Tumor

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 60 (2023) Citar este artículo

2519 Accesos

8 Altmetric

Detalles de métricas

Sigue existiendo la necesidad de ligandos específicos para el cáncer que puedan proporcionar una amplia variedad de cargas terapéuticas. Los ligandos que demuestran tanto la especificidad tumoral como la capacidad de mediar en la captación celular eficaz de un agente terapéutico son fundamentales para expandir las terapias dirigidas. Anteriormente informamos sobre la selección de un péptido de una biblioteca de péptidos utilizando una línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) como objetivo. Aquí optimizamos nuestro péptido líder mediante una serie de modificaciones químicas que incluyen truncamientos, protección N-terminal y cambios en la valencia. El péptido de 10 aminoácidos resultante tiene una afinidad de <40 nM en cuatro líneas celulares de NSCLC diferentes como monómero y es estable en el suero humano durante >48 h. El péptido se internaliza rápidamente al unirse a la célula y se dirige al lisosoma. El péptido se aloja en un tumor en un modelo animal y se retiene hasta 72 h. Es importante destacar que demostramos que el péptido puede administrar la proteína citotóxica saporina específicamente a las células cancerosas in vitro e in vivo, lo que resulta en un agente anticancerígeno eficaz.

A pesar de una disminución en los casos nuevos en los últimos 30 años, el cáncer de pulmón sigue siendo responsable de aproximadamente el 20 % de las muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos1. La detección de fumadores con tomografía computarizada en espiral de baja dosis ha mejorado la detección, pero solo el 17% de los cánceres de pulmón se detectan en una etapa localizada. Las terapias más nuevas han cambiado su enfoque hacia tratamientos guiados molecularmente que dependen del genotipo y/o fenotipo del tumor2. Una de esas clases terapéuticas es el conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC). Los anticuerpos sirven como sistemas de administración al dirigirse a los receptores de la superficie celular cuya expresión está aumentada en un tumor pero tiene una expresión insignificante en las células normales. Los anticuerpos monoclonales deben exhibir una alta especificidad celular para evitar la entrega a las células normales. Además, deben internalizarse en la celda para entregar la carga útil tóxica. Debido a la especificidad del anticuerpo por las células cancerosas, los fármacos demasiado tóxicos para ser administrados sistémicamente pueden utilizarse como ADC. La aprobación de Kadcyla®3, un anticuerpo anti-HER2 conjugado con emtansina, y Adcetris4,5, un anticuerpo anti-CD30 conjugado con monometil auristatina, revitalizó el desarrollo de ADC. Desde 2017, ocho ADC han recibido la aprobación de la FDA6,7,8. Sin embargo, hasta la fecha no existen ADC aprobados para el tratamiento del cáncer de pulmón9.

Los péptidos ofrecen una clase alternativa de moléculas que atacan el cáncer. Los péptidos rivalizan con los anticuerpos en afinidad y especificidad. Son más fáciles de producir y se pueden modificar de forma regional específica para transportar una variedad de cargas, incluida la bioterapéutica macromolecular. El biopanning de presentación de fagos se ha empleado para seleccionar ligandos peptídicos para nuevos biomarcadores presentes en el cáncer10. Previamente aislamos un péptido de una biblioteca de péptidos que se muestra en fagos mediante bioselección en la línea celular HCC1511 de NSCLC. Este péptido, ahora denominado MGS4 (anteriormente HCC15.2) se internaliza en ~54 % (21/39) de las líneas de NSCLC analizadas y se une al 24 % (14/59) de las muestras de biopsia de NSCLC humano fijadas en una micromatriz de tejido. La falta de internalización en células epiteliales bronquiales humanas inmortalizadas pero no transformadas, así como la falta de unión a muestras de tejido pulmonar adyacente normal en las micromatrices de tejido establece la especificidad de este péptido para células cancerosas frente a tejidos pulmonares normales. Como tal, MGS4 es una molécula de orientación prometedora para la administración de citotóxicos a un subconjunto de cánceres. Aquí optimizamos nuestro péptido líder mediante una serie de modificaciones químicas para crear un péptido de alta afinidad que sea estable en el suero y capaz de entregar carga intracelularmente a las células cancerosas. El péptido resultante se aloja en un tumor NSCLC en un modelo animal. Es importante destacar que demostramos que el MGS4 optimizado puede administrar la proteína citotóxica saporina específicamente a las células cancerosas in vitro e in vivo, lo que resulta en un agente anticancerígeno eficaz.

MGS4 se seleccionó inicialmente mediante biopanning de visualización de fagos de una biblioteca de péptidos en células vivas. En la construcción de la biblioteca, los péptidos se fusionan genéticamente con la proteína de cubierta PIII, lo que permite mostrar un solo péptido en 3-5 copias por fago. Como tal, a menudo se requiere la unión multivalente. Para determinar si se requiere la unión multivalente para la internalización de MGS4, se sintetizaron y etiquetaron péptidos monoméricos (MGS4_V2) y tetraméricos (MGS4_V1) como se describe (Figura 1 complementaria). Después de la incubación de concentraciones variables de péptido en células vivas, el péptido unido a la superficie se eliminó mediante lavados de pH bajo, así como mediante tripsinización. La internalización relativa se midió mediante citometría de flujo para determinar un valor EC50 que representa la concentración de péptido que produce la mitad de la internalización máxima. Esta medida depende de la afinidad del péptido por su objetivo celular y la tasa de internalización. Esta es una representación más precisa de la situación biológica y útil para evaluar los péptidos como agentes de administración de fármacos. Como era de esperar para la endocitosis mediada por receptores, la captación de MGS4 se satura al aumentar la concentración. La tetramerización no alteró significativamente la EC50, lo que sugiere que no hubo un cambio aparente en la afinidad de MGS4 con la multimerización (Fig. 1a).

a Unión e internalización de MGS4_V1 tetramérico y MGS4_V2 monomérico en células H1299 vivas en cultivo. Las células se incubaron con el péptido conjugado con estreptavidina-ficoeritrina durante 1 hora a 37 °C. Se eliminó el péptido no internalizado y las células se analizaron por citometría de flujo. b Las células H1299 se incubaron con MGS4_V1 o MGS4_V2 conjugado con estreptavidina-Alexa Fluor 555 (rojo) durante 1 h, se lavaron, fijaron y contrastaron con WGA-Alexa Fluor 488 (verde, membrana celular) y DAPI (azul, núcleos) y se analizaron por microscopio fluorescente. La barra de escala representa 20 µm. MGS4_V1 y MGS4_V2 se internalizan en un grado similar y se localizan en un destino similar. c Los péptidos MGS4 monoméricos truncados tienen una CE50 similar a la del péptido original de longitud completa. Se muestran las medidas individuales. La media se muestra como una "X" y las barras de error negras representan el error estándar para un mínimo de tres réplicas experimentales (SEM). Todos los datos vinculantes originales y el análisis de regresión no lineal de los datos se incluyen en los materiales complementarios.

