsquedas se realizaron con oxidación de metionina y acetilación N-terminal de proteína como modificaciones variables y carbamidometilación de cisteína como modificación fija. La tripsina se seleccionó como proteasa permitiendo hasta dos escisiones perdidas. La longitud mínima del péptido se fijó en 7 aminoácidos y la masa del péptido se limitó a un máximo de 4600 Da. La tasa de descubrimiento falso (FDR) para la identificación de péptidos y proteínas se fijó en 0,01. La tolerancia del péptido de búsqueda principal se fijó en 4,5 ppm y en 20 ppm para la tolerancia de coincidencia MS/MS. Los segundos péptidos se habilitaron para identificar eventos de cofragmentación. Se aplicó un límite de tasa de descubrimiento falso del 1 % a los niveles de péptido y proteína. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD038282. El análisis estadístico de los datos proteómicos se realizó como se describió anteriormente55. Brevemente, se adquirieron cuatro réplicas biológicas por condición. Para resaltar proteínas significativamente diferencialmente abundantes entre dos condiciones, se realizaron análisis diferenciales a través de la siguiente canalización de análisis de datos: (1) eliminando las proteínas contaminantes inversas y potenciales; (2) mantener solo proteínas con al menos dos valores cuantificados en una de las dos condiciones comparadas para limitar las identificaciones erróneas y garantizar un mínimo de replicabilidad; (3) transformación log2 de las intensidades restantes de las proteínas; (4) normalizando las intensidades mediante el centrado mediano dentro de las condiciones gracias a la función normalizada del paquete R DAPAR56, (5) dejando de lado proteínas sin ningún valor en una de las dos condiciones comparadas: ya que están cuantitativamente presentes en una condición y ausentes en otra , se consideran proteínas diferencialmente abundantes y (6) se les realiza un análisis diferencial estadístico al requerir un cambio mínimo de 2 veces entre condiciones y al usar una prueba t de LIMMA57,58 combinada con una corrección adaptativa de Benjamini-Hochberg de los valores de p gracias a la función de ajuste.p del paquete R cp4p59. Se utilizó el método robusto de Pounds y Cheng para estimar la proporción de hipótesis nulas verdaderas entre el conjunto de pruebas estadísticas60. Las proteínas asociadas con un valor de p ajustado inferior a un nivel de FDR del 1% se han considerado proteínas significativamente diferencialmente abundantes. Finalmente, las proteínas de interés son, por lo tanto, las proteínas que emergen de este análisis estadístico complementadas con aquellas que están cuantitativamente ausentes de una condición y presentes en otra.

Las células se cultivaron en placas de 24 pocillos y se usaron 10 pocillos por placa para producir una réplica para una condición. Para las condiciones de biopelícula, el sobrenadante se eliminó invirtiendo la placa y las biopelículas se lavaron cuidadosamente dos veces y luego se resuspendieron en 3 ml de PBS. En otras condiciones, se recolectó toda la población bacteriana y las células se recogieron por centrifugación (10 min, 8000 × g, 4 °C) y se resuspendieron en 1 ml de PBS. Finalmente, las suspensiones celulares en PBS se centrifugaron (10 min, 8000 × g, 4 °C) y los sedimentos se congelaron a -80 °C hasta su uso posterior. La extracción del ARN total de las bacterias y el ensayo qRT PCR se realizaron como se describe en Saujet et al.43.

El análisis del transcriptoma para cada condición se realizó utilizando 4 preparaciones de ARN independientes. Las bibliotecas se construyeron utilizando el kit Illumina Stranded Total RNA Prep Ligation with RiboZero Plus (Illumina, EE. UU.). El paso de ribodepleción se llevó a cabo utilizando sondas específicas sintetizadas específicamente para apuntar a las secuencias ribosómicas de C. difficile (Tabla complementaria 1). Después del ribodepleción, se prepararon bibliotecas de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. La secuenciación de ARN se realizó en la plataforma Illumina NextSeq 2000 usando 67 bases para un objetivo de 10 M de lecturas por muestra.

En estos ensayos sólo se utilizó CD1687 recién purificado de E. coli. CD1687 (de 0,5 µM a 16 µM) se incubó con ADN (pUC9 o producto de PCR) en 10 µl de tampón de fosfato de sodio (50 mM; pH = 8,0) durante 30 min a temperatura ambiente. Las muestras se cargaron y migraron en geles de agarosa tamponados con TAE (1 % p/v) durante 90 min a 100 V. Los controles se realizaron con CD1687 desnaturalizado a 100 °C durante 15 min antes del ensayo. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se tomaron fotografías con un Amersham ImageQuant 800 (Cytiva). El plásmido pUC9 se preparó a partir de stock de E. coli utilizando el kit de plásmido Nucleospin (Macherey-Nagel, Alemania) y el amplicón de PCR utilizado se generó utilizando C. difficile 630Δerm como plantilla de ADN y cebadores dirigidos a la región de CD1438 (Tabla complementaria 1) . El gDNA se extrajo del cultivo celular utilizando el kit DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN, Países Bajos).

Se realizó un 5'RACE utilizando el kit 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, versión 2.0 (Invitrogen, EE. UU.). Brevemente, el ADNc se generó mediante transcripción inversa a partir del extracto de ARN total seguido de la degradación del ARN. A continuación, se realizó la cola dC con el ADNc y el ADN resultante de la cola dC se usó como molde en la PCR, tal como se describe en las instrucciones del kit. Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (1% de agarosa en tampón TAE). Para identificar los sitios de inicio de la transcripción, los productos de PCR se insertaron en el kit de vector fácil pGEM-T como describe el fabricante (Promega, EE. UU.). A continuación, el inserto se amplificó por PCR y los productos de PCR resultantes se secuenciaron.

