Revelando proteoformas de Corynebacterium glutamicum en la parte superior

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2602 (2023) Citar este artículo

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Corynebacterium glutamicum es una bacteria ampliamente empleada en la producción industrial de aminoácidos, así como una amplia gama de otros productos biotecnológicos. El presente estudio describe la caracterización de las proteoformas de C. glutamicum y sus modificaciones postraduccionales (PTM) empleando proteómica de arriba hacia abajo. A pesar de la evidencia previa de que los PTM tienen funciones en la regulación del metabolismo de C. glutamicum, este es el primer análisis de proteoma de arriba hacia abajo de este organismo. Identificamos 1125 proteoformas de 273 proteínas, con el 60% de las proteínas presentando al menos un cambio de masa, lo que sugiere la presencia de PTM, incluidas varias proteoformas acetiladas, oxidadas y formiladas. Además, se identificaron proteínas relevantes para la producción de aminoácidos, la secreción de proteínas y el estrés oxidativo con cambios de masa que sugieren la presencia de PTM y proteoformas no caracterizadas que pueden afectar procesos biotecnológicamente relevantes en este caballo de batalla industrial. Por ejemplo, las proteínas de membrana mepB y SecG se identificaron como una proteoforma escindida y formilada, respectivamente. Mientras estaba en el metabolismo central, OdhI se identificó como dos proteoformas con relevancia biológica potencial: una proteoforma escindida y una proteoforma con PTM correspondientes a un cambio de masa de 70 Da.

La bacteria Corynebacterium glutamicum es un caballo de batalla industrial capaz de producir una amplia gama de biomoléculas a partir de una gran cantidad de sustratos1 y actualmente es la mejor opción para la producción de L-alfa aminoácidos2. La producción de aminoácidos representa un mercado multimillonario3, con una producción anual de aproximadamente 10 millones de toneladas en todo el mundo2, con l-glutamato y l-lisina correspondientes a 3,3 millones de toneladas/año y 2,2 millones de toneladas/año, respectivamente2. Además de la producción de aminoácidos, C. glutamicum también se utiliza en otros procesos biotecnológicos, como la producción de proteínas heterólogas4, ácidos orgánicos5, carotenoides, isobutanol6, polímeros7 y, más recientemente, se ha investigado su potencial en procesos de biorremediación8.

Los desarrollos recientes en proteómica han demostrado la importancia de las modificaciones postraduccionales (PTM) en varias especies de bacterias9. En C. glutamicum, la importancia de los PTM se investigó previamente y reveló el efecto crucial de la fosforilación del inhibidor de la oxoglutarato deshidrogenasa (OdhI) en la producción de l-glutamato10,11. Más recientemente, la proteómica de espectrometría de masas de C. glutamicum mostró la influencia de las condiciones productoras de l-glutamato en la succinilación y acetilación de proteínas metabólicas de C. glutamicum, incluida OdhI12.

Actualmente existen dos enfoques proteómicos principales que se denominan ascendente y descendente. Brevemente, en el enfoque de abajo hacia arriba, las proteínas son escindidas por una proteasa (generalmente tripsina) y los péptidos posteriores se analizan mediante espectrometría de masas, mientras que en el procedimiento de arriba hacia abajo, las proteínas se examinan en sus formas intactas13. Como consecuencia de la digestión con proteasas, la información de varias regiones de proteínas se puede perder en enfoques ascendentes, incluidos los PTM. Además, en este enfoque, la identidad de la proteína se infiere en función de la identificación del péptido, y esto puede causar ambigüedad en los casos en que los péptidos pueden pertenecer a más de una proteína13. Por el contrario, el enfoque de arriba hacia abajo permite la identificación de la secuencia completa de proteínas. Además, el análisis de formas intactas de proteínas permite la identificación de proteoformas, definidas como diferentes formas de proteínas derivadas del mismo gen14. Estas proteoformas pueden generarse mediante sustitución de residuos de aminoácidos, escisión proteolítica, corte y empalme alternativo y varios tipos de PTM15. Además, diferentes proteoformas de la misma proteína pueden tener funciones diferentes y afectar los procesos biológicos de un organismo16. El poder de la proteómica de arriba hacia abajo se ha aplicado a otras bacterias17. Por ejemplo, se ha realizado la proteómica de arriba hacia abajo de Escherichia coli y la identificación de proteoformas18. A pesar de la evidencia de la relevancia de los PTM en el metabolismo de C. glutamicum, hasta la fecha no se han publicado estudios proteómicos de arriba hacia abajo. Aquí llevamos a cabo el primer análisis proteómico de arriba hacia abajo de C. glutamicum, utilizando un enfoque tolerante a precursores para identificar y revelar PTM y proteoformas.

Como era de esperar, se pudo observar una amplia gama de masas moleculares de proteoformas en las proteínas intracelulares fraccionadas previamente, pero GELFrEE fue eficaz para separar las proteoformas grandes de las formas más pequeñas (Fig. 1A). Las fracciones 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 y 11 mostraron proteoformas por debajo de 50 kDa, por lo que se eligieron para análisis posteriores de LC-MS/MS. A pesar de la clara presencia de proteínas en el rango de 30 a 50 kDa, como se muestra en SDS-PAGE (Fig. 1A), el análisis LC-MS detectó proteoformas predominantemente por debajo de 30 kDa (Fig. S1 complementaria). El número reducido de proteoformas observadas de más de 30 kDa puede deberse a desafíos conocidos para la identificación de proteoformas grandes desnaturalizadas, como la reducción de la relación señal-ruido que se produce con aumentos en el peso molecular de la proteoforma19.

SDS-PAGE de fracciones GELFrEE y perfil global de cambios de masa identificados (Δm). (A) SDS-PAGE de fracciones resultantes de GELFrEE (representado por los números) y muestra prefraccionada (T). (B) Diferencia de masas precursoras teóricas y observadas (cambios de masa, Δm) Histograma de conteo de PrSM, donde los diez Δm más frecuentes se resaltan en diferentes colores. El contenedor se estableció en 1 y los límites x en −500 Da y 500 Da.