La endocitosis a menudo se desencadena por la multimerización del receptor en la superficie celular. Sin embargo, los datos sugieren que MGS4 se internaliza en el formato monomérico. Para verificar la internalización, el péptido se conjugó con Streptavidin-Alexa Fluor 555 y se incubó con células vivas. La internalización se determinó mediante microscopía de fluorescencia confocal. MGS4_V2 mostró una clara internalización como la observada para MGS4_V1. Ambas valencias se localizan en puntos discretos en la región perinuclear (Fig. 1b). Por lo tanto, MGS4_V2 se une a las células cancerosas con baja afinidad nanomolar y entrega cargas a las células vivas. Como la síntesis del péptido monomérico requiere menos de la mitad del tiempo y una cuarta parte de los materiales para producir, se utilizó MGS4_V2 monomérico para optimizaciones adicionales.

Para abordar qué aminoácidos son cruciales para la unión celular, se sintetizó MGS4 monomérico con truncamientos secuenciales de aminoácidos de los extremos. Se determinó el impacto de cada deleción en la internalización (Tabla 1). Dos aminoácidos C-terminales, alanina y prolina, se pueden truncar con una disminución de la afinidad de solo ~3-5 veces (MGS4_V3 y MGS4_V4). Si también se elimina el tercer aminoácido, la treonina (MGS4_V5), se pierde toda la captación. De manera similar, si se trunca el primer aminoácido N-terminal, fenilalanina (MGS4_V6), se anula la captación. Si bien no todos los aminoácidos intermedios son necesariamente cruciales para la unión, MGS4_V4 no se puede truncar más lejos de los extremos. Si bien la afinidad disminuye ~3 veces con este truncamiento, es ventajoso eliminar la prolina en el extremo C por motivos prácticos; la prolina es susceptible a la racemización durante el acoplamiento del péptido, la amina secundaria de la prolina retarda el acoplamiento del aminoácido subsiguiente y la prolina puede reducir el rendimiento sintético general12.

La estabilidad del suero a menudo se cita como una limitación de los péptidos, siendo la degradación predominante la escisión por las peptidasas N-terminal y C-terminal. El extremo C está protegido de la degradación por amidación, un aminoácido biotinilado y un conector PEG (Figura 1 complementaria). El N-terminal, sin embargo, contiene un aminoácido fenilalanina natural no modificado, que si se elimina da como resultado la pérdida total de la internalización. Por lo tanto, la protección contra la degradación es crucial. La acetilación del extremo amino protege a los péptidos de la peptidasa N-terminal mientras agrega un volumen estérico mínimo13. Sin embargo, la acetilación reduce la carga neta y puede alterar la unión de MGS4 a su receptor celular.

Para determinar si la acetilación es eficaz para reducir la degradación sérica de MGS4, se disolvieron péptidos acetilados (MGS4_V8) y no acetilados (MGS4_V4) en suero humano y se incubaron durante 48 h a 37 °C. Los péptidos se controlaron mediante HPLC analítica y los productos se verificaron mediante MALDI TOF/TOF™ MS. La acetilación protege a MGS4_V8 de la degradación, y solo se observa el péptido de longitud completa (Figura 2 complementaria). Por el contrario, no se observa nada del material de partida de MGS4_V4 sin protección. En cambio, se detecta una mezcla de fragmentos de péptidos, ninguno de los cuales corresponde a la masa del péptido de partida (Tabla complementaria 1 y Figura complementaria 2). Los productos principales son fragmentos más cortos correspondientes a la pérdida de los cinco aminoácidos N-terminales. Se observan fragmentos relacionados con QSFYT-PEG11, SFYT-PEG11 y FYT-PEG11. Como no observamos estos productos de escisión con MGS4_V8 y no podemos identificar masas que correspondan al fragmento amino-terminal de FHAVP, es probable que los productos de degradación observados con la variante no acetilada se deban a la escisión de aminopeptidasa y no a una endoproteasa.

Para asegurar que la acetilación no afecta la actividad peptídica, se compararon EC50 de MGS4_V4 y MGS4_V8. La acetilación no tiene un impacto significativo en la internalización de MGS4_V8 en comparación con MGS4_V4 no acetilado (Tabla 1). De manera similar, existe una diferencia insignificante entre el péptido MGS4_V7 de longitud completa acetilado y el MGS4_V8 truncado. Aunque hay una reducción en la unión de MGS4_V7 en comparación con MGS4_V2, la afinidad como péptido monomérico todavía se encuentra dentro del rango útil para el direccionamiento in vivo14,15. Por lo tanto, la acetilación es una forma eficaz de proteger el extremo N de MGS4 sin anular la unión al objetivo celular.

La optimización de MGS4 como monómero es eficiente, pero la valencia óptima del péptido truncado puede ser diferente a la del péptido de longitud completa. El péptido se sintetizó como monómero (MGS4_V8), dímero (MGS4_V9) y tetrámero (MGS4_V10). Para obtener datos cuantitativos, pasamos de medir la fluorescencia relativa del péptido marcado con tinte a la determinación del número promedio de moléculas de tinte internalizadas por célula. Con este enfoque, la EC50 para MGS4_V8 en células H1299 es ligeramente más alta que la calculada previamente (21 frente a 38 nM), pero está dentro del error del ensayo. El dímero MGS4_V9 tiene un EC50 7 veces menor, lo que indica que hay un efecto sinérgico al pasar de un monómero a un dímero (Fig. 2a y Tabla 2). Sin embargo, solo hay una disminución de 2 veces al pasar de un dímero a un péptido tetramérico (MGS4_V10). También calculamos el EC50 en otras tres líneas celulares de NSCLC (Tabla 2 y Figura complementaria 3). En todos los casos, las EC50 son las mismas dentro del error experimental, lo que sugiere que la afinidad de MGS4 es independiente del tipo de célula. El número medio de péptidos internalizados por célula en condiciones de saturación varía, y las células H1993 internalizan el mayor número de péptidos en las tres valencias (Tabla 2). Esto probablemente se deba a los diferentes niveles de expresión del receptor en el tipo de célula. Las moléculas promedio internalizadas a 50 nM en una hora siguen la misma tendencia (Fig. 2b). Además, MGS4_V8 y MGS4_V9 conservan la especificidad para las líneas celulares de NSCLC; se observa una internalización mínima en una línea celular epitelial bronquial humana normal (Fig. 2b).