Para microscopía, se generaron biopelículas de 48 h en placas de 96 pozos (negras, Greiner) como se describió anteriormente, se lavaron y luego se agregaron a cada pozo 50 μl de los anticuerpos policlonales anti-CD1687 diluidos en PBS (400 ng/mL) y se incubaron. toda la noche a 4 °C. Los pocillos se lavaron cuidadosamente dos veces con PBS seguido de la adición de una solución que contenía DAPI (dilución 1/1000) y anticuerpos secundarios (anti-conejo de cabra conjugado con Texas Red; dilución 1/5000; Invitrogen, cat: T-2767) en PBS. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. Luego, los pozos se lavaron cuidadosamente con PBS y se agregaron 200 μl de PBS fresco para la adquisición de datos. Las imágenes se tomaron con el microscopio invertido Nikon Eclipse Ti (Nikon, Japón).

Se utilizó un amplicón de 433 pb modificado en un extremo con una amina C6 y correspondiente a la región del gen CD1438 para recubrir covalentemente una placa de 96 pocillos de superficie DNA-BIND (Corning, EE. UU.) según las directrices del fabricante. Brevemente, se colocaron 100 µL de una solución 250 nM de amplicón preparado en el tampón de unión (tampón de fosfato de sodio 50 mM pH = 8,5; EDTA 1 mM) en los pocillos y la placa se incubó durante la noche a 4 °C. Se prepararon pocillos de control utilizando únicamente el tampón de unión. Luego, los pocillos se lavaron tres veces con 200 µL de PBS y la placa se introdujo en la cámara anaeróbica. Los cultivos en fase exponencial de la cepa Δ1687pDIA6920 (Tabla complementaria 1) cultivada en BHISG y los antibióticos apropiados con o sin el inductor de ATc se diluyeron a una DO (600 nm) de 0,5 y se colocaron 200 µl de estas suspensiones bacterianas en los pocillos de ADN. -placa recubierta. La placa se incubó anaeróbicamente a 37 °C durante 20 min y luego se lavó dos veces con BHISG antes de agregar 200 µL de BHISG que contenía 25 µg de ADNasa I en cada pocillo. La placa se incubó anaeróbicamente durante 20 min a 37 °C y se contaron las bacterias de la suspensión en placas de agar BHI. La amplificación por PCR para obtener el amplicón modificado se realizó con ADN cromosómico de C. difficile 630Δerm con cebadores dirigidos a la región de CD1438 (Tabla complementaria 1).

Los ensayos de biopelícula, el ensayo de unión de bacterias y ADN y la RT-qPCR se analizaron mediante una prueba ANOVA unidireccional seguida de una prueba de comparación múltiple de Tukey o una prueba de comparación múltiple de Dunnett.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de RNA-Seq generados en este estudio están disponibles en NCBI-GEO con el número de acceso GSE218475. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD038282.

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Este trabajo fue financiado por el Institut Pasteur, la "Biología Integrativa de las Enfermedades Infecciosas Emergentes" (LabEx IBEID) financiada en el marco del "Programme Investissements d'Avenir" del Gobierno francés y The ANR DifBioRel AAPCE5. EA es becaria doctoral de la Université Paris-Cité. LH es becaria doctoral de la Sorbonne Université.

Institut Pasteur, Universidad de Paris-Cité, UMR-CNRS 6047, Laboratorio de Patogénesis de las Bacterias Anaerobias, F-75015, París, Francia

Émile Auria y Bruno Dupuy

Institut Pasteur, Universidad de Paris-Cité, INSERM UMR1222, Unidad de Anticuerpos en Terapia y Patología, París, Francia

Lise Hunault

Universidad de la Sorbona, INSERM, CNRS, Centro de Inmunología y Enfermedades Infecciosas (CIMI-París), F-75013, París, Francia

Lise Hunault

Plataforma de Biofísica Molecular, Institut Pasteur, CNRS UMR3528, París, Francia

patricio inglaterra

Plataforma Tecnológica de Biómica, Institut Pasteur, París, Francia

Marc Monot & Juliana Pipoli Da Fonseca

Plataforma Proteómica, Institut Pasteur, París, Francia

Mariette Matondo y Magalie Duchateau

Departamento de Bioquímica, Microbiología e Inmunología, Universidad de Saskatchewan, Saskatoon, SK, Canadá

Yannick DN Tremblay

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EA y BD diseñaron el estudio y los experimentos; EA, LH, PE, JPF, MD y BD realizaron experimentos; M.Monot y M.Matondo ayudaron con los análisis transcriptómicos y proteómicos, respectivamente; EA y BD redactaron y editaron el manuscrito; PE, M.Monot, MD, M.Matondo y YDT ayudaron con la redacción y edición; Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Bruno Dupuy.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Auria, E., Hunault, L., Inglaterra, P. et al. La lipoproteína de la pared celular CD1687 actúa como una proteína de unión al ADN durante la formación de biopelícula inducida por desoxicolato en Clostridioides difficile. npj Biofilms Microbiomes 9, 24 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00393-5

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Recibido: 06 Diciembre 2022

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 11 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00393-5

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