El análisis proteómico de arriba hacia abajo de C. glutamicum generó 5127 coincidencias de espectro de proteoformas (PrSM), lo que proporcionó la identificación de 1125 proteoformas diferentes relacionadas con 273 proteínas diferentes (Tabla 1 complementaria). Aproximadamente el 65 % (177 proteínas) del número total de proteínas y el 47 % de las PrSM (2423 PrSM) se identificaron con cambios de masa (Δm), diferencias de masa entre la masa precursora esperada y la masa precursora observada, lo que sugiere la presencia de PTM. Los PTM putativos se anotaron en la Tabla 1 complementaria utilizando toda la base de datos Unimod, sin embargo, esta información debe usarse con precaución, ya que los espectros no se verificaron manualmente y el software consideró cambios de masa redondeados para las comparaciones, generando una tolerancia de aproximadamente 0,5 Da. Hay software disponible para la visualización de espectros y una mayor evaluación de los PTM, que incluye ProSight Lite20 y TopMSV21. El análisis de todos los PrSM con Δm reveló una amplia diversidad de Δm, lo que sugiere la presencia de diferentes PTM (Fig. 1B).

Algunos de los Δm más frecuentes identificados aquí también se informaron como altamente presentes en Escherichia coli a través de proteómica ascendente utilizando una estrategia de identificación imparcial22. En C. glutamicum, los cambios de masa identificados con mayor frecuencia fueron 16 Da (oxidación putativa, 10,15 % de PrSM modificadas), −18 Da (deshidratación putativa, 2,97 % de PrSM modificadas) y 32 Da (posible oxidación doble, 1,32 % de PrSM modificados). Curiosamente, la proporción de coincidencias de espectro de péptidos (PSM) identificadas de E. coli con -18 Da (3,8 %) y 32 Da (0,8 %) Δm fue muy similar a la encontrada en este estudio. En cambio, la proporción de PSM identificados con 16 Da (24%) Δm en E. coli fue mayor que en C. glutamicum. Sin embargo, vale la pena mencionar que el alto número de PrSM identificados con 15 Da Δm (6,11 % de PrSM modificados) puede deberse a una identificación errónea de 16 Da Δm, como se discutirá más adelante en los próximos temas.

Las proteínas identificadas con Δm se analizaron utilizando la aplicación String Cytoscape, luego de agrupar las proteínas de acuerdo con sus nodos de interacción, cada grupo se sometió a un análisis de sobrerrepresentación y los términos más representativos se relacionaron con diferentes términos de ontología génica, como complejos que contienen proteínas, actividad de transferencia de electrones. y dominio CYTH (CyaB, tiamina trifosfatasa), metabolismo de pirimidina, hélice transmembrana, biosíntesis de metabolitos secundarios y dominio tiorredoxina. Además, ocho PrSM ribosómicos presentaron dos Δm, lo que indica la presencia de al menos dos PTM concomitantes (Fig. S2 complementaria).

Más allá de la anotación funcional, analizamos el número de acetilación N-terminal y algunos Δm identificados con frecuencia: 16 Da, 15 Da, 28 Da, 266 Da, -18 Da y 32 Da (Fig. 2A). Estos Δm sugieren la presencia de oxidación (UnimodAC: 35, Δm = 15,994915 Da), desamidación seguida de una metilación (UnimodAC: 528, Δm = 14,999666 Da), formilación (UnimodAC: 122, Δm = 27,994915 Da), dodecilsulfato de sodio ( SDS) aductos23, deshidratación (UnimodAC: 23, Δm = −18,010565 Da) y persulfuro (UnimodAC: 421, Δm = 31,972071 Da). El cambio de masa de 28 Da también puede corresponder a la dimetilación (Unimod: 36, Δm = 28,031300 Da). A pesar de ser difícil diferenciar entre formilación y dimetilación, el mayor número de Δm cercano a 27,99 Da y 27,98 Da (Tabla complementaria 2) inclina la inferencia hacia eventos de formilación. La localización de residuos de aminoácidos del cambio de masa de 28 Da no fue posible sin ambigüedad, como puede verse por la ausencia de este cambio de masa en la Fig. 2B. Una posible razón de esto es que los eventos de formilación sugeridos se identificaron principalmente en el N-terminal de las proteínas, y su asignación siempre fue entre unos pocos residuos N-terminales de la proteína, como en el caso de la proteína MscL (Fig. 7). Cuando la asignación del cambio de masa estaba en más de un residuo de aminoácido, la información no se representó para evitar ambigüedades. Los eventos de oxidación sugeridos relacionados con los 16 Da Δm están respaldados por una gran cantidad de residuos de metionina modificados por este cambio de masa (Fig. 2B). Por otro lado, el 15 Da Δm parece ser malinterpretado en ocasiones, ya que el residuo más frecuentemente identificado con esta modificación también fue la metionina. Sin embargo, algunos residuos de ácido glutámico se identificaron con este Δm, lo que sugiere que la desamidación seguida de metilación aún puede estar presente en algunos casos, pero se confunden fácilmente con oxidaciones (Fig. 2B). El cambio de masa de 32 Da identificado en algunas proteínas podría estar relacionado con el persulfuro PTM, sin embargo, esta modificación ocurre en la cisteína y el ácido aspártico, y ninguno de estos pudo observarse en los residuos identificados inequívocamente (Fig. 2B). Otra posibilidad serían dos oxidaciones, respaldadas por los residuos de metionina identificados con este cambio de masa. Por otro lado, no debe excluirse la posibilidad de modificación con persulfuro, principalmente en proteínas en las que el residuo de aminoácido modificado no pudo identificarse sin ambigüedades. La oxidación de proteínas puede tener gran relevancia en los procesos biológicos, sin embargo, es importante señalar que también puede ser un artefacto causado por la manipulación de muestras24. Además, varios Δm eran de aproximadamente 266 Da, lo que sugiere la presencia de aductos resultantes del dodecilsulfato de sodio (SDS). La presencia de artefactos de SDS también se informó en un análisis proteómico intacto de E. coli y sugirió que se debe a una eliminación incompleta del detergente25. En cuanto al −18 Da Δm, puede resultar de eventos de deshidratación y se identificó predominantemente en residuos de serina (Fig. 2B). Estos cambios de masa predominantes también pueden estar relacionados con otros PTM putativos, como la oxidación de tirosina a 2-aminotirosina (UnimodAC: 342, Δm = 15,010899 Da) para los cambios de masa de 15 Da. Estas posibilidades se pueden observar por separado para cada PrSM identificado en la Tabla 1 complementaria. La acetilación N-terminal fue el PTM identificado con mayor frecuencia (Fig. 2A); por otro lado, el cambio de masa de 42 Da, que sugiere acetilación de lisina (UnimodAC: 1, Δm = 42.010565 Da) no se detectó con frecuencia (Tabla complementaria 2). En la identificación de proteoformas, se utilizó la acetilación N-terminal como una modificación variable. Por lo tanto, las proteoformas con acetilación de lisina cerca del N-terminal sin fragmentos para explicar el cambio de masa de 42 a un residuo de lisina podrían identificarse erróneamente con una acetilación del N-terminal.

