Los sitios de unión de la coenzima A inducen la acilación proximal en familias de proteínas

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5029 (2023) Citar este artículo

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Las Nɛ-acilaciones de lisina, como la acetilación o la succinilación, son modificaciones postraduccionales que regulan la función de las proteínas. En las mitocondrias, la acilación de la lisina es predominantemente no enzimática y solo se acila un subconjunto específico del proteoma. La coenzima A (CoA) puede actuar como transportador de grupos acilo a través de un enlace tioéster, pero sigue sin entenderse bien qué controla la acilación de las lisinas mitocondriales. Usando conjuntos de datos publicados, aquí encontramos que las proteínas con un sitio de unión a CoA tienen más probabilidades de ser acetiladas, succiniladas y glutariladas. Usando modelos computacionales, mostramos que los residuos de lisina cerca del bolsillo de unión a CoA están altamente acilados en comparación con los que están más lejos. Presumimos que la unión de acil-CoA mejora la acilación de los residuos de lisina cercanos. Para probar esta hipótesis, coincubamos enoil-CoA hidratasa de cadena corta 1 (ECHS1), una proteína mitocondrial de unión a CoA, con succinil-CoA y CoA. Usando espectrometría de masas, encontramos que la succinil-CoA inducía la succinilación generalizada de lisina y que la CoA inhibía competitivamente la succinilación de ECHS1. La inhibición inducida por CoA en un sitio particular de lisina se correlacionó inversamente con la distancia entre esa lisina y el bolsillo de unión a CoA. Nuestro estudio indicó que CoA actúa como un inhibidor competitivo de la succinilación de ECHS1 al unirse al bolsillo de unión de CoA. En conjunto, esto sugiere que la acilación proximal en los sitios de unión a CoA es un mecanismo principal para la acilación de lisina en las mitocondrias.

Las acilaciones de lisina, como la acetilación, la succinilación o la glutarilación, son modificaciones postraduccionales (PTM)1,2,3 que inhiben las acciones de las proteínas en todos los reinos de la vida y todos los compartimentos celulares4,5,6. En las células eucariotas, la acilación de las histonas disminuye la afinidad electrostática entre las histonas y el ADN y generalmente se asocia con un aumento de la expresión génica7. La coenzima A (CoA) es un metabolito necesario en una amplia gama de procesos metabólicos, incluida la biosíntesis de ácidos grasos y cuerpos cetónicos, el metabolismo de aminoácidos, la oxidación de ácidos grasos y la regulación de la expresión génica8,9. En eucariotas, los tioésteres de CoA, como acetil-CoA, succinil-CoA y glutaril-CoA, actúan como los únicos donantes de grupos acilo celulares y reaccionan con los residuos de lisina a través de (1) transferencia enzimática mediada por enzimas acetiltransferasa, como p30010, 11, y (2) mecanismos no enzimáticos facilitados por altas concentraciones locales de especies de acil-CoA y pH alto5,12. En el citosol y el núcleo, la acilación de lisina está impulsada principalmente por enzimas aciltransferasa, como p300, y los patrones de acilación diferencial se han atribuido a la especificidad y distribución de estas enzimas. En la matriz mitocondrial, sin embargo, no se ha identificado ninguna enzima aciltransferasa universal y se cree que la acilación mitocondrial es mayoritariamente no enzimática13,14. Sin embargo, la distribución de lisinas aciladas en las mitocondrias no es estocástica, con diferencias de órdenes de magnitud en la acilación encontradas entre sitios14. Por qué algunos residuos de lisina mitocondrial son más susceptibles a las acilaciones que otros sigue siendo una pregunta importante sin respuesta.

El metabolismo mitocondrial depende de múltiples especies de acil-CoA que sirven como intermediarios clave en vías críticas, como el ciclo TCA (acetil-CoA, succinil-CoA), oxidación de ácidos grasos (acetil-CoA, propanoil-CoA, acil-CoA de cadena más larga). CoAs), catabolismo de cuerpos cetónicos (3-hidroximetilglutaril-CoA, acetoacetil-CoA) y catabolismo de aminoácidos (succinil-CoA, glutaril-CoA, HMG-CoA). Estas especies reactivas de acil-CoA sirven como donantes de acilo para las acilaciones no enzimáticas de las proteínas mitocondriales15. Se han identificado funciones reguladoras para un subconjunto limitado de acilaciones de lisina, que coexisten con la mayoría de las acilaciones de lisina que no son reguladoras y de baja estequiometría13,14. Es importante destacar que muchos residuos de lisina de proteína mitocondrial no están acilados, y las mediciones posteriores de la estequiometría de acetilación en hígado de ratón muestran un rango extremadamente amplio de acetilación14. El objetivo del presente estudio es investigar los mecanismos moleculares que controlan la acilación de residuos de lisina específicos en la mitocondria.

Si bien no se han identificado aciltransferasas mitocondriales universales, las desacilasas que eliminan grupos acilo de los residuos de lisina están bien caracterizadas. En las mitocondrias, las sirtuinas humanas SIRT3, SIRT4 y SIRT5 se han identificado como las principales lisina desacilasas. Las sirtuinas son una familia de proteínas desacilasas conservadas que utilizan NAD como cosustrato16,17. SIRT3 regula la acetilación de proteínas18,19, y SIRT5 regula modificaciones de acilo ácido, como succinilación, malonilación y glutarilación3,20,21,22. Se sabe menos sobre SIRT4 en términos de su actividad enzimática; sin embargo, actúa sobre residuos de acil-lisina de cadena ramificada23. Los estudios de espectrometría de masas han mapeado el panorama de múltiples marcas de acilación en múltiples especies, tejidos y compartimentos subcelulares. Los estudios proteómicos de la acilación de proteínas mitocondriales utilizando cepas de ratones knockout contra las sirtuinas mitocondriales SIRT3 y SIRT5 identificaron los sitios de acetilación, succinilación y glutarilación de proteínas. Dado que los ratones knockout para sirtuina mitocondrial son fenotípicamente normales, se han utilizado para generar un mapa proteómico de alta calidad de lisinas aciladas en líneas celulares y tejidos1,2,24. A pesar del importante papel que desempeña la acetilación de histonas en la regulación génica en el núcleo, los estudios acilómicos revelaron que la mayor parte de la acilación celular ocurre dentro de las mitocondrias25,26,27, muy probablemente a través de la transferencia no enzimática de grupos acilo de los tioésteres de CoA. Las concentraciones de CoA pueden alcanzar de 2,2 a más de 5 mM en las mitocondrias, y las concentraciones citosólicas se estiman en 0,02–0,14 mM28.