a MGS4_V8, MGS4_V9 o MGS4_V10 se conjugaron con estreptavidina-Alexa Fluor 647 y las células H1299 se incubaron con el conjugado marcado durante 1 h. Se eliminó el péptido no internalizado y se determinó el número medio de péptidos internalizados por célula para calcular la EC50. Se muestran las medidas individuales. La media se muestra como una "X". Las barras de error, en negro, representan medidas de error estándar y, en algunos casos, están por debajo de la altura de los símbolos. b El número medio de moléculas peptídicas por célula a 50 nM en 1 h se determinó en cuatro líneas celulares de NSCLC y una línea celular epitelial bronquial humana normal (HBEC). Las barras de error representan SEM y se muestran puntos de datos individuales. c Las células H1299 se incubaron con péptido-estreptavidina-Qdot605 50 nM durante 1 h, se retiraron y se reemplazaron con medio de crecimiento normal. Después de 24 h, las células se fijaron y se contrastaron con DAPI (azul). Las pilas z proyectadas al máximo representativas para cada grupo no revelan diferencias aparentes en la internalización o localización de péptidos. La barra de escala representa 10 µm.

Mientras que la CE50 disminuye con la valencia, el número de péptidos internalizados por célula en la saturación muestra poca dependencia de la valencia en las cuatro líneas celulares. Por lo tanto, las variantes de MGS4 de diferentes valencias alcanzan la misma captación máxima aunque en diferentes concentraciones (Fig. 2b, Tabla 2). De manera similar, todas las valencias se internalizan y transitan a una ubicación similar (Fig. 2c). El aumento del costo en materiales y tiempo para sintetizar el dímero y tetrámero produce un efecto de rendimiento decreciente. Además, el monómero tiene el potencial de clonarse directamente en proteínas para su administración. En conjunto, avanzamos con MGS4_V8 monomérico.

El tráfico interno de conjugados de drogas después de la internalización tiene importantes repercusiones en la eficacia; la carga debe poder alcanzar su objetivo celular para producir el efecto biológico deseado. Se generó una serie de células H1299 marcadas con GFP específicas de orgánulos estables en las que se marcaron los núcleos, ER, Golgi, lisosoma, mitocondrias, citosol o membrana plasmática. Cada línea celular se trató con MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555. En una hora, se observó la colocalización de MGS4_V8 en células marcadas con lisosomas, que se ven como píxeles amarillos indicados por flechas rojas en la Fig. 3a. MGS4_V8 no se acumuló en las otras ubicaciones subcelulares, ni se observó en la membrana celular.

a Las células H1299 se marcaron con proteínas específicas de orgánulos etiquetadas con GFP para ER, Golgi, lisosoma, mitocondrias, núcleo, membrana plasmática y citosol (verde). Las células se incubaron con MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555 50 nM (rojo) durante 1 hora a 37 °C, luego se fijaron y se contrastaron con DAPI (azul). MGS4_V8 colocaliza con lisosomas observados como puntos amarillos indicados por las flechas rojas. No se observa colocalización significativa con otros orgánulos subcelulares. b Se incubaron células H1299 marcadas con lisosoma (verde) con MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555 50 nM (rojo) durante 0,5, 1, 4 o 24 h, luego se lavaron, fijaron y contrastaron con DAPI (azul). Se muestran imágenes representativas de un solo corte en z. Se pueden ver vesículas llenas de péptidos que se desplazan hacia los lisosomas a los 30 minutos, y muchas ya se colocalizan a la hora. La mayor parte del péptido se encuentra dentro de los lisosomas a las 4 h y se retiene allí a las 24 h. c Pilas z comprimidas y proyectadas al máximo a partir de imágenes en el panel b. La barra de escala en todas las imágenes representa 10 µm.

Las células marcadas con lisosomas (verde) se trataron con MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555 durante 30 min, 1 h, 4 h o 24 h. Las vesículas que contienen péptidos (rojas) se ven a los 30 min separadas de los lisosomas marcados, que en 1 h han comenzado a colocaralize con vesículas lisosomales (amarillas). MGS4_V8 permanece colocalizado con lisosomas a las 24 h con > 70% de la señal colocalizada con lisosomas (Fig. 3b). El tráfico, la acumulación y la retención en los lisosomas son aún más evidentes en la pila z de las células comprimida y proyectada al máximo (Fig. 3c). Es de destacar que la regeneración lisosomal se observa a las 24 h como lo demuestra el aumento de la señal verde de la GFP que no se colocaliza con MGS4_V8 previamente internalizado.

La saporina es una proteína inactivadora de ribosomas (RIP) que funciona escindiendo el ARNr ribosomal 28 S, deteniendo la síntesis de proteínas16,17,18. La actividad de inactivación de ribosomas de la saporina es catalítica y requiere pocas moléculas para inactivar los ribosomas en una célula. Saporin carece de un dominio de internalización; no tiene tropismo por las células humanas y la toxina no se internaliza a menos que esté unida a un ligando de internalización celular. Para determinar si MGS4_V8 administra intracelularmente una toxina de proteína activa, se conjugó un péptido biotinilado con saporina marcada con estreptavidina. Como se ve en la Fig. 4a, MGS4_V8 media la internalización de saporina en las células H1299. Por el contrario, la saporina conjugada con el péptido de control MGS4_V6 no ingresa a las células, lo que demuestra el requisito del péptido de direccionamiento funcional para facilitar su administración intracelular.