Número de PrSM identificados y accesiones de proteínas de las modificaciones más frecuentes y proporción de residuos identificados inequívocamente de cada cambio de masa. (A) Número de coincidencias de espectro de proteoformas (PrSM) y proteínas identificadas con los cambios de masa más frecuentes y la acetilación N-terminal. (B) Relación del número de PrSM de un residuo de aminoácido modificado por cada cambio de masa (Δm) y el total de PrSM identificado con el mismo Δm. Por ejemplo, el número de metionina identificado con un cambio de masa de 16 Da (41 PrSM)/número de todos los residuos identificados con 16 Da Δm (85 PrSM) = 48 % (representado por la barra verde claro sobre la (M) en la x eje).

El análisis de sobrerrepresentación de proteínas pertenecientes a las seis modificaciones más frecuentes permitió identificar términos relacionados con proteínas ribosómicas, predominando en proteínas con Δm de −18 Da, 15 Da, 16 Da y proteínas acetiladas N-terminal (fig. 3). Se describe que las proteínas ribosómicas procarióticas suelen estar metiladas y acetiladas26. Por otro lado, Δm de 28 Da y 266 Da estaban sobrerrepresentados para términos relacionados con proteínas de membrana. Además, las proteínas identificadas con un cambio de masa de 28 Da mostraron una representación excesiva del sistema de secreción y la exportación de proteínas (Fig. 3).

Análisis de sobrerrepresentación de proteínas según la modificación identificada y los cambios de masa. Los códigos de acceso de las proteínas de cada modificación o cambio de masa se sometieron por separado a un análisis de sobrerrepresentación en DAVID frente a todas las proteínas codificadas del genoma de C. glutamicum. El FDR resultante, que representa la puntuación de enriquecimiento, y el porcentaje, que representa la proporción de proteínas identificadas con respecto a todas las proteínas presentes en el conjunto de genes relacionado, se trazaron utilizando la representación de gráfico de burbujas ggplot2.

Identificamos 13 proteínas que presentaban más de 15 proteoformas y la mayoría de ellas eran ribosómicas (Fig. S3 complementaria). Además, al considerar proteínas con más de 9 proteoformas, la anotación del componente celular también reveló proteínas de membrana (Fig. S3 complementaria). A pesar de la gran cantidad de proteoformas, cabe mencionar que algunas de ellas pueden ser potenciadas por aductos de SDS. Por ejemplo, las proteoformas de la proteína ribosomal 50S L7/L12 (Q8NT28) se identificaron con Δm de 266 Da, 532 Da y 401 Da, lo que probablemente representa la adición de un aducto de SDS, dos aductos de SDS y dos aductos de SDS más la pérdida del residuo de metionina del iniciador. La presencia de aductos de SDS en proteínas no es deseable, sin embargo, la identificación de estas proteínas es importante para evitar identificaciones erróneas y asignar proteínas que solo eran identificables a través de formas aducidas25.

Con el fin de contribuir con datos más precisos sobre los procesos biotecnológicos y metabólicos de C. glutamicum, algunos PrSM relacionados o potencialmente involucrados con estas funciones se caracterizaron manualmente mediante la inspección de MS1 y MS2 Spectra (Tabla 1).

La proteína del sistema de secreción (SecG) (Fig. 4A) y el canal mecanosensible de gran conductancia (MscL) (Fig. S4 complementaria) se identificaron con cambios de masa de 28 Da. Los fragmentos PrSMs de estas proteoformas presentaron iones que respaldan la identificación de un cambio de masa de 28 Da, siempre cerca del N-terminal, y los errores de masa de los fragmentos que contenían este Δm fueron extremadamente bajos. Se demuestra un ejemplo de inspección de MS1 y MS2 con SecG (Q8Z469) (Fig. 4A). En esta figura, se muestra la gran cantidad de iones b que soportan el cambio de masa 27,9883 (b4, b5, b6, b7, b8, b9, b10, b11 y b12) representados por las líneas azules en la secuencia de la proteína, y puede Se puede ver que el cambio de masa se localiza en una región muy estrecha de tres residuos de aminoácidos, debido a los varios iones b contenidos en esta región.

PrSM de la proteína de membrana de exportación de proteínas SecG (Q9Z469) y la supuesta metaloendopeptidasa mepB (Q8NS24). En la región superior de ambas imágenes (A y B) se puede ver la secuencia de la proteína identificada, donde los posibles sitios de Δm están representados por residuos resaltados en fondo azul y los fragmentos coincidentes están representados por líneas azules entre los residuos de aminoácidos. En la región inferior, se representan la MS1 y la ventana de aislamiento del precursor identificado (lado derecho de cada figura), así como la representación de masa del espectro de MS2 adjunto al error de masa de los fragmentos coincidentes. (A) Inspección del cambio de masa de 28 Da identificado en SecG, donde pudimos ver que 12 fragmentos (todos iones b) respaldan la identificación del cambio de masa de 27,9883 cerca del N-terminal. El error de masa de gran parte de estos fragmentos fue cercano a 0 ppm, como se muestra en la parte inferior de la imagen. (B) Inspección de la proteoforma escindida de mepB (sitio de escisión representado por el corchete rojo), que demuestra una gran cantidad de fragmentos que soportan la proteoforma escindida (todos los iones b) con un error de masa cercano a 0 ppm.