Curiosamente, las vías metabólicas (p. ej., ciclo TCA, oxidación de ácidos grasos, catabolismo de cuerpos cetónicos, catabolismo de aminoácidos y síntesis de cuerpos cetónicos) que contienen enzimas que interactúan directamente con especies reactivas de CoA están enriquecidas en acilaciones5,29,30. A menudo, los sitios validados experimentalmente ocurren en enzimas que se unen a una o más especies de acil-CoA, con acilación inhibidora encontrada en o cerca del sitio de unión de CoA2,3,30,31. Sin embargo, no se ha informado si la unión de CoA y la acilación de la enzima lisina están causalmente relacionadas. Además, un estudio reciente mostró un aumento modesto en la acetilación cerca de los sitios de unión de nucleótidos y sugirió que las enzimas con motivos de pliegues de Rossmann de unión a ADP pueden unirse a acil-CoAs32. Los autores también observaron un aumento en la malonilación de lisina por malonil-CoA cerca del sitio de unión de nucleótidos de la glutamato deshidrogenasa32. Estos estudios sugieren que las interacciones con las especies de CoA mejoran específicamente la acilación de las proteínas de unión a CoA (CoABP).

Aquí, investigamos los factores que controlan la acilación de lisina en las mitocondrias. Usando análisis computacionales de conjuntos de datos acilómicos publicados, demostramos que los CoABP tienen aproximadamente tres veces más probabilidades de ser acilados que los no CoABP en las mitocondrias. Además, modelamos posibles conformaciones estructurales de CoA y descubrimos que, en CoABP, los residuos de lisina cerca del bolsillo de unión a CoA tienen más probabilidades de estar acilados que los que están lejos del bolsillo de unión a CoA. Presumimos que la unión de acil-CoA podría mejorar la acilación de los residuos de lisina cercanos (Fig. 1) y probamos esta hipótesis en la enoil-CoA hidratasa de cadena corta 1 (ECHS1), una proteína mitocondrial con un bolsillo de unión a CoA. La incubación con succinil-CoA indujo una succinilación generalizada de la mayoría de los residuos de lisina ECHS1. Es importante destacar que la succinilación se inhibió competitivamente mediante la coincubación con CoA y la inhibición de CoA en un sitio de lisina particular se correlacionó inversamente con la distancia entre este residuo de lisina y el bolsillo de unión a CoA. Este hallazgo sugiere que la acilación proximal en los sitios de unión de la proteína CoA es un mecanismo principal para la acilación de lisina en ECHS1 y probablemente de manera más general en las mitocondrias.

El modelado computacional y el análisis de espectrometría de masas revelaron el mecanismo de acilación de lisina en la proteína de unión a CoA dentro de las mitocondrias. (a) Diagrama esquemático de los enfoques experimentales en este estudio y las hipótesis probadas. Los análisis estadísticos de conjuntos de datos de acilación de MS de todo el proteoma utilizando datos de anotación de bases de datos y el posterior modelado estructural de proteínas aciladas generaron un mecanismo propuesto para la hiperacilación de proteínas de unión a CoA. Este mecanismo fue validado por análisis MS in vitro de una proteína acilada informada.

Los tioésteres de CoA son los principales donantes de grupos acilo en células de mamíferos9,33 (Fig. 2a). Presumimos que los CoABP deberían enriquecerse en marcas de acilación, especialmente en las mitocondrias donde los tioésteres de CoA están presentes en altas concentraciones (Fig. 1). Para determinar si la unión de CoA induce la acilación de lisina, calculamos la fracción de lisinas aciladas identificadas en CoABP entre todas las lisinas aciladas. Se generó una lista de CoABP a partir de los datos de anotación de Uniprot (Tabla complementaria 1). En el proteoma de ratón anotado, el 2,7% de los residuos de lisina pertenecen a CoABP (14.759 de 547.206). Por el contrario, en un conjunto completo de datos de acetilación de hígado de ratón34, el 26,5 % de los residuos acilados procedían de CoABP de ratón (512 de 1934) (Fig. 2b). El cálculo de una razón de posibilidades relativa (OR) mostró que las lisinas en CoABP tenían 12,99 veces más probabilidades de ser acetiladas que las lisinas en no CoABP (OR = 12,99, p = 3,68E-297).

La acilación de lisina está significativamente sobrerrepresentada en las proteínas de unión a CoA. ( a ) Diagrama de modificaciones de acetilación, succinilación y glutarilación en residuos de proteína lisina. ( b ) Tabla que muestra el enriquecimiento de lisinas acetiladas en proteínas de unión a CoA analizadas en un conjunto de datos de acetiloma de hígado de ratón de células completas. Este enriquecimiento también está presente cuando el conjunto de datos se separó en lisinas mitocondriales y no mitocondriales. La significación se calculó mediante la prueba exacta de Fisher. ( c ) Tabla que muestra el enriquecimiento de lisinas acetiladas, succiniladas y glutariladas en proteínas de unión a CoA, utilizando conjuntos de datos de hígado de ratón mitocondrial. Para (b) y (c), las significaciones estadísticas se calcularon utilizando la prueba exacta de Fisher.

Dado que la mayor parte de la acilación celular ocurre en las mitocondrias25,27, comparamos las lisinas provenientes de proteínas mitocondriales y no mitocondriales (Fig. 2b). Las lisinas anotadas en CoABP representaron el 14,7% y el 2,1% de todas las lisinas en proteínas mitocondriales y no mitocondriales, respectivamente. En todo el conjunto de datos de hígado de ratón mencionado anteriormente, el 39,0 % (424 de 1088) de las lisinas acetiladas mitocondriales y el 10,4 % (88 de 846) de las lisinas no mitocondriales pertenecían a CoABP (Fig. 2b). Las lisinas en CoABP tenían 3,72 veces más probabilidades de ser acetiladas que las lisinas sin CoABP en las mitocondrias (OR = 3,72, p = 6,61E-81), y 5,34 veces más probabilidades fuera de las mitocondrias (OR = 5,34, p = 1,96E −33) (Figura 2b). Observamos un enriquecimiento similar en un conjunto de datos de acetilación de células enteras en células Hela humanas, aunque a un nivel más bajo35. En las células Hela, las lisinas en CoABP tenían 1,92 más probabilidades de ser acetiladas que las lisinas que no son CoABP (OR = 1,92, p = 3,61E-61, figura complementaria S1).