Se incubaron células H1299 con MGS4_V8 biotinilado conjugado con estreptavidina-saporina durante 1 hora, luego se lavaron, fijaron y contrastaron con un anticuerpo anti-saporina (rojo), WGA-AF488 (verde) y DAPI (azul). MGS4_V8 entrega con éxito saporina en las células cancerosas mientras que el péptido de control, MGS4_V6 no puede. b Los conjugados de saporina MGS4_V8 y MGS4_V9 se diluyeron en serie y se incubaron con células H1299 y H2009 durante 6 h, después de lo cual, los conjugados de saporina MGS4 se eliminaron y se devolvió el medio de cultivo completo a los pocillos. A las 72 h se midió la viabilidad. Los valores IC50 se proporcionan en el recuadro. Se muestran las medidas individuales. La media se muestra como una "X". Las barras de error, en negro, representan medidas de error estándar. El análisis de regresión no lineal se incluye en el material complementario. c Evolución temporal de la colocalización como antes, comparando el tráfico de MGS4_V8-estreptavidina-Qdot con el tráfico de MGS4_V8-saporina. Los píxeles se trazan en función de la intensidad en el canal rojo (eje x) y el canal verde (eje y). El cuadro 1 representa la población de saporina o Qdots no colocalizados con el lisosoma. Por el contrario, el cuadro 2 representa la tinción lisosomal no asociada con Qdots o señal de saporina. El recuadro 3 contiene píxeles colocados, que tienen un color amarillo falso y representan saporina o Qdots colocados dentro del compartimento lisosomal. Una subpoblación de vesículas que contienen saporina permanece distinta de los lisosomas (recuadro 1). La barra de escala en todas las imágenes representa 10 µm.

Se determinó la capacidad del conjugado MGS4_V8-saporina para inducir la muerte celular. MGS4_V8-saporina mata las células H1299 con un IC50 de 9,4 nM. Las células H2009 son ligeramente más resistentes, con una IC50 de 23 nM (Fig. 4b). MGS4_V9-saporina dimérica tiene una IC50 de 7,2 nM y 40 nM en células H1299 y H2009, respectivamente. Ni MGS4_V8 solo ni MGS4_V9 conjugado con estreptavidina sin saporina mostraron toxicidad incluso hasta concentraciones de 200 nM (Fig. 4a complementaria). Además, el tratamiento con MGS4_V6 inactivo complejado con saporina no alcanza el 50 % de muerte celular en células H1299 y H2009 a 200 nM. Las células HBEC de control normal no alcanzan el 50 % de viabilidad celular con MGS4_V8 o MGS4_V6 (Fig. 4b complementaria). Aunque MGS4_V9 tiene una EC50 más baja para ambos tipos de células, la dimerización no mejora la IC50 ni la potencia del conjugado de saporina, lo que valida la elección del péptido monomérico como agente de administración.

La tinción de saporina (Fig. 4) es sorprendentemente similar a la tinción previa de MGS4 (Fig. 3c): punteada y perinuclear. Sin embargo, para inducir la muerte celular, la saporina internalizada debe acceder a los ribosomas en el citoplasma. Los resultados de viabilidad celular sugieren que al menos algo de saporina llega al citoplasma. Es probable que esto se deba al escape endosomal mediado por la saporina antes del tránsito hacia los lisosomas. Para observar el escape endosomal, se realizó un curso de tiempo para evaluar la colocalización de saporina con lisosomas. El MGS4_V8 biotinilado se conjugó con estreptavidina-Qdot605 o con estreptavidina-saporina, y el conjugado se incubó con células H1299 durante 30 min, 1 h, 1 h con una persecución de 3 horas o 1 h con una persecución de 23 horas. Tanto la saporina como los Qdots viajan y se acumulan en los lisosomas (amarillo) con el tiempo (Fig. 4c). Sin embargo, hay una población discreta de vesículas cargadas de saporina (rojas) que evaden el tráfico hacia el lisosoma, que no se observan en la muestra de Qdot. Esto es especialmente evidente a 1 hora. Estas vesículas que no colocalizan y que contienen saporina son evidentes por el coeficiente de Mander; Saporin muestra menos colocalización en comparación con Qdots a 1 h (0,334 frente a 0,549 respectivamente) y 24 h (0,657 frente a 0,758 respectivamente) (Tabla 3). Estos datos sugieren que una fracción de saporina escapa del tráfico lisosomal hacia el citosol para ejercer la destrucción celular. Como la actividad de la saporina es catalítica, una fracción es suficiente para una destrucción eficaz.

El uso de MGS4 como agente de administración se basa en su capacidad para dirigirse a un tumor en un animal. MGS4_V8 y MGS4_V6 (control) se conjugaron directamente con Alexa Fluor 750. Cada conjugado se inyectó por vía intravenosa en ratones inmunocomprometidos que tenían tumores H2009 subcutáneos, y la acumulación del péptido se midió mediante imágenes de infrarrojo cercano (Fig. 5a). Se observa la localización del tumor MGS4_V8 a las 12 hy el 85 % de esa señal se mantiene a las 24 h. La señal de MGS4_V8 permanece a las 48 y 72 h, lo que indica una retención persistente del colorante en el tumor. En todo momento, MGS4_V8 tiene una señal aumentada de 25 a 40 veces en comparación con el péptido de control. En comparación, no existe una diferencia estadísticamente significativa entre la señal resultante de MGS4_V6 y los tumores no tratados (fondo). Los tumores fotografiados ex vivo a las 72 h mostraron un patrón similar. Los tumores se fijaron en paraformaldehído seguido de imágenes de todo el tumor en un LI-COR® Odyssey (Fig. 5b). Existe una clara diferencia visual entre los tumores aislados de ratones tratados con MGS4_V8 en comparación con los tratados con control MGS4_V6 o sin tratar. La cuantificación de la fluorescencia da como resultado una señal 240 veces mayor en los tumores tratados con MGS4_V8 en comparación con el grupo MGS4_V6. Se obtuvieron resultados similares cuando se establecieron tumores H1299 subcutáneos en ratones (Figura 5 complementaria). Juntos, estos datos indicaron que MGS4_V8 tiene la especificidad, la afinidad y la estabilidad necesarias para atacar un tumor in vivo. La retención de la señal a las 72 h sugiere que MGS4_V8 se internaliza en las células cancerosas dentro del tumor y el colorante NIR permanece atrapado.