El cambio de masa de 28 Da cerca de la proteína N-terminal de estas proteínas sugiere la presencia de formilación N-terminal (Unimod: 122, Δm = 27,994915 Da) en las proteoformas identificadas. La evidencia reciente ha sugerido la formilación N-terminal de metionina como una señal para la degradación de proteínas. Este mecanismo ha sido planteado como un control de calidad de la traducción de proteínas en bacterias27. Tanto las PrSM formiladas con SecG como con MscL mencionadas anteriormente se identificaron con la presencia de metionina N-terminal. Esto sugiere un posible mecanismo de degradación de proteínas de membrana, incluidas algunas con aplicaciones biotecnológicas prometedoras. Por ejemplo, la proteína SecG es parte de la vía de exportación de la proteína Sec. Existe un interés creciente en la capacidad de C. glutamicum para expresar y secretar proteínas heterólogas de interés biotecnológico4,28. Además, MscL y MscS son canales mecanosensibles, conocidos por reaccionar al estrés osmótico. Otro canal mecanosensible de C. glutamicum (MscCG; P42531) juega un papel importante en la salida de l-glutamato29.

La proteómica de arriba hacia abajo es eficiente para identificar proteoformas escindidas. Por ejemplo, mepB, una proteína de membrana relacionada con la metaloendopeptidasa (Q8NS24) fue identificada por una parte de su secuencia con una masa precursora de 14.464 kDa. Esta masa corresponde a la pérdida de 97 residuos de aminoácidos de su región N-terminal (Fig. 4B). Por el contrario, se suponía que un sitio de escisión de mepB estaba entre Ala43 y Ala44, después de un péptido señal putativo o hélice transmembrana30. Además, según pfam (https://pfam.xfam.org/), mepB tiene un dominio que pertenece a la familia de metalopeptidasas M23 (MEROPS) [130–226]. Un miembro bien caracterizado de MEROPS es la proteína LytM de Staphylococcus aureus, una metalopeptidasa involucrada en la autólisis31. Se demostró que la escisión en la cadena N-terminal hace que se active su actividad peptidasa32. Además, las proteínas MEROPS tienen especificidad por las regiones de poliglicina de peptidoglucano, algunas con actividad de metabolismo de la pared celular sugerida33. De acuerdo, el gen mepB de C. glutamicum se describió como parte del regulón MtrAB, un sistema de dos componentes implicado en la osmorregulación y el control del metabolismo de la pared celular34. Aunque no está claro si la mepB se secreta o se une a la membrana, se ha sugerido que su actividad se produciría extracitoplasmáticamente30. Considerando esto, C. glutamicum mepB puede tener un papel importante en el metabolismo de la pared celular y/o la integridad de la secreción de proteínas heterólogas, y su actividad probablemente esté regulada por la escisión de su N-terminal.

C. glutamicum se utiliza ampliamente en la producción industrial de aminoácidos, especialmente de l-glutamato, que se produce en millones de toneladas al año35. El ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) es un paso importante en la producción de l-glutamato por parte de C. glutamicum. Está bien establecido que la disminución de la actividad del complejo 2-oxoglutarato deshidrogenasa (ODHC) ocurre en condiciones que inducen la producción de l-glutamato36,37. Además, se encontró que la actividad de ODHC estaba regulada por el estado de fosforilación del inhibidor de oxoglutarato deshidrogenasa (OdhI, Q8NQJ3). Por lo tanto, la proteoforma fosforilada de OdhI no puede interactuar con ODHC, mientras que OdhI no fosforilada interactúa con ODHC inhibiendo la conversión de 2-oxoglutarato en succinil-CoA11 (Fig. 5A). Además, la disminución de la actividad de ODHC provoca una mayor producción de l-glutamato a partir de 2-oxoglutarato37 (Fig. 5A). Congruentemente, el estado de fosforilación de OdhI se ve afectado por métodos que inducen la producción de l-glutamato11.

Representación de interacciones OdhI conocidas y putativas con ODHC y su impacto en la producción de l-glutamato. (A) Interacción de OdhI y ODHC obstaculizada por la fosforilación de OdhI. La ausencia del grupo fosfato en OdhI da como resultado su interacción e inhibición de ODHC (representado por el símbolo rojo), y se mejora el flujo a la producción de l-glutamato (representado por la flecha grande de 2-oxoglutarato a l-glutamato)11, 37. (B) Representación de posibles efectos metabólicos e interacciones proteicas afectadas por las proteoformas OdhI descritas en este estudio: Δm de 70 Da (representado por el símbolo de estrella) y escisión del dipéptido N-terminal (representado por las letras SD en OdhI). El efecto de las proteoformas identificadas en la función OdhI sigue sin estar claro, sin embargo, los posibles mecanismos afectados se representan a través de la inhibición de ODHC (recuadro morado; aumento de la producción de L-glutamato simbolizado por la flecha grande) o la activación de ODHC (recuadro verde; disminución de L -producción de glutamato simbolizada por la línea con un dote). Ambas hipótesis pueden influir en la producción de l-glutamato. Inhibidor de oxoglutarato deshidrogenasa OdhI, complejo de oxoglutarato deshidrogenasa ODHC.

En este estudio, se identificaron siete proteoformas de OdhI. Algunos de ellos parecían ser causados por la preparación de la muestra o el proceso de ionización, como la oxidación (Δm = 16 Da) y la deshidratación (Δm = −18 Da). Por el contrario, se identificaron dos proteoformas con potencial relevancia biológica: una de ellas con escisión N-terminal de tres residuos y otra con Δm de 70 Da (Fig. S5 complementaria). Aunque TopPic identificó con confianza estas dos proteoformas, un bajo número de fragmentos coincidentes cubrieron las regiones modificadas, lo que redujo nuestra confianza con respecto a sus identificaciones, principalmente en lo que respecta a su ubicación en la secuencia. Por otro lado, de acuerdo con una de las proteoformas identificadas, un análisis proteómico ascendente en un estudio preliminar realizado por nuestro grupo sugirió la presencia de Δm de 70 Da en el péptido N-terminal de OdhI (datos no mostrados).