La mayoría de los sitios de acilación celular se encuentran en las mitocondrias, y centramos el resto de nuestra investigación en las proteínas mitocondriales, utilizando conjuntos de datos acilómicos de extractos de mitocondrias. Usando el mismo enfoque, determinamos si otros tipos de acilación se enriquecieron en CoABP mitocondriales de tres conjuntos de datos acilómicos separados. Las acilaciones de lisina mitocondrial, incluidas la acetilación1, la succinilación30 y la glutarilación3 (Fig. 2a), se han mapeado en muestras de tejido de ratón de cepa knockout que carecen de las sirtuina desacilasas correspondientes que eliminan esas modificaciones. Entre las proteínas mitocondriales, los residuos de lisina en CoABP representaron el 10,1 % de todas las lisinas (2513 de 24 973). Por el contrario, las lisinas acetiladas en CoABP representaron el 29,0% de todas las lisinas acetiladas (519 de 1788, Fig. 2c). De manera similar, en muestras mitocondriales de hígado de ratón, las lisinas succiniladas y glutariladas en CoABP representaron el 34,5 % (280 de 812) y el 37,2 % (204 de 549) de todas las proteínas succiniladas o glutariladas, respectivamente. (Figura 2c). En estos conjuntos de datos mitocondriales, las lisinas en CoABP tenían 3,66, 4,70 y 5,28 veces más probabilidades de ser acetiladas, succiniladas o glutariladas que las lisinas en no CoABP (OR = 3,66, p = 1,48E−100; OR = 4,70, p = 3.98E−75; OR = 5.28, p = 4.74E−62, respectivamente). Por lo tanto, en las mitocondrias, los residuos de lisina en los CoABP tienen una probabilidad significativamente mayor de estar acilados que los que no son CoABP.

A continuación, planteamos la hipótesis de que la unión de CoA en sí misma conduce a la acilación de lisina y, como consecuencia, las lisinas cercanas a un sitio de unión a CoA se acilan con mayor probabilidad que las distales a los sitios de unión a CoA (Fig. 1). Para probar esta hipótesis, utilizamos estructuras cristalinas de proteínas de unión a CoA y modelado computacional de la unión de CoA en sitios definidos estructuralmente para determinar si las lisinas proximales estaban enriquecidas en acilación.

Dentro de la molécula de CoA, el grupo acilo se conjuga con un grupo tiol unido a un resto fosfo-ADP del núcleo mediante un grupo prostético de ~ 15 Å con 9 enlaces sencillos rotacionalmente variables y 2 enlaces peptídicos conformacionalmente variables (Fig. 3a). El grupo acilo terminal de esta molécula grande y flexible puede asumir múltiples posiciones en relación con el resto fosfo-ADP del núcleo, y calcular la distancia física entre un residuo de lisina y el grupo acilo de un tioéster de acil-CoA unido a una proteína no es sencillo. adelante. Las estructuras cristalinas están disponibles para CoA unido a muchos sitios activos de proteínas, y aprovechamos esta información para calcular un conjunto de ~ 2000 modelos de conformaciones de CoA estéricamente válidas (Fig. 3a, Texto de código complementario). Estos modelos se seleccionaron para lograr la mayor dispersión posible de las posiciones terminales de azufre de CoA. AMP es la subsección conformacionalmente rígida más grande de la molécula de CoA y, por lo tanto, alineamos este conjunto conformacional con modelos de homología de CoABP, utilizando la fracción AMP como objetivo y el subconjunto de conformaciones de nuestro conjunto de CoA que se ajustaban estéricamente a cada modelo de proteína (Fig. 3a). El conjunto de conformaciones de CoA estéricamente válidas de cada proteína describe un conjunto de posiciones de tiol azufre que, a su vez, definen un conjunto de distancias al grupo amino de cada residuo de lisina potencialmente acilado. Para cada CoABP analizado, se calculó la distancia mínima entre cada residuo de lisina del conjunto conformacional CoA ajustado. (Figura 3a).

El modelado estructural de la conformación de CoA revela hiperacilación proximal cerca de los sitios de unión de CoA ( a ) Diagrama esquemático del enfoque computacional utilizado para calcular la distancia mínima entre un residuo de lisina y el grupo tiol de CoA en un bolsillo de unión de CoA de proteína. Se realizó un conjunto conformacional de conformación de CoA físicamente plausible combinando ángulos de rotación de enlace observados experimentalmente de estructuras cristalinas de CoA después del resto fosfo-ADP. Se generaron modelos estructurales completos de proteínas de unión a CoA a partir de conjuntos de datos acilómicos utilizando Swissmodel. El conjunto de CoA se acopló a cada modelo de proteína para generar un conjunto de ubicaciones de tiol de CoA estéricamente accesibles y se utilizó para puntuar la distancia de amina-tiol de cada residuo de lisina modelado. ( b ) Tabla que muestra el número de residuos de lisina no acilados y acilados que se encuentran en las proteínas de unión a CoA. Se calculó la razón de probabilidad relativa para las lisinas alcanzables por CoA (< 5 Å del azufre del conjunto de CoA más cercano) aciladas frente a los residuos de lisina más distales para cada acetilación, succinilación y glutarilación. La significación de los resultados se calculó mediante la prueba exacta de Fisher. ( c ) Probabilidad relativa de acilación de lisina en lisinas de proteínas de unión a CoA en función de la distancia de una lisina al conjunto de CoA. Datos mostrados para acetilación, succinilación y glutarilación.