Se inyectó IV MGS4_V8 o MGS4_V6 conjugado con colorante NIR Alexa Fluor 750 a ratones desnudos con tumor H2009 (N = 4). A las 12, 24, 48 y 72 h después de la inyección, los ratones se anestesiaron y se tomaron imágenes en un IVIS® (Perkin Elmer ) para medir la eficiencia radiante total en cada tumor. MGS4_V8 se acumula en el tumor de 25 a 39 veces mejor que el péptido de control, MGS4_V6. La acumulación de MGS4_V6 no es estadísticamente diferente de los tumores no tratados. Las imágenes NIR ex vivo de los tumores al final del experimento reflejan los datos observados en los animales vivos. Los bigotes representan valores mínimos a máximos, los percentiles 25 a 75 están representados por el cuadro, la línea muestra la mediana, el símbolo + representa la media y los datos individuales se muestran como un punto. Los datos de animales individuales se incluyen en la Tabla complementaria 8. b Los tumores extirpados del experimento anterior se fijaron en PBS + formaldehído al 4 % y luego se tomaron imágenes nuevamente en un LI-COR® Odyssey. Se determinaron unidades arbitrarias de fluorescencia (AFU) para cada tumor y el promedio y SEM se muestran debajo de la imagen. La intensidad fluorescente media es 240 veces mayor para el conjugado MGS4_V8-Alexa Fluor 750 que el conjugado de control MGS4_V6. c Saporin se conjugó con MGS4_V8 dirigido o no dirigido a MGS4_V6 y se inyectaron 7,5 µg del conjugado por vía IV en ratones que tenían tumores subcutáneos. Los animales recibieron dosis 2 veces por semana durante 2,5 semanas (indicado por flechas). Los tumores se midieron cada dos días. MGS4_V8-saporina claramente ralentiza el crecimiento tumoral, mientras que la saporina no dirigida no tiene ningún efecto en comparación con los animales no tratados. Las barras de error representan SEM, *valor p < 0,05, **valor p < 0,01, ***valor p < 0,001, ****valor p < 0,0001 (ANOVA bidireccional). d El tamaño del tumor (mm3) se muestra para animales individuales en los días 0, 6, 12 y 18. El valor medio está representado por la línea horizontal y las barras de error representan el error estándar. No hay diferencia estadística entre MGS4_V6-Saporin y no tratado en ningún día. En los días 12 y 18, MGS4_V8-Saporin es estadísticamente diferente que no tratado (valores de p 0,0099 y 0,0029, respectivamente) y MGS4_V6-Saporin (valores de p 0,0069 y 0,0009, respectivamente).

Para establecer la eficacia en un modelo animal, se implantaron por vía subcutánea tumores H2009 en los flancos de ratones desnudos hembra. Cuando los tumores H2009 alcanzaron ~100 mm3, a los ratones se les inyectaron 7,5 µg de MGS4_V8-saporina o 7,5 µg de MGS4_V6-saporina acetilada (péptido de control) a través de la vena de la cola, 2 veces por semana para un total de 5 inyecciones. La saporina dirigida a MGS4_V8 ralentizó significativamente el crecimiento tumoral en comparación con el péptido de control (Fig. 5c, d). Aunque el tumor no se elimina durante el transcurso del tratamiento, el volumen tumoral permaneció estático durante los primeros 10 días de tratamiento. En comparación, los tumores tratados con la saporina no dirigida habían aumentado de tamaño tres veces. Para el día 18, los tumores tratados con saporina dirigida a MGS4_V8 tenían la mitad del tamaño de los de cualquier grupo de control. El tratamiento con saporina no dirigido de control, MGS4_V6-saporina, no es diferente de los tumores no tratados, lo que enfatiza la necesidad de MGS4_V8 para la administración de la saporina.

Los ligandos dirigidos a tumores son componentes clave en los sistemas de administración de fármacos para el cáncer. Aunque los anticuerpos monoclonales son los más avanzados de los agentes de direccionamiento clínicamente disponibles, los péptidos están emergiendo como una alternativa viable19,20,21. En comparación con los anticuerpos, los péptidos tienen un tiempo de desarrollo más rápido y costos de producción más bajos porque se sintetizan fácilmente, lo que permite una optimización rápida e iterativa de su estabilidad, afinidad, especificidad, solubilidad e hidrofobicidad. Los péptidos también son más pequeños, lo que permite una penetración más profunda en el tratamiento de tumores sólidos22. La mayoría de los péptidos dirigidos se han centrado en ligandos peptídicos naturales o análogos relacionados que se unen a receptores regulados positivamente en el cáncer, por ejemplo, bombesina, hormona liberadora de hormona luteinizante y el tripéptido RGD. 177Lu-Dotatate, un derivado de somatostatina radiomarcado recibió la aprobación acelerada de la FDA a principios de 2018 y es el primer conjugado de péptido-fármaco aprobado23. ANG1005, un péptido dirigido a la proteína 1 relacionada con el receptor de LDL conjugado con paclitaxel, se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento de metástasis cerebrales24 y TH1902, un conjugado de docetaxel con un péptido de unión a sortilina, entró recientemente en ensayos clínicos de Fase I25.

La selección biológica de bibliotecas de péptidos que se muestran en fagos permite una selección rápida de péptidos que se unen e inician la internalización específicamente en las células cancerosas11. La capacidad de detectar la internalización es clave para las aplicaciones de administración de fármacos, ya que la mayoría de los quimioterapéuticos tienen objetivos intracelulares; es poco probable que los ligandos y/o receptores que no se internalizan o tienen una absorción celular lenta sean buenos candidatos. Este enfoque es robusto y ha llevado a la identificación de numerosos agentes dirigidos a péptidos con alta especificidad celular10. El proceso de selección es imparcial y no requiere conocimiento del repertorio de la superficie celular. Aunque el receptor celular para MGS4 sigue siendo desconocido, la unión de péptidos puede servir como un biomarcador sustituto sin conocimiento de su objetivo celular. Se están realizando estudios para identificar el receptor celular y establecer sus niveles de expresión en tejidos normales.

Los éxitos iniciales de estas selecciones son compuestos principales, seleccionados como fusiones con la proteína de cubierta pIII en fagos filamentosos. Aquí hemos identificado el dominio de unión mínimo de MGS4 y lo hemos optimizado químicamente para mejorar la afinidad y la estabilidad. Los péptidos a menudo se citan como agentes de orientación deficientes en comparación con los candidatos a anticuerpos debido a su estabilidad sérica limitada y afinidades más débiles. Sin embargo, demostramos que un péptido monomérico tiene una baja afinidad nanomolar por sus células diana, comparable a los anticuerpos mientras tiene un tamaño de 1/100. La modificación de ambos extremos estabiliza el péptido en el suero. Es importante destacar que MGS4_V8 desencadena una rápida internalización en la célula. Esto contrasta con muchos anticuerpos terapéuticos que se han desarrollado contra receptores que tienen tasas de internalización lentas26,27. Sorprendentemente, la versión monomérica se internaliza en la misma medida que los péptidos diméricos y tetrámeros y se dirige a la misma ubicación subcelular. Dependiendo del tipo de célula, se internalizan 40.000-100.000 moléculas de péptido por célula en 1 h, alcanzando una concentración intracelular de 40-100 nM28. Se están realizando estudios cinéticos adicionales para determinar si la concentración intracelular del péptido aumenta con el tiempo. Es de destacar que tener una serie de ligandos con un rango de afinidades para un objetivo específico del tumor y tasas variables de internalización podría ser valioso como una forma de abordar la barrera de la afinidad14. Este fenómeno a veces dificulta la penetración en un tumor ya que el ligando es secuestrado rápidamente por las primeras células tumorales que encuentra.