Recientemente, se identificó el cambio de masa de 70 Da en la proteína expresada heteróloga GM-CSF en el sistema de Escherichia coli. Se planteó la hipótesis de que esta modificación era el resultado del crotonaldehído formado durante el estrés oxidativo por peroxidación lipídica. El aldehído reacciona con el extremo N de la proteína o con los residuos de lisina, lo que da como resultado un Δm de 70 Da38. Otro posible PTM para este cambio de masa es la butirilación de lisina (UnimodAC: 1289, Δm = 70,041865 Da). En el presente estudio, no se pudo identificar el sitio exacto de la modificación que resultó en el cambio de masa de 70 Da en OdhI debido a la complejidad de los espectros y la fragmentación limitada por MS/MS. Por lo tanto, no se pudieron excluir otras modificaciones como la adición de 5 grupos metilo (14 Da) y la acetilación (42 Da) seguida de formilación (28 Da). Como se mencionó anteriormente, la inactivación de ODHC surge de la interacción de OdhI no fosforilada y la subunidad OdhA de ODHC. La fosforilación de T14 OdhI inhibe esta interacción, lo que resulta en la activación de ODHC10. OdhI tiene un dominio asociado a la cabeza de horquilla (FHA) responsable del reconocimiento de un residuo de fosfotreonina. Además, este dominio es la región que interactúa con la subunidad OdhA de ODHC, lo que resulta en su inactivación. Además, se demostró que la fosforilación del residuo de treonina de OdhI provoca cambios drásticos en su conformación, lo que lleva a una autoinhibición de su función, consecuentemente activando ODHC39. Más recientemente, se informó que la succinilación de K142 también afecta la interacción OdhI-ODHC, lo que dificulta la inhibición de ODHC con impactos en la producción de l-glutamato de C. glutamicum12,40.

Además, como también se describió un sitio de acetilación en K52 de OdhI12,40, investigamos dicha modificación además de la formilación N-terminal (27.9949 Da + 42.0106 Da) como una posible causa de producción de la proteoforma 70 Da OdhI. Sin embargo, estas modificaciones dieron como resultado una pérdida considerable de picos de fragmentos coincidentes (datos no mostrados). Por lo tanto, es improbable que esta fuera la fuente de tal cambio masivo. Además, la región sugerida para el 70 Da Δm está cerca del sitio de fosforilación T14 conocido de OdhI, lo que plantea la cuestión de si podría afectar su interacción con ODHC. La fosforilación de OdhI en T14 está catalizada principalmente por C. glutamicum PknG10. Considerando la capacidad de reconocimiento del dominio OdhI FHA de su fosfotreonina y la ubicación cercana de este sitio de fosforilación con la proteoforma 70 Da Δm, esta modificación puede afectar la inhibición de OdhI de ODHC, resultando en su activación o inactivación (Fig. 5B). Un posible mecanismo es la obstrucción de la fosforilación de OdhI por la presencia del PTM de 70 Da, lo que permite la interacción del dominio FHA y, en consecuencia, la inhibición de ODHC (Fig. 5B, cuadro morado). Otra hipótesis es que la modificación de 70 Da de OdhI, aun teniendo un residuo fosforilado en T14, interfiere con el reconocimiento del dominio FHA de la fosfotreonina, dando como resultado la inhibición de ODHC por parte de OdhI (Fig. 5B, recuadro morado). Además, el cambio de masa de 70 Da puede incluso comportarse de manera similar al residuo fosforilado, induciendo el cambio conformacional de OdhI, inhibiéndolo y activando ODHC (Fig. 5B, recuadro verde). Es menos probable que el truncamiento del tripéptido N-terminal provoque efectos similares, sin embargo, no se puede descartar su influencia en OdhI (Fig. 5B). Además, estas alteraciones pueden influir en la producción de L-glutamato en estas bacterias, como consecuencia de la regulación de ODHC (Fig. 5B). A pesar de estos efectos potencialmente relevantes de las supuestas proteoformas de OdhI, se deben realizar más estudios para investigar la importancia y la validez de estas modificaciones en la función de OdhI.

Otra proteína con relevancia para el proceso de producción de glutamato es la proteína que contiene el dominio asociado a metales pesados (HMA) (Q8NL68, HMADP). Su transcripción correspondiente se identificó como regulada al alza en una serie de condiciones de sobreproducción de glutamato, sin embargo, su función en este proceso sigue sin estar clara41. Aquí identificamos tres proteoformas diferentes de esta proteína. Uno de ellos presentó Δm de −2 Da (Fig. S6 complementaria), lo que sugiere la presencia de un enlace disulfuro (UnimodAC: 2020, Δm = −2.015650 Da), sustitución de residuos de aminoácidos (UnimodAC: 1217, Δm = −2.015650 Da, Val- > Pro o UnimodAC: 1145, Δm = −1,997892 Da, Met- > Glu) o didehidro (UnimodAC: 401, Δm = −2,015650 Da) en la región modificada. Además, se identificaron varios PrSM con Δm de aprox. 30 d. La inspección de sus espectros resultó en la confirmación de este cambio de masa, pero es más probable que se deba a dos PTM, uno de 14 Da y otro de 16 Da (Fig. S6 complementaria), posiblemente correspondientes a metilación y oxidación, respectivamente. Además, se pudo detectar una envoltura isotópica cerca de esta proteoforma identificada (Δm = 30 Da) con la masa intacta de la modificación -2 Da de HMADP (Fig. S6 complementaria, precursor en azul).

Las dos supuestas modificaciones de las proteoformas HMADP están muy juntas en la secuencia de la proteína (Fig. S6 complementaria). Además, no se pudo identificar ninguna proteoforma canónica. Estos sugieren que la presencia de metilación puede afectar la formación de enlaces disulfuro. La secuencia HMA se encuentra en proteínas bacterianas que confieren resistencia a metales pesados tóxicos42. Para aclarar la función HMADP de C. glutamicum, la secuencia de la proteína Q8NL68 se comparó con los proteomas de referencia UniprotKB más la base de datos Swiss-Prot con parámetros predeterminados en Uniprot, lo que dio como resultado una similitud con la chaperona de cobre y las proteínas de transporte/desintoxicación de metales pesados (Tabla 3 complementaria). Se demostró que las transcripciones para el sistema de dos componentes que responde al cobre, CopRS, estaban reguladas al alza en C. glutamicum durante la inducción con penicilina de la producción de ácido glutámico43. Recientemente, se demostró que el cobre puede inducir la producción de ácido glutámico por parte de C. glutamicum, aunque en menor cantidad en comparación con los tratamientos típicos, como la penicilina o la limitación de biotina44. A pesar de esto, el papel de HMADP en la producción de L-glutamato sigue sin estar claro; sin embargo, parece ser una proteína relacionada con la respuesta al estrés y, por lo tanto, puede regularse o regular otras proteínas a través de PTM asociadas con el estrés oxidativo.