Usamos una distancia de 5 Å entre la amina de lisina y el azufre de CoA como el límite para la proximidad del sitio de unión estrecha y nuevamente modelamos las observaciones de acilación como una razón de probabilidades. Esa distancia se eligió empíricamente para compensar la densidad de muestreo de posición de azufre de CoA limitada y el rechazo de las posiciones de azufre de CoA con superposición de Van der Waals a los átomos de amina de lisina36. Los valores de OR para las lisinas alcanzables por CoA acetiladas, succiniladas y glutariladas fueron 1,73, 2,62 y 3,03, respectivamente, y todas esas probabilidades de acilación aumentadas fueron significativas (Fig. 3b). Al graficar la fracción acumulada de todas las lisinas CoABP modeladas dentro de una distancia dada del conjunto CoA, observamos que las lisinas cercanas al sitio de unión de CoA tenían 2 a 3 veces más probabilidades de ser acetiladas, succiniladas y glutariladas que las lisinas más alejadas (Fig. 3c). A medida que aumentaba la distancia, la probabilidad de acilación disminuía hasta los niveles de fondo (Fig. 3c). Estos resultados validaron nuestra hipótesis e indicaron que la acilación de lisina aumentó significativamente cerca de los sitios de unión a CoA.

A continuación, queríamos verificar que el aumento de la acilación cerca de los sitios de unión a CoA fuera específico de CoA. CoA comparte un resto central de ADP con moléculas relacionadas (p. ej., ADP, ATP, NAD y NADP) (Fig. 4a). Sin embargo, el paso final de la síntesis de CoA agrega un fosfato a su grupo ribosa en una posición exclusiva de CoA, lo que potencialmente excluye estéricamente a CoA de los sitios de unión utilizados por estas moléculas relacionadas. La molécula de CoA de 3'-fosfato generalmente se une a un sitio de unión con carga altamente positiva, lo que requiere residuos de lisina o arginina en las secuencias de proteínas y conduce a un enriquecimiento estadístico de lisinas cerca de los sitios de unión de CoA37,38. Dado que las moléculas relacionadas tienen tamaños y cargas polivalentes negativas similares a las de la CoA, sus sitios de unión también dependen de los aminoácidos cargados positivamente. Dado el aumento en la acilación cerca de los sitios de unión de CoA (Fig. 3b, c), los efectos de carga local pueden impulsar la unión de CoA no específica y la acilación posterior. Para descartar esta posibilidad, comparamos la acilación cerca de los sitios de unión de NAD/NADP con los sitios de unión de CoA para determinar si el efecto de carga local es suficiente para impulsar la acilación local (Fig. 4b, c). Modelamos la accesibilidad estérica de CoA para los sitios NAD[P], utilizando el mismo protocolo que CoA y el resto ADP compartido como base para determinar la proximidad del sitio de unión para las lisinas en las proteínas de unión a NAD[P]. Nuevamente, al usar 5 Å como un límite para la unión estrecha, no observamos una mayor probabilidad de glutarilación en las lisinas alcanzables por CoA en las proteínas de unión a NAD [P], ya que ninguna lisina glutarilada era en realidad 'alcanzable por CoA' (Fig. 4b). A diferencia de los CoABP, donde las probabilidades de acilación aumentaron significativamente con la proximidad de la lisina a un sitio de unión a CoA, no se observaron cambios significativos en la acilación en las lisinas cercanas a los sitios de unión a NAD y NADP (Fig. 4b, c). Por lo tanto, el enriquecimiento por acilación cerca de los sitios de unión a CoA es específico de los sitios de unión a CoA y no puede explicarse por un efecto de carga más generalizable.

La hiperacilación proximal es específica de los sitios de unión a CoA. ( a ) Ilustración de las similitudes estructurales entre CoA y ADP, ATP, NAD y NADP. CoA comparte un resto central de ADP con ATP, NAD y NADP, pero su grupo fosforilo 3 'añadido puede evitar que encaje en los sitios de unión de esas especies. ( b ) Tabla que compara las razones de probabilidades relativas de las lisinas alcanzables por CoA que se glutarilan mediante la proteína de unión a CoA y las proteínas de unión a NAD [P]. ( c ) Probabilidad relativa de acilación de lisina en función de la distancia de una lisina desde el conjunto de CoA integrado en los sitios de unión de [acil-] CoA, NAD y NADP, que muestra una falta de enriquecimiento de acilación cerca de los sitios de unión de NAD y NADP.

Un mecanismo probable que explicaría nuestras observaciones es que los acil-CoA ocupan los sitios de unión de CoA y transfieren su grupo acilo a los residuos de lisina cercanos, ya sea directamente o utilizando residuos de cisteína cercanos como intermediarios39. De acuerdo con este modelo, la incubación de CoABP con acetil-CoA o succinil-CoA produce una hiperacetilación detectable después de un período de horas12. Si esta hipótesis es correcta, podemos esperar que (1) los residuos de lisina cerca del sitio de unión de CoA se acilen a un ritmo más rápido y (2) la acilación se inhiba competitivamente por un exceso de CoA no acilado (Fig. 5a) .

La succinilación in vitro de ECHS1 con succinil-CoA es inhibida competitivamente por CoA ( a ) Diagrama esquemático de la succinilación de ECHS1 por succinil-CoA (Su-CoA) e inhibición por CoA. ( b ) Transferencia de Western de ECHS1 recombinante humano usando electroforesis en gel nativo. ( c ) Detección de transferencia Western de los niveles de succinil lisina (SuK) en ECHS1 y BSA coincubados con Su-CoA en presencia y ausencia de CoA durante tiempos variables (5, 15 y 45 min y 2 h). ( d ) Distancia de residuos de lisina individuales a CoA en ECHS1. ( e ) Experimento de curso temporal de espectrometría de masas que mide el cambio en los niveles de succinilación en lisinas individuales en ECHS1. ECHS1 se coincubó con Su-CoA 400 µM durante 0, 5, 15 o 45 min y con CoA 0, 1 o 10 mM. La abundancia de niveles de SuK para cada residuo se normalizó con el control negativo ECHS1 (no tratado con CoA o Su-CoA), (N = 4 por tratamiento). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001; ns, no significativo. Se realizó un ANOVA de una vía. En las condiciones no tratadas con CoA, cada punto de tiempo se comparó con el grupo de 0 min. En las condiciones de 45 min, ambos grupos tratados con CoA (1 y 10 mM) se compararon con el grupo no tratado con CoA.