MGS4_V8 se puede modificar para llevar una variedad de cargas a las células sin alterar sus propiedades de unión o especificidad celular. Esto se indica claramente en este estudio, ya que MGS4 entregó proteínas (estreptavidina, saporina), colorantes y puntos cuánticos. Una terapia ideal para la entrega dirigida debe tener varias características clave. En primer lugar, el agente terapéutico debe ser impermeable a las células, excepto cuando se conjuga con un agente de administración, lo que limita los posibles efectos fuera del objetivo si se libera prematuramente de su portador. En segundo lugar, debería ser eficaz en dosis bajas, ya que es poco probable que la captación mediada por receptores alcance concentraciones intracelulares que se pueden alcanzar con tratamientos de moléculas pequeñas permeables a las células. En tercer lugar, debe escapar de las vesículas intracelulares para alcanzar su objetivo. Saporin cumple todos estos criterios. Es un RIP tipo 1 sin tropismo nativo para células de mamíferos y no puede cruzar la membrana celular sin un vehículo de suministro. Como enzima ARNr N-glucosidasa, la saporina inactiva catalíticamente la subunidad ribosómica grande y no requiere cantidades estequiométricas para inactivar su objetivo. Esta actividad interrumpe la síntesis de proteínas en células inactivas y en división activa. La saporina puede escapar de las vesículas intracelulares para alcanzar el citoplasma y otros orgánulos subcelulares29. Finalmente, se han identificado mecanismos de acción adicionales para la saporina independientes de su actividad N-glucosidasa, aumentando su potencial citotoxicidad30,31,32,33. La conjugación de saporina con un agente dirigido específico de células que desencadena la internalización abre su potencial terapéutico.

El acoplamiento de MGS4_V8 biotinilado con el conjugado de saporina-estreptavidina da como resultado un agente citotóxico. El IC50 es más bajo que el EC50 para la unión e internalización de péptidos debido a la naturaleza catalítica de la saporina. Una posible preocupación es el posible atrapamiento y degradación de la saporina en el lisosoma. La endocitosis del péptido MGS4_V8 da como resultado una acumulación lisosomal, que aumenta con el tiempo. A los 30 min, el MGS4_V8 marcado no se colocaliza con el lisosoma, pero se observa en vesículas punteadas que probablemente sean compartimentos endosómicos. A la hora, el 70% del péptido está localizado en el lisosoma. Sin embargo, el conjugado MGS4_V8-saporina demuestra citotoxicidad celular, probablemente debido a que una parte de la saporina escapa al tráfico lisosomal. Nuestros datos de microscopía indican que hay una subpoblación discreta MGS4_V8-saporina que no está colocalizada con el lisosoma, de acuerdo con la capacidad de saporina para escapar endosómica. Es probable que esta población sea pequeña ya que no se observa una tinción citoplasmática difusa, pero lo suficientemente alta como para afectar la viabilidad celular. Los enfoques para facilitar aún más el escape endosomal/lisosomal de saporina pueden mejorar la eficacia de los conjugados MGS4-saporina34,35,36. Es importante destacar que MGS4_V8 tiene potencial como un conjugado de péptido-fármaco en el que el tráfico lisosomal de conjugados de fármacos permite el uso de enlazadores escindibles con catepsina o lábiles a los ácidos para liberar el fármaco21.

Los conjugados de saporina han servido como herramientas biológicas útiles, pero también tienen potencial como agentes terapéuticos clínicos16,17,18. Saporin se ha conjugado con diferentes restos de direccionamiento, la mayoría de los cuales están basados ​​en anticuerpos37. Demostramos que MGS4_V8-saporina tiene eficacia antitumoral en un modelo de ratón. El uso del péptido MGS4_V6 no dirigido da como resultado una reducción del tamaño del tumor en comparación con el control no tratado. Aunque aún no se ha realizado un perfil farmacocinético y de toxicidad completo, no se observó toxicidad grave. Se necesitan estudios completos de biodistribución y toxicología para abordar los efectos fuera del objetivo. Además, se requieren mejoras en el enlazador MGS-saporina. Sin embargo, estos datos demuestran que MGS4_V8 puede administrar saporina activa a un tumor en un animal cuando se administra por vía intravenosa y respaldan una mayor exploración en modelos preclínicos.

Se han completado dos ensayos clínicos de Fase I/II de conjugados de inmuno-saporina. El primer conjugado de saporina-anticuerpo anti-CD30 de ratón para el tratamiento del linfoma de Hodgkin refractario38. A pesar de las respuestas clínicas prometedoras, los pacientes desarrollaron una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo y la toxina. El síndrome de fuga vascular (VLS) se observó como una toxicidad limitante de la dosis. Un segundo ensayo que usó un anticuerpo biespecífico contra CD22 y saporina demostró menos efectos secundarios, incluida una reducción de VLS y ausencia de respuesta inmunitaria contra la saporina39. Ambos ensayos se realizaron con anticuerpos de ratón de primera generación. Si bien no ha habido ensayos clínicos recientes de conjugados de saporina para el tratamiento del cáncer, se descubrió que la saporina conjugada con la sustancia P para el tratamiento del dolor es segura en un ensayo clínico de fase I (NCT02036281) y se utilizó con éxito para el tratamiento del dolor en perros con cáncer de hueso40.

Un número cada vez mayor de agentes dirigidos contra biomarcadores de cáncer ha aumentado el interés en las inmunotoxinas41,42,43,44,45,46,47. La ingeniería de toxinas para eliminar epítopos inmunogénicos y la actividad VLS continúa progresando48,49,50,51. Además de la saporina, las toxinas RIP derivadas de plantas, la gelonina, la ricina y la proteína antiviral de la hierba carmín se han utilizado en inmunotoxinas52, incluida la finalización de un ensayo de fase I de un inmunoconjugado anti-CD33-gelonina para el tratamiento de tumores malignos mieloides refractarios53. Además, las toxinas de origen bacteriano, como la exotoxina A de Pseudomonas y la toxina diftérica, se han utilizado como fracciones terapéuticas para las inmunotoxinas54,55,56,57. Ontak, una proteína de fusión interleucina-2-toxina diftérica, fue aprobada por la FDA para el linfoma cutáneo de células T, pero desde entonces se suspendió debido a problemas de producción. Tagraxofusp es una toxina diftérica dirigida a la IL-3 que se aprobó para uso clínico en 2018 para el tratamiento de la neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas58. Lumoxiti, un conjugado de CD22-PE38, recibió la aprobación de la FDA en 2018 para la leucemia de células pilosas refractaria o en recaída59. En el ensayo de fase III se logró una respuesta completa duradera en el 30 % de los pacientes.