Se observaron valores de Δm menos comunes en una peroxirredoxina (Q8NMS6). Se identificó una proteoforma con un cambio de masa de 154 Da y también se detectó acetilación N-terminal (Fig. S7 complementaria). La inspección del espectro MS/MS nos permitió identificar fragmentos que respaldan el cambio de masa de 154 Da; sin embargo, la N-acetilación no pudo reducirse a una región de secuencia más corta, por lo que no está claro si se trataba de una serie de eventos de metilación o de hecho. una acetilación (Fig. S7 complementaria). Considerando solo un PTM, el cambio de masa de 154 Da puede ser causado por tres eventos: adición de glicerofosfato (UnimodAC: 419, Δm = 154.003110 Da), decanoilo (UnimodAC: 449, Δm = 154.135765 Da) o 4-oxo-2- nonenal (UNO) (UnimodAC: 721, Δm = 154,099380 Da). La modificación de la proteína ONE es un producto de peroxidación de lípidos, causado por interacciones de especies reactivas con los lípidos de la membrana, lo que sugiere que esta proteína puede estar localizada cerca de la membrana celular de C. glutamicum. Esta molécula se puede agregar a los residuos de aminoácidos nucleófilos45. Al observar la región de modificación propuesta, la presencia de ONE en el sitio sugerido es poco probable; sin embargo, cerca de esta ubicación hay tres posibles sitios de modificación, C51, K48 y C46 (Fig. S7 complementaria). Esta peroxirredoxina fue descrita como una peroxirredoxina Q con un papel importante en la respuesta al estrés oxidativo y capaz de reducir H2O2, t-BOOH, hidroperóxido de cumeno y peroxinitrito. Curiosamente, el C46 propuesto para sufrir el cambio de masa de 154 Da es la cisteína catalítica de esta peroxirredoxina46. Esto sugiere que esta modificación puede tener un impacto importante en su actividad catalítica y, en consecuencia, en varias respuestas de estrés oxidativo de C. glutamicum. Además, las proteínas involucradas en la regulación del estrés oxidativo a menudo son susceptibles a modificaciones oxidativas como un proceso para regular la actividad redox en la célula24. Esta evidencia apoya el cambio de masa de 154 Da como UNA modificación en la peroxirredoxina de C. glutamicum. Sin embargo, no se pueden descartar otras posibilidades. Otra proteoforma de peroxirredoxina con un Δm de 186 Da respalda la identificación del cambio de masa de 154 en esta proteína y es probablemente causado por un segundo PTM en su secuencia de aproximadamente 32 Da. De acuerdo, cerca del precursor fragmentado para la identificación de la proteoforma 186 Da Δm, había una envoltura isotópica correspondiente a la pérdida de alrededor de 32 Da (Fig. S7 complementaria). Esto sugiere la presencia de un PTM de 32 Da además de la supuesta modificación UNO. Las diferencias de masa de 32 Da generalmente se deben a dos oxidaciones en diferentes metioninas, pero las metioninas en esta secuencia de proteína están más cerca del C-terminal, donde se identificaron varios fragmentos sin este cambio de masa. Otra posibilidad para este cambio de masa sería una dihidroxilación de cisteína (UnimodAC: 425, Δm = 31,989829 Da). Hay dos cisteínas cerca de la región modificada (Fig. S7 complementaria). A pesar de que el pKa de la cisteína libre es de alrededor de 8,6, la presencia de residuos cargados positivamente cerca de la cisteína la disminuye en 3-4 unidades, lo que favorece la oxidación de su grupo tiol47. De acuerdo, hay una arginina (R54) y una lisina (K47) cerca de C51. Además, el C51 es el residuo de resolución y se sugirió que es muy importante en el proceso catalítico de esta peroxirredoxina46. Dos oxidaciones de cisteínas dan como resultado la formación de ácido sulfínico, que es una modificación irreversible y señal para la degradación de proteínas47. Por lo tanto, existe una buena posibilidad de que la proteína peroxirredoxina de C. glutamicum sufra modificaciones oxidativas que podrían regular su actividad e integridad. Además, la modificación sugerida por una peroxidación ONE sugiere un posible papel de esta proteína en la reparación de la membrana celular.

Otra tiorredoxina (Q8NLG6, trxB1), descrita como tiol-disulfuro isomerasa y tiorredoxinas, fue identificada por dos proteoformas, ambas con escisión N-terminal de 26 residuos de aminoácidos. Curiosamente, se identificó una proteoforma con un cambio de masa de aproximadamente −2 Da en una región cercana a dos cisteínas (Fig. S8 complementaria), lo que sugiere la formación de un enlace disulfuro. Se identificó otra proteoforma con un Δm de 29,88 Da con una posibilidad ambigua de modificaciones (Fig. S8 complementaria), como dos oxidaciones más un enlace disulfuro, o metilación seguida de oxidación. Además, ambas proteoformas se identificaron mediante espectros MS/MS de buena calidad con varios fragmentos que representan las dos formas modificadas (Fig. S8 complementaria). Se demostró que esta tiorredoxina responde al estrés por disulfuro, regulado por el factor sigma SigM en C. glutamicum48. Se sabe que las tiorredoxinas actúan como un sistema de reparación de residuos de cisteína oxidados, a través de su motivo CxxC. Sus residuos de cisteína se oxidan, formando un enlace disulfuro, produciendo la forma reducida de residuos de cisteína en la proteína objetivo47. La presencia de un −2 Da Δm identificado cerca de este motivo de trxB1 refuerza que se trata de un enlace disulfuro. Además, la identificación de proteoformas oxidadas y reducidas de una tiorredoxina indica la posibilidad de estudios comparativos para cuantificar estas proteoformas y estimar el estado redox de la célula.