Intentamos probar esta hipótesis usando enoil-CoA hidratasa recombinante, cadena corta 1 (ECHS1), purificada de E. coli. ECHS1 es un CoABP mitocondrial de 30,6 kDa. ECHS1 forma homohexámeros, y la electroforesis en gel nativo confirmó que ECHS1 purificado estaba presente en un estado altamente multimerizado (Fig. 5b). Dado que la acetilación endógena a menudo ocurre en proteínas40 expresadas en bacterias, usamos succinil-CoA como nuestro modelo de acil-CoA para la mayoría de los experimentos. ECHS1 se incubó con succinil-CoA (400 μM) y medimos cómo el aumento del tiempo de incubación (5, 15, 45 y 120 min) afectó la succinilación de ECHS1. Se usó albúmina de suero bovino (BSA) como control sin CoABP. Los resultados de la transferencia Western mostraron que los niveles de succinilación inducidos por la incubación con succinil-CoA aumentaron de manera dependiente del tiempo en ambas proteínas (Fig. 5c). Es importante destacar que la coincubación con un exceso de 25 molar de CoA (10 mM) inhibió fuertemente la succinilación de ECHS1, pero no de BSA. Esto sugiere que la succinilación por succinil-CoA depende parcialmente de su interacción con el bolsillo de unión a ECHS1 CoA y que la inhibición de CoA es específica de CoABP (Fig. 5a).

Para caracterizar en detalle los sitios de lisina succinilados diferencialmente, la succinilación de ECHS1 se analizó mediante cromatografía líquida, espectrometría de masas en tándem de adquisición dependiente de datos (LC-DDAMS/MS) después de la purificación en gel de proteínas y la digestión con tripsina en gel. Observamos que 10 de los 24 residuos de lisina dentro de ECHS1 (Fig. 5d) se succinilaron al incubar con succinil-CoA. Cabe destacar que K284 y K288 dentro del mismo péptido disuccinilado no pueden distinguirse. De acuerdo con los resultados de la transferencia Western, los niveles de succinilación inducidos por la incubación con succinil-CoA aumentaron en cada uno de estos residuos de lisina (K282, K284/K288, K43, K204, K234, K273, K127, K261, K118) en un tiempo -manera dependiente a los 0, 5, 15 y 45 min (Fig. 5e). Además, la succinilación de ECHS1 fue inhibida por CoA en estos residuos de lisina. Por lo tanto, la succinilación de residuos de lisina individuales en ECHS1 fue inhibida por CoA de manera dependiente de la concentración.

Para determinar la sensibilidad de los residuos de lisina individuales a la inhibición de CoA, incubamos ECHS1 recombinante con succinil-CoA (400 μM) y concentraciones crecientes de CoA (0–10 mM). Después de la digestión de proteínas y el análisis LC-MS/MS, obtuvimos datos sólidos de MS para siete residuos de lisina (es decir, K282, K284/K288, K43, K204, K234 y K118). Es importante destacar que la succinilación fue inhibida competitivamente por la concentración creciente de CoA (Fig. 6a), y el IC50 para cada una de estas curvas de inhibición osciló entre 331 y 1924 μM. A continuación, preguntamos, para cada residuo de lisina succinilada, si la inhibición inducida por CoA se vio afectada por su distancia al bolsillo de unión a CoA. Las distancias de lisina al bolsillo de unión de CoA se calcularon con el mismo método descrito anteriormente (Fig. 3a), utilizando la estructura cristalina ECHS (PDB ID: 2HW5) y calculando el conjunto de conformaciones estéricamente accesibles para CoA. Trazamos las distancias de lisina desde el bolsillo de unión de CoA con los valores de IC50 y realizamos un análisis de regresión lineal. Observamos una relación positiva entre la distancia de lisina desde el bolsillo de unión a CoA y el IC50 de cada residuo (R2 = 0.8235) (Fig. 6b). Esto mostró que las lisinas más cercanas al bolsillo de unión a CoA eran más sensibles a la inhibición de CoA que las lisinas más alejadas. En conjunto, estos experimentos indican que la succinilación de lisina cerca del bolsillo de unión de ECHS1 CoA está mediada por la unión de acil-CoA y está sujeta a la inhibición competitiva por CoA (Fig. 1).

La inhibición de CoA en un sitio particular de lisina está inversamente correlacionada con la distancia al bolsillo de unión de CoA. ( a ) Curva de inhibición y IC50 por residuo para CoA que inhibe la succinilación de residuos de lisina individuales en ECHS1. ECHS1 se incubó con succinil-CoA y concentraciones crecientes de CoA. Las curvas de dosis-respuesta se expresaron como el logaritmo de la concentración de CoA frente a la inhibición de SuK. El porcentaje de inhibición para cada residuo se calculó midiendo el porcentaje de cambio entre los niveles de succinilación cuando ECHS1 se incubó conjuntamente con succinil-CoA en presencia y ausencia de tratamiento con CoA durante 45 min. N = 4 por tratamiento. (b) Gráfico que muestra la relación correlativa entre las distancias de los residuos de lisina frente a la IC50 (μM) (N = 5, R2 = 0,8235). En el análisis de MS, los niveles de succinilación para K284 y K288 se combinaron ya que ambos residuos se encontraron exclusivamente en un péptido compartido después de la tripsinización. Como resultado, estos sitios no se usaron para generar el valor R2 o la línea de tendencia y se incluyen en el gráfico como puntos rojos.

Además de este experimento de succinilación, realizamos un experimento de acetilación similar usando proteína ECHS1 recombinante incubada con acetil-CoA y CoA. Dado que la acetilación endógena ocurre en proteínas40 expresadas en bacterias, solo analizamos la acetilación en tres sitios de lisina cerca del bolsillo de unión a CoA. De manera similar, los resultados del análisis de MS mostraron que la acetilación en los residuos de lisina cerca del bolsillo de unión a CoA (K282, K284 y K204) en ECHS1 inducida por la incubación con acetil-CoA fue inhibida por un exceso de 25 molar de CoA (Fig. 7). Estos resultados sugieren que CoA inhibe más generalmente la acilación de lisina inducida por acil-CoA cerca de los bolsillos de unión a CoA para múltiples especies de acilación distintas.

La acetilación in vitro de ECHS1 con acetil-CoA es inhibida competitivamente por CoA en las lisinas próximas al sitio de unión de CoA. ( a ) La acetilación en tres sitios en ECHS1 recombinante producido bacterianamente aumenta in vitro después de la adición de acetil-CoA, y estos sitios se encuentran cerca del sitio de unión de CoA. Esta acetilación a través de acetil-CoA exógeno se inhibe agregando un exceso molar de CoA.