En resumen, hemos desarrollado un péptido específico del cáncer de alta afinidad con la capacidad de administrar toxinas proteicas activas a las células de NSCLC in vitro e in vivo. Este péptido puede servir como reemplazo de anticuerpos en los ADC tradicionales, lo que reduce los costos y el tiempo de producción. La capacidad de conjugar químicamente la carga de una manera definida químicamente es una ventaja sobre el ADC. Dado que el péptido MGS4 parental se une a múltiples tipos de células cancerosas más allá del NSCLC, anticipamos que MGS4_V8 encontrará una mayor utilidad en otros tipos de cáncer. Las variantes del péptido MGS4 se pueden incorporar en una variedad de toxinas proteicas diferentes, ya sea mediante ingeniería genética o conjugación química, lo que amplía su valor.

La resina NovaPEG Rink Amide y FMOC-Glu(biotinyl-PEG)-OH se adquirieron de NovaBiochem® (Millipore Sigma, Billerica, MA). Hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (HCTU), N,N-dimetilmetanamida, N-metilmorfolina, ácido 2,2,2-trifluoroacético y todos los aminoácidos FMOC se adquirieron de Gyros Protein Technologies (Tucson, AZ). FMOC-NH-(PEG)11-COOH (C42H65NO16) se adquirió de Polypure (Oslo, Noruega). El triisopropilsilano y el 1,2-etanoditiol se adquirieron de Sigma Aldrich (Livermore, CA). La piperidina se adquirió de Alfa Aesar (Tewksbury, MA) y el acetonitrilo, diclorometano, éter dietílico a través de VWR (Radnor, PA).

Se utilizaron las siguientes construcciones marcadas con GFP: Marca de membrana plasmática Src-myrisylated-GFP, pmyr GFP (Addgene plasmid # 50528) fue un regalo de Kenneth Yamada. Etiqueta de Golgi beta-1,4-galactosiltransferasa 1-GFP, PA-GFP (plásmido Addgene n.° 57164), etiqueta de lisosoma Lamp-1-GFP, lisosoma esmeralda-20 (plásmido Addgene n.° 56476). Etiqueta ER SigPep-eGFP-KDEL, mEGFP-retículo endoplásmico (plásmido Addgene n.° 56455), etiqueta mitocondrial subunidad receptora de importación mitocondrial translocasa de membrana externa subunidad 20 kDa-GFP, mEmerald-TOMM20-N-10 (plásmido Addgene n.° 54282), núcleo la etiqueta SV40 NLS-GFP, mEmerald-nucleus 7 (plásmido Addgene n.° 54206) y la etiqueta de citoplasma Argonaut 3 isoforma A-GFP, mEmerald-EIF2C3-C18 (plásmido Addgene n.° 54078) fueron obsequios de Michael Davidson. El marcador de Golgi Tyrosyl protein sulfotransferase 2, TPST2-EGFP fue un obsequio de David Stephens (Addgene plásmido n.° 66618). Las selecciones se realizaron en G418 o mediante dilución limitante.

La síntesis, escisión, purificación y multimerización de péptidos se logró mediante síntesis en fase sólida como se publicó anteriormente60. Los péptidos multiméricos se sintetizaron en un núcleo de lisina (dímero) o trilisina (tetrámero). Las estructuras peptídicas (Figura 1 complementaria) se proporcionan en materiales complementarios. Las masas peptídicas se confirmaron mediante espectrometría de masas MALDI/TOF y >95 % de pureza según lo determinado por HPLC analítica.

Las líneas celulares fueron proporcionadas por John Minna y Adi Gazdar (UT Southwestern Medical Center) o adquiridas de ATCC® y mantenidas en RPMI complementado con glutamina + suero bovino fetal al 5 % (Gemini Bio-Products, Sacramento, CA). Las células se genotiparon (Bio-síntesis, Lewisville, TX) para confirmar la identificación y se evaluaron mensualmente para la infección por Mycoplasma.

El péptido biotinilado se conjugó con estreptavidina-R-ficoeritrina o estreptavidina-Alexa Fluor 647 (proporción molar 1:1) durante 30 min. Los sitios de unión abiertos de la estreptavidina se extinguieron con RPMI 1640 y se diluyeron a la concentración indicada. Las células tumorales se cultivaron hasta una confluencia del 90 % en una placa de 12 pocillos y luego se incubaron con 500 µl de conjugado de péptido-colorante a 37 °C. Después de 1 h, se eliminó el péptido y las células se lavaron 3 veces con PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH 7,4), 2 veces con HCl 0,1 M-glicina pH 2,2 en una solución al 0,9 %. NaCl y enjuague con PBS 1x. Las células se eliminaron por tripsinización. La citometría de flujo se realizó en un BD FACSCelesta y los datos se analizaron en el software Flowing. Las celdas se bloquearon en función de la dispersión frontal y lateral para incluir solo celdas viables y se contaron un mínimo de 10.000 eventos. Se estableció una región que contenía <5 % de las células en el control negativo y la captación relativa de péptidos por la intensidad de fluorescencia media de esa población11. Para la captación absoluta de péptidos por célula, se generó una curva estándar usando microesferas Quantum™ Alexa Fluor 647 (Bangs Laboratory, Fishers, IN). En la Figura complementaria 6 se muestra una regresión lineal representativa que muestra la correlación de los fluoróforos solubles de equivalentes de moléculas (MESF) frente a la intensidad de fluorescencia media (MFI). Se contaron los eventos. El MFI se determinó al 50% a la altura del pico. Las moléculas internalizadas por célula se determinaron mediante la curva estándar que relaciona MESF con MFI y se dividieron por el número de moléculas de colorante/conjugado MGS. En la Figura 7 complementaria se muestra un ejemplo. Se utilizó GraphPad Prism® para el ajuste de la curva de regresión no lineal para calcular un EC50. Se proporcionan parámetros y análisis estadístico (Tablas complementarias 2–6). Los experimentos se repitieron un mínimo de tres veces.