El análisis proteómico de arriba hacia abajo del caballo de batalla industrial Corynebacterium glutamicum reveló varios PTM putativos nuevos de esta bacteria relacionados con diferentes procesos biológicos. Más precisamente, se identificaron 1125 proteoformas, de 273 proteínas. Además, las proteínas de membrana y las proteínas implicadas en la traducción parecen ser muy susceptibles a las PTM. Se identificaron proteínas relevantes para procesos biotecnológicos y metabólicos mediante nuevas proteoformas, lo que puede implicar nuevas estrategias de regulación. Por ejemplo, la proteína OdhI está involucrada en la producción de aminoácidos y fue identificada por una nueva proteoforma que sugiere una supuesta butirilación o peroxidación de crotonaldehído, que puede afectar su inhibición de ODHC, lo que influye en la producción de glutamato. La proteína endoproteinasa mepB también se identificó con una nueva proteoforma, escisión de 93 residuos de aminoácidos de su N-terminal, lo que sugiere un mecanismo no descrito de su activación en C. glutamicum con posibles efectos sobre el metabolismo de la pared celular. La proteína de membrana SecG, una subunidad del sistema de secreción de proteínas, tenía una supuesta formilación N-terminal, lo que sugiere una señalización de degradación con posibles consecuencias en la secreción de proteínas. Se identificó otra proteína de membrana con una supuesta formilación N-terminal, MscL, que puede influir en la salida de metabolitos. Se identificó una peroxirredoxina con una supuesta modificación UNO cerca de su residuo de cisteína catalítica, lo que sugiere un papel en las respuestas al estrés oxidativo. Se identificó otra proteína de respuesta al estrés con escisión N-terminal, que puede influir en la respuesta al estrés por disulfuro. La proteína HMADP, implicada en las condiciones de producción de glutamato y el transporte/desintoxicación de metales, fue identificada por dos proteoformas, una con un supuesto enlace disulfuro y otra con supuestas metilación y oxidación, lo que sugiere posibles efectos en la producción de glutamato y/o la desintoxicación de metales. La influencia de estas proteoformas en los procesos biológicos de C. glutamicum debe validarse e investigarse más a fondo. Por ejemplo, un estudio reciente utilizó la ingeniería genética de C. glutamicum OdhI, introduciendo residuos de aminoácidos mímicos, para investigar la influencia de la acetilación y la succinilación de OdhI en su interacción con ODHC40. Otra posibilidad sería el análisis comparativo que combina la proteómica descendente cuantitativa con la metabolómica, observando diferencias en la abundancia de proteoformas correlacionadas con cambios en la abundancia de metabolitos.

C. glutamicum ATCC 13032 se cultivó en agar de soja tríptica (17 g/L de digerido pancreático de caseína, 3 g/L de digerido papaico de soja, 5 g/L de NaCl, 2,5 g/L de K2HPO4, 2,5 g/L de monohidrato de glucosa, 1,5 g/L de agar) y el precultivo se realizó durante la noche en caldo de soja tríptica con agitación de 170 rpm a 30 °C. Posteriormente, el precultivo se utilizó para inocular tres frascos que contenían medio CGXII [20 g/L de (NH4)2SO4, 5 g/L de Urea, 40 g/L de glucosa, 1 g/L de KH2PO4, 1 g/L de L de K2HPO4, 0,25 g/L de MgSO4.7H2O, 42 g/L de MOPS, 10 mg/L de CaCl2, 10 mg/L de FeSO4.7H2O, 10 mg/L de MnSO4.7H2O, 1 mg/L de ZnSO4.7H2O, 0,2 mg/L de CuSO4, 0,02 mg/L de NiCl2.6H2O, 0,2 mg/L de biotina, 0,03 mg/L de ácido protocatequiico]49 [densidad óptica inicial (DO) = 1,0]. Las muestras se cultivaron durante 36 h bajo agitación de 170 rpm a 30 °C. Las medidas de crecimiento se evaluaron mediante OD600 utilizando un espectrofotómetro CLARIOstar (BMG LABTECH, Alemania).

Los cultivos de C. glutamicum se recolectaron y centrifugaron a 12 000 xg durante 10 min a 21 °C. Los sedimentos se lavaron con medio CGXII menos glucosa, resuspendiendo el sedimento y centrifugando a 12 000 xg durante 10 min a 21 °C. A continuación, las células se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 100 mM, DTT 2 mM, SDS al 4 %, Cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA cOmplete™ de Roche, Basilea, Suiza), seguido de una disgregación física mediante maceración en nitrógeno líquido. Después de la maceración, la solución se centrifugó a 20 000 × g durante 15 min a 21 °C para separar las partículas insolubles, y el sobrenadante con proteínas intracelulares solubles se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior. A continuación, las proteínas se cuantificaron mediante Qubit™ (Invitrogen). Se preparó una muestra agrupada usando cantidades iguales de proteína de cada réplica y 500 µg de la muestra agrupada se fraccionaron mediante electroforesis de atrapamiento de fracción líquida eluida en gel—GELFrEE50, usando un cartucho casero con gel de resolución al 12 % y gel de apilamiento al 4 %. Primero, la muestra se diluyó en tampón de muestra 2x (Tris–HCl 0,125 M, SDS 4 %, glicerol 20 %, DTT 0,1 M, azul de bromofenol 0,01 %), luego se sometió a electroforesis utilizando un tampón de corrida (Tris–HCl 0,025 M, Glicina 0,192 M, SDS 0,1%) y una corriente constante de 10 mA. Las fracciones se recogieron según el tiempo (en minutos) después de la elución con azul de bromofenol (0 min). Las recolecciones posteriores fueron las siguientes: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90 y 120 min. El rango de masa molecular de las proteínas de cada fracción se evaluó mediante SDS-PAGE51. A continuación, las fracciones GELFrEE se sometieron a precipitación con metanol/cloroformo/agua para la eliminación de SDS52. Brevemente, se añadieron cuatro volúmenes de metanol a las fracciones, seguido de la adición de 1 volumen de cloroformo y 3 volúmenes de agua, con 30 s de agitación vorticial posteriores a la inclusión de cada solución. Después de la adición de agua y el vortex, las soluciones se sometieron a centrifugación a 20 000 × g durante 10 min a 21 °C, lo que resultó en la formación de dos capas, con proteínas flotando entre ellas. Luego, se eliminó la capa superior, con cuidado de no perturbar el sedimento de proteína, y se agregaron 3 volúmenes de metanol, seguido de una mezcla suave y centrifugación a 20 000 xg durante 10 min a 21 °C. Posteriormente, se descartó el sobrenadante, se realizó un segundo lavado con 3 volúmenes de metanol como se describió anteriormente y el sedimento resultante se secó en bio-campana de flujo laminar. Después del secado, los gránulos se resuspendieron en acetonitrilo al 5 % y ácido fórmico al 0,1 % y se almacenaron a -80 °C antes de la LC-MS/MS.