Usando modelos computacionales validados por experimentos in vitro, mostramos que la acilación se enriquece cerca del sitio activo de CoABP. En particular, nuestros resultados indican: (1) las CoABP tienen muchas más probabilidades de ser aciladas, especialmente en las mitocondrias, (2) las lisinas físicamente cercanas al sitio de unión de CoA tienen más probabilidades de ser aciladas que las que están lejos, (3) en -la acilación in vitro de CoABP depende de la unión de acil-CoA, y (4) las lisinas cerca del sitio de unión de CoA son más sensibles a la inhibición que las lisinas distales. Este estudio sugiere que la acilación proximal en los sitios de unión de la proteína CoA es un mecanismo principal para la acilación de la lisina en las mitocondrias.

Las reacciones de modificación de proteínas, como la fosforilación, la acilación o la glicosilación, normalmente se realizan mediante enzimas transferasa dedicadas que estabilizan los estados de transición de la reacción y unen la proteína modificada y un precursor de molécula pequeña41,42,43. En el caso de la acilación proximal mediada por el sitio de unión, la reacción usa un sitio de unión preformado para CoA (como con la catálisis enzimática canónica) pero no una estabilización específica del sitio de transición (como con las reacciones no enzimáticas). La acilación proximal mediada por CoA tiene características de reacciones tanto enzimáticas como no enzimáticas y podría calificarse como un mecanismo de reacción "semi-enzimático", que mejora una clase de reacciones secundarias relacionadas de una manera químicamente selectiva y estéricamente restringida. Estas reacciones semienzimáticas pueden desempeñar potencialmente un papel importante en la regulación del metabolismo celular. En particular, los sitios de unión de CoA a menudo presentan residuos de lisina con funciones importantes en la unión de CoA con carga negativa, y el trabajo anterior de nuestro grupo y otros ha demostrado que estos residuos están acilados in vivo y que las mutaciones que imitan la acilación disminuyen la función enzimática30,44 . La acilación semienzimática puede ofrecer un mecanismo para que las enzimas de unión a CoA se autoinhiban con el tiempo a través de la autoacilación, con una tasa sensible a los niveles locales de CoA frente a acil-CoA. El grado en que la acilación semienzimática regula la función de las proteínas y contribuye a los procesos metabólicos será una cuestión interesante que abordar en estudios futuros.

Los tioésteres de CoA comparten (1) un resto de unión común que puede ocupar una amplia variedad de sitios de unión en todo el proteoma y (2) un enlace terminal altamente reactivo que transfiere una carga útil de acilo a un grupo químico cercano común. Estos dos factores generan una gran cantidad de PTM detectables en el proteoma y permiten los análisis computacionales descritos anteriormente. Sin embargo, otros metabolitos reactivos podrían exhibir el mismo comportamiento, aunque en menos proteínas. Otras reacciones generadoras de PTM, como el 1,3-bisfosfoglicerato45, muestran patrones similares de aumento de la velocidad cerca de los sitios de unión de los metabolitos precursores de PTM. Aunque el conjunto resultante de PTM en otros metabolitos reactivos puede no estar lo suficientemente extendido para la detección y el análisis basados en LC-MS/MS proteómicos, las técnicas más enfocadas pueden encontrar la inhibición de un conjunto más amplio de enzimas metabólicas como efectos secundarios de las reacciones que catalizan. Creemos que la combinación del enfoque computacional y experimental utilizado aquí descubrió nuevos mecanismos en el campo de la acilación, y anticipamos que también ilumina los mecanismos para otros PTM inducidos por metabolitos o fármacos reactivos.

En 2020, James et al. informó que las enzimas que incorporan el pliegue de Rossman de unión a ADP participan en la autoacilación, similar a nuestras observaciones32. En particular, demostraron que la automalonilación por la enzima glutamato deshidrogenasa (GDH) que se une a NAD y ATP fue (1) inhibida por un exceso molar de CoA desnudo y (2) mayor para los residuos de lisina cerca de los sitios de unión de nucleótidos de GDH. Usando una función de distancia lineal en lugar de un conjunto de CoA modelado estructuralmente, también encontraron que la estequiometría de acetilación era, en promedio, ligeramente más alta para los residuos de lisina cerca de los sitios de unión de nucleótidos en las superficies de las enzimas. Nuestro estudio confirma y amplía la validez de su hallazgo. Primero, al considerar múltiples subtipos de acilación en paralelo, observamos un aumento en el enriquecimiento de modificaciones ácidas multivalentes, como la glutarilación y la succinilación, sobre la acetilación. Si bien se informaron anteriormente tasas más altas de acilación de lisina para estas modificaciones multivalentes15, nuestro estudio indica que este efecto se amplifica aún más por la estructura de la proteína local, en particular alrededor de un bolsillo de unión a CoA. En segundo lugar, mientras que James et al. informó la automalonilación impulsada por el sitio de unión a NAD para GDH, no observamos este efecto a nivel de todo el proteoma. Demostraron que el NAD es un inhibidor inferior de la autoacilación en los extractos de proteínas mitocondriales, en comparación con el CoA desnudo, y que otros derivados del ADP tenían un efecto intermedio entre el NAD[P][H] y el CoA desnudo. Sospechamos que, mientras que algunos subconjuntos de sitios de unión a NAD se unen a CoA de manera eficiente para la autoacilación por especies de acil-CoA, muchos otros no lo hacen. Por lo tanto, la propensión de GDH a la acilación inhibitoria puede ser un valor atípico entre las enzimas de unión a NAD. Por el contrario, cada proteína capaz de unirse a CoA para su función canónica debería exhibir algún grado de autoacilación, aunque se requerirán más estudios para comprender mejor las diferencias en las tasas entre las enzimas como consecuencia de su estructura.

Finalmente, mediante el análisis computacional de datos de varios cientos de proteínas en conjuntos de datos publicados y la validación de nuestro modelo computacional utilizando una sola proteína de unión a CoA, demostramos que la acilación de la proteína de unión a CoA mitocondrial ocurre a través de la unión de especies de acil-CoA al bolsillo de unión de CoA. Serán necesarios más estudios para ampliar la validez de nuestros hallazgos, pero con esta publicación, esperamos que los investigadores interesados en la acilación puedan comenzar a analizar cuantitativamente el impacto de las propiedades bioquímicas y estructurales de las proteínas en las diversas acilaciones que acumulan. En última instancia, los modelos mecanicistas más detallados también deberían ayudar a identificar las condiciones metabólicas en las que estos PTM también tienen un mayor impacto en la biología.