Tres réplicas técnicas de las fracciones GELFrEE 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 y 11 se sometieron a un análisis de arriba hacia abajo en un sistema nano-UHPLC Dionex Ultimate 3000 acoplado a un espectrómetro de masas Orbitrap Elite™ (Thermo Scientific, Bremen, Alemania) (LC–MS/MS). Se usaron columnas analíticas (30 cm, 75 µM ID) y trampa (4 cm, 100 µM ID) empaquetadas con PLRPS 1000 A, 5 µM (Agilent, California, EE. UU.) para la separación de fase inversa. En la columna analítica se jaló una punta de aproximadamente 1 cm utilizando un instrumento P-2000 (Sutter, California, USA), para ser utilizada como emisor en el espectrómetro de masas. Ambas columnas se mantuvieron a temperatura ambiente, controlada a aproximadamente 22 °C. Las muestras se cargaron con un caudal de 3 µl/min durante 10 min, en condiciones isocráticas de acetonitrilo al 5 % y ácido fórmico al 0,1 %, luego se utilizó un gradiente bajo flujo de 0,230 µl/min para eluir las proteoformas de la columna para el análisis de MS. . El gradiente estaba compuesto por las soluciones A (ácido fórmico al 0,1 %) y B (acetonitrilo, ácido fórmico al 0,1 %) y fue creado por: 5 % B (0–10 min), 20 % B (10–55 min), 55 % B (55–60 min), 85 % B (60–80 min) y 5 % B (80–90 min). Las adquisiciones se realizaron durante el gradiente de 90 min en modo positivo, y los iones más abundantes de los 2 principales se fragmentaron mediante disociación de colisión de alta energía (HCD) escalonada aplicando una energía de colisión normalizada de 25, utilizando dos pasos, con un ancho de energía de colisión de 10, resultando en dos fragmentaciones separadas de iones con energía de colisión normalizada de 20 y 30, y análisis de todos los fragmentos resultantes juntos en el Orbitrap. El ancho de aislamiento de los precursores fue de 25 m/z, utilizando una duración de exclusión dinámica de 30 s. La disociación inducida por la fuente (SID) se utilizó con 15 eV en MS1 y el primer MS2, mientras que para el segundo ion más intenso, se estableció en 35 eV. Las resoluciones fueron 240.000 y 120.000 para MS1 y MS2, respectivamente. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE53 con el identificador de conjunto de datos PXD038038.

Los archivos sin formato Thermo se convirtieron al formato MzML utilizando la herramienta MSConvert54. La identificación y caracterización de las proteoformas se realizó mediante la herramienta de software TopPic suite, versión 1.455. Brevemente, los espectros se desconvolucionaron utilizando TopFD con parámetros predeterminados seguidos de identificaciones contra un proteoma de referencia C. glutamicum ATCC 13032 (11-2020), obtenido de UniProt (https://www.uniprot.org/). Se permitieron dos cambios de masa entre -500 Da y 500 Da en la identificación y las formas N-terminal se establecieron como "NINGUNA" (sin modificaciones), "NME" (escisión de metionina N-terminal), "NME-ACETILACIÓN" (N -escisión de metionina terminal y acetilación N-terminal), y "M-ACETILACIÓN" (acetilación N-terminal). Se adoptó una estrategia de tasa de descubrimiento falso con una base de datos señuelo, lo que resultó en la identificación de solo proteoformas con FDR por debajo del 1 % en el nivel de coincidencias de espectro de proteoformas (PrSM). A la caracterización y anotación de proteoformas siguió la interpretación visual de los archivos TopMSV21. La evaluación del PM de las proteínas detectadas y los tiempos de retención se realizaron utilizando VisioProt-MS56.

Los datos de identificación de proteoformas se analizaron en R 4.0.2 (R Core Team 2020) utilizando los paquetes tidyverse57 y ggplot258. Brevemente, se contó el número de cambios de masa identificados (Δm) y se definió la frecuencia de los Δm más comunes en función de los valores redondeados. Luego, se definió el número de residuos de aminoácidos modificados por cada Δm. La anotación funcional y el análisis de representación excesiva se realizaron con la aplicación String Cytoscape59,60 y DAVID61. También se realizó la interpretación visual de los términos sobrerrepresentados de DAVID utilizando el lenguaje informático R a través de la creación de un gráfico de burbujas con las herramientas presentes en ggplot2.

Los archivos sin procesar de espectros de masas están disponibles a través del archivo de la base de datos de identificaciones de proteómica (PRIDE, https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/, ID: PXD038038).

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Este trabajo fue apoyado por la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES), Financiadora de Estudios y Proyectos (FINEP) y Fundación de Apoyo a la Investigación del Distrito Federal (FAP-DF, Trámite N.: 00193.00001484/2021-91 y 0193001195/2016) .

Laboratorio de Química y Bioquímica de Proteínas, Departamento de Biología Celular, Instituto de Biología, Universidad de Brasilia, Brasilia, Brasil

Reynaldo Magalhães Melo, Jaques Miranda Ferreira de Souza, Wagner Fontes, Marcelo Valle de Sousa, Carlos André Ornelas Ricart & Luis Henrique Ferreira do Vale

Laboratorio de Bioquímica Vegetal, Departamento de Botánica, Instituto de Biología, Universidad de Brasilia, Brasilia, Brasil

Thomas Christopher RhysWilliams

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RMM realizó el crecimiento bacteriano y preparó la muestra para espectrometría de masas. RMM y TCRW analizaron los datos. JMFS, WF, MVS y LHFV realizaron el mantenimiento del espectrómetro de masas y la inyección de muestras. CAOR, RMM, TCRW y LHVF concibieron los experimentos. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Luis Henrique Ferreira do Vale.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Melo, RM, de Souza, JMF, Williams, TCR et al. Revelando las proteoformas de Corynebacterium glutamicum a través de la proteómica de arriba hacia abajo. Informe científico 13, 2602 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29857-6

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Recibido: 07 Diciembre 2022

Aceptado: 11 febrero 2023

Publicado: 14 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29857-6

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