Se utilizaron listas de péptidos observados de información complementaria publicada de estudios de EM anteriores para generar ID de UniProt. Se consideró que una proteína se unía a CoA si su actividad enzimática implicaba cualquier derivado de CoA, tenía cualquier derivado de CoA anotado como ligando o tenía un sitio activo o de unión a derivado de CoA anotado. Se realizaron procedimientos similares para las proteínas de unión a NAD y NADP.

Para cada proteína de unión a CoA o NAD[P], se generaron modelos de homología utilizando las herramientas de construcción de modelos interactivos de Swissmodel46. PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC) sometió a las proteínas con modelos de homología a alineamiento estructural contra el conjunto de estructuras cristalinas determinadas experimentalmente con unión a CoA, utilizando secuencias de comandos de Python para configurar y comparar alineamientos. Se usaron pares superiores de modelos de homología de proteínas aciladas y proteínas unidas a CoA estructuralmente similares para generar ubicaciones de CoA en el contexto de modelos de homología aciladas utilizando solo los residuos de proteínas locales de CoA dentro de 20 Å de átomos de fosfato de CoA como un objetivo de alineación estructural.

Una vez colocado, el resto base fosfo-AMP de CoA se usó como objetivo de alineación para colocar un conjunto conformacional de CoA autoevitante, del cual se excluyó cada confirmación de CoA si compartía más de 1Å3 del volumen de colisión con el modelo de proteína. Este conjunto conformacional de CoA de entrada compartida se generó aplicando ángulos diédricos de la columna vertebral de estructuras de ligandos de CoA existentes de RCSB47 para rotar una estructura de ligandos de CoA idealizada. Las conformaciones individuales se generaron mediante muestreo aleatorio de columnas vertebrales medidas experimentalmente, y se aceptaron iterativamente en el modelo final si su tiol terminal estaba a más de un átomo de azufre del radio de Van der Waals de distancia de cualquier otro modelo en el conjunto hasta que se seleccionaron 2000 conformaciones.

Para los sitios de unión de NAD[P], se usó el núcleo de AMP compartido común a CoA y NAD[P] para colocar el conjunto conformacional de CoA; por lo demás, el modelado se realizó igual que para las proteínas de unión a CoA.

A los residuos de lisina en todos los modelos de homología con conjuntos de CoA construidos se les asignó una puntuación de distancia desde el centro de cada átomo de amina primaria terminal de lisina hasta el centro del átomo de azufre de tiol más cercano entre el conjunto de conformaciones de CoA estéricamente válidas del modelo.

Para cada subtipo de acilación de lisina considerado (acetilación, succinilación y glutarilación), evaluamos los residuos de lisina de todos los modelos de homología en los que se observó al menos un residuo de lisina modelado en el estudio proteómico de EM correspondiente. Los residuos de lisina individuales acilados frente a los residuos de lisina no acilados entre estas proteínas aciladas se usaron junto con las puntuaciones de distancia descritas anteriormente para calcular el enriquecimiento relativo de la acilación dentro de X Angstroms del conjunto CoA, y la prueba exacta de Fisher implementada en Scipy.stats48 fue utilizado para evaluar la significación estadística del enriquecimiento.

El código desarrollado para este estudio está disponible en https://github.com/ccarrico/CoABindingSiteAnalyses.

La enoil-CoA hidratasa de cadena corta 1 recombinante (ECHS1) (0,3 µg/µL) se adquirió de Novus Biologicals y se disolvió en Tris 50 mM, pH 8, NaCl 150 mM con concentraciones variables de CoA (0–10 mM) a 37 °C . La reacción se inició agregando succinil-CoA o acetil-CoA a 37 °C. Las reacciones se detuvieron mediante congelación rápida en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento.

Se utilizaron geles de poliacrilamida (10-15%) para la separación de ECHS1 o BSA. La proteína se transfirió a membranas de nitrocelulosa utilizando el sistema de transferencia BioRad. Las membranas se bloquearon con BSA al 5 % en solución salina tamponada con Tris (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,1 %, pH 7,4) y se probaron con antisuccinil lisina (PTM Biolabs), luego se probaron con anticuerpo secundario en leche en Tris - solución salina tamponada, incubada con anticuerpos. Las intensidades de quimioluminiscencia se detectaron usando el sistema de imágenes ChemiDoc (BioRad, Hercules, CA).

Para los experimentos de MS, se coincubaron 3 µg de ECHS1 con succinil-CoA 400 µM durante 0, 5, 15 o 45 min y con CoA 0, 1 o 10 mM (tampón: Tris 50 mM, pH 8,0 y 150 NaCl mM). Cada condición contenía cuatro réplicas.

Cada muestra que contenía 3 µg de proteína madre ECHS1 se incubó en ditiotreitol (DTT) 50 mM y tampón de muestra de tampón de muestra Laemmli durante 10 min a 70 °C. Las muestras se corrieron en geles apilados de Bis-Tris al 4-12% prefabricados durante 20 min. La digestión en gel se realizó al día siguiente. Las bandas de gel se cortaron en cubitos y se recogieron en tubos y se deshidrataron con un tampón de deshidratación (bicarbonato de amonio 25 mM en acetonitrilo al 50% y agua). Las muestras de gel se secaron en Speed Vac, se redujeron con DTT 10 mM y se incubaron durante 1 h a 56 °C con agitación, y luego se alquilaron con yodoacetamida 55 mM y se incubaron durante 45 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Los geles troceados se lavaron con bicarbonato de amonio 25 mM en agua y luego se deshidrataron una vez más con el tampón de deshidratación. Las muestras se secaron en Speed Vac una vez más, después de lo cual las proteínas se incubaron en 250 ng de tripsina durante 30 min a 4 °C y se digirieron durante la noche a 37 °C con agitación. A la mañana siguiente, los productos de digestión se sometieron a agua y luego acetonitrilo al 50 % y ácido fórmico al 5 % en agua. Después de cada adición de solución, la digestión acuosa de cada muestra se recogió en un tubo nuevo. Estas extracciones de péptidos combinados se secaron en el vacío rápido durante 2 horas para alcanzar la sequedad y luego se resuspendieron en ácido fórmico al 0,2 %.

Las muestras de péptidos resuspendidas se desalinizaron con Zip Tips que contenían un disco C18, se concentraron y se resuspendieron en ácido fórmico acuoso al 0,2 % que contenía estándares peptídicos de tiempo de retención "Hyper Reaction Monitoring" de espectrometría de masas (iRT, Biognosys, Schlieren, Suiza).

Brevemente, las muestras se analizaron mediante HPLC-ESI-MS/MS de fase inversa utilizando un sistema de HPLC 2D nano-LC Eksigent Ultra Plus (Dublin, CA) con un sistema cHiPLC (Eksigent), que se conectó directamente a un cuadrupolo time-of. -flight (QqTOF) TripleTOF 6600 espectrómetro de masas (SCIEX, Concord, CA). Después de la inyección, las mezclas de péptidos se cargaron en un chip de precolumna C18 (chip ChromXP C18-CL de 200 µm × 0,4 mm, 3 µm, 120 Å, SCIEX) y se lavaron a 2 µl/min durante 10 min con el solvente de carga (H2O /0,1% de ácido fórmico) para la desalinización. Posteriormente, los péptidos se transfirieron al chip ChromXP C18-CL de 75 µm × 15 cm, 3 µm, 120 Å (SCIEX) y se eluyeron a un caudal de 300 nL/min con un gradiente de 2 h con disolvente acuoso y acetonitrilo. tampones

Adquisiciones dependientes de datos (para la creación de bibliotecas espectrales): para las identificaciones de péptidos y proteínas, el espectrómetro de masas se operó en modo de adquisición dependiente de datos (DDA), donde se aislaron los 30 iones precursores más abundantes del escaneo MS1 de la encuesta (250 ms). a una resolución de 1 m/z para espectrometría de masas en tándem de disociación inducida por colisión (CID-MS/MS, 100 ms por MS/MS, modo de escaneo de iones producto de "alta sensibilidad") usando el software Analyst 1.7 (compilación 96) con un ciclo total tiempo de 3,3 s como se describe49.

Adquisiciones independientes de datos: para la cuantificación, todas las muestras de péptidos se analizaron mediante adquisición independiente de datos (DIA, por ejemplo, SWATH), utilizando 64 ventanas de aislamiento de ancho variable50,51. El ancho de ventana variable se ajusta de acuerdo con la complejidad de la corriente de iones MS1 típica observada dentro de un cierto rango de m/z utilizando un algoritmo de 'método de ventana variable' DIA (se eligieron ventanas más estrechas en rangos de m/z 'ocupados', ventanas anchas en rangos m/z con pocos iones precursores eluidos). Las adquisiciones DIA producen espectros MS/MS complejos, que son una combinación de todos los analitos dentro de cada ventana Q1 m/z seleccionada. El tiempo de ciclo DIA de 3,2 s incluyó una exploración de iones precursores de 250 ms, seguida de un tiempo de acumulación de 45 ms para cada uno de los 64 segmentos SWATH variables.

Los DDA espectrométricos de masas se analizaron utilizando el motor de búsqueda de la base de datos ProteinPilot (SCIEX 5.0, revisión 4769) utilizando el algoritmo Paragon (5.0.0.0.4767)52, con énfasis de búsqueda para 'succinilación'. Utilizando los resultados de estos motores de búsqueda de bases de datos, se generó una biblioteca espectral MS/MS en Skyline daily v20.2.1.404. Los datos de DIA/SWATH se procesaron para la cuantificación relativa, comparando las áreas de los picos de péptidos acilados de diversas condiciones. Para los conjuntos de datos DIA/SWATH MS2, la cuantificación se basó en XIC de 6 a 10 iones de fragmentos MS/MS, generalmente iones y y b, que se emparejan con péptidos específicos presentes en las bibliotecas espectrales. Se aceptaron cambios significativos a un FDR del 5 % (valor q < 0,05).

Los datos brutos de espectrometría de masas se han depositado en el repositorio MassIVE (MSV000089448) y también están disponibles en ProteomeXchange (PXD033787). El código desarrollado para este estudio está disponible en https://github.com/ccarrico/CoABindingSiteAnalyses.

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Shilov, IV et al. El algoritmo Paragon, un motor de búsqueda de próxima generación que utiliza valores de temperatura de secuencia, valores de temperatura de secuencia y probabilidades de características para identificar péptidos a partir de espectros de masas en tándem. mol. Celúla. Proteoma. 6, 1638-1655 (2007).

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Reconocemos la subvención NIDDK R24 DK085610 (Verdin), y reconocemos el apoyo de instrumentación de la subvención de instrumentación compartida NCRR 1S10 OD016281 (Buck Institute). También agradecemos a la Fundación Larry L Hillblom por su apoyo. Agradecemos a Gary Howards y John Carroll por su ayuda en la edición del manuscrito y las figuras, respectivamente.

mario walter

Dirección actual: División de Vacunas y Enfermedades Infecciosas, Fred Hutch Cancer Center, Seattle, WA, EE. UU.

Estos autores contribuyeron por igual: Chris Carrico y Andrew Cruz.

Instituto Buck para la Investigación sobre el Envejecimiento, Novato, CA, 94945, EE. UU.

Chris Carrico, Andrew Cruz, Marius Walter, Jesse Meyer, Cameron Wehrfritz, Samah Shah, Lei Wei, Birgit Schilling y Eric Verdin

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

CC, AC y EV diseñaron el estudio y analizaron los datos. CC llevó a cabo el modelado computacional. CC, AC realizó experimentos y análisis de biología molecular. JM, CW, SS, LW y BS realizaron experimentos y análisis de espectrometría de masas. CC, AC, MW y EV escribieron el manuscrito con comentarios de todos los autores. BS y EV supervisado y financiado el estudio.

Correspondencia a Eric Verdin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Carrico, C., Cruz, A., Walter, M. et al. Los sitios de unión de la coenzima A inducen la acilación proximal en las familias de proteínas. Informe científico 13, 5029 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31900-5

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Recibido: 28 julio 2022

Aceptado: 20 de marzo de 2023

Publicado: 28 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31900-5

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