Los plásmidos con marcadores específicos de orgánulos marcados con GFP se adquirieron de Addgene (Cambridge, MA) y se sometieron a electroporación en células H1299. Las células tumorales marcadas con GFP se sembraron en portaobjetos de cámara de 8 pocillos. El péptido biotinilado se conjugó con estreptavidina-Alexa Fluor 555 (1:1) durante 30 min a temperatura ambiente y se inactivó con RPMI, luego se agregó a los pocillos a 50 nM. Después de 1 hora de incubación, las células se lavaron como se describe. Las células se fijaron en formaldehído al 2%. Se utilizaron medios de montaje EverBrite™ (Biotium, Freemont, CA) que contenían DAPI. Cuando se indicó, la superficie celular se contrastó con aglutinina de germen de trigo (WGA) marcada con Alexa Fluor 488. La microscopía se adquirió en un Zeiss LSM 700 con un objetivo Pln Apo 63x/1.4 oil DIC III. Las imágenes se procesaron con el software Zen.

El curso de tiempo para la acumulación lisosomal se realizó mediante imágenes en los puntos de tiempo indicados utilizando péptido biotinilado conjugado con estreptavidina-Alexa Fluor 555, estreptavidina-Qdot605 o estreptavidina-saporina. La saporina se detectó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti-saporina AB-41AP (dilución 1:100) (Advanced Targeting Systems Bio, San Diego, CA). Se establecieron umbrales para Ch1, que representa el péptido en el canal rojo (75), y Ch2, que representa el lisosoma en el canal verde (55). Cada píxel de un solo segmento se evaluó para pasar el umbral en rojo (cuadro 1), verde (cuadro 2) o ambos (cuadro 3) para la colocalización. Los coeficientes de Mander se calculan para cada segmento, donde 0 indica que no hay colocalización y 1 indica que la colocalización es completa.

El péptido biotinilado se conjugó con estreptavidina-saporina (Advanced Targeting Systems Bio, San Diego, CA) en una proporción molar de 1:1. Se incubaron en las células dosis crecientes de conjugado de péptido-fármaco por triplicado durante 6 horas a 37 °C. El fármaco se eliminó y se reemplazó con medio de crecimiento completo. Después de 72 h, se midió la viabilidad celular usando CellTiter-GLO® (Promega, Madison, WI). La viabilidad celular se normalizó a las células no tratadas. Los IC50 se calcularon utilizando GraphPad Prism® utilizando log(agonista) frente a respuesta: pendiente variable (cuatro parámetros). Los datos de los experimentos individuales, así como los parámetros y el análisis estadístico se proporcionan en el material complementario. Se realizaron un mínimo de cuatro réplicas biológicas para cada variante y línea celular.

Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SRI International (Número de Garantía de Bienestar Animal A3025-01, protocolo 14008). Se implantaron subcutáneamente células H2009 (106) o células H1299 (106) en el flanco de ratones hembra Nu/Nu (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Cuando los tumores alcanzaron los 100 mm3, se iniciaron los experimentos in vivo. Para obtener imágenes, los péptidos indicados se conjugaron directamente con el tinte infrarrojo cercano Alexa Fluor 750 (Figura 1 complementaria). Se utilizaron cuatro animales por grupo. Se inyectaron péptidos en la vena lateral de la cola para una dosis total de 15 µg/ratón administrados en 100 µL. En el período de tiempo establecido, los animales se anestesiaron y se tomaron imágenes en un IVIS® (Perkin Elmer). Se dibujaron regiones de interés alrededor del tumor y se midió la eficiencia radiante total. Para los experimentos terapéuticos, elegimos usar el modelo de tumor H2009, ya que tiene una tasa de crecimiento tumoral más alta y una tasa de crecimiento más consistente que el modelo H1299. MGS4_V8 biotinilado (N = 9) o MGS4_V6 (N = 8) se conjugaron con estreptavidina-saporina y se administraron mediante inyección en la vena de la cola (7,5 µg/100 µl) 2 veces por semana durante 2,5 semanas para un total de 5 tratamientos. Los animales no tratados (N = 8) sirvieron como control. El tamaño del tumor se midió con calibradores cada dos días y el volumen se calculó como (π/6)(l*w)3/2. El análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism®.

Para todas las determinaciones de EC50, cada variante peptídica se analizó en la línea celular indicada con un mínimo de 3 réplicas biológicas y se analizó individualmente mediante citometría de flujo. El error estándar de medición para cada concentración se indica mediante barras de error en las figuras. Para los experimentos en los que se midió el número absoluto de moléculas internalizadas a diferentes concentraciones, GraphPad Prism® determinó la CE50 mediante el ajuste de la curva de regresión no lineal para log(agonista) frente a respuesta-pendiente variable (cuatro parámetros). Para los experimentos de truncamiento, la CE50 se determinó utilizando la unión específica de un sitio. De manera similar, las IC50 se calcularon utilizando GraphPad Prism® utilizando log(agonista) frente a respuesta-pendiente variable (cuatro parámetros). Se realizaron un mínimo de cuatro réplicas biológicas para cada variante y línea celular. Los datos de experimentos individuales se incluyen en archivos complementarios. Los parámetros y el análisis estadístico se proporcionan en las tablas complementarias 2–7.

Para experimentos terapéuticos in vivo, se usaron tamaños de grupos de animales de N = 9 para MGS4_V8, N = 8 para MGS4_V6 y N = 8 para no tratados. Los tumores fueron medidos por un investigador independiente sin conocimiento de los grupos de tratamiento. SEM se representan como barras de error en las figuras. Para la formación de imágenes del tumor, se usaron 4 animales por grupo y las barras de error representan medidas de error estándar. Para todos los experimentos in vivo, los datos para ratones individuales se incluyen en la Tabla complementaria 9. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de dos vías utilizando la prueba de comparación múltiple de Tukey. Los valores de p < 0,05 se consideran significativos y se representan en las figuras como: * valor de p < 0,05, ** valor de p < 0,01, *** valor de p < 0,001, **** valor de p < 0,0001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Sociedad Estadounidense del Cáncer: Datos y cifras del cáncer 2022, https://www.cancer.org/research/cancer-facts-statistics/all-cancer-facts-figures/cancer-facts-figures-2022.html.

König, D., Savic Prince, S. & Rothschild, SI Terapia dirigida en cáncer de pulmón no microcítico avanzado y metastásico. una actualización sobre el tratamiento de las alteraciones oncogénicas accionables más importantes del conductor. Cánceres 13, 804–841 (2021).

Artículo Google Académico

Verma, S. et al. Trastuzumab emtansina para el cáncer de mama avanzado positivo para HER2. N. ingl. J.Med. 367, 1783–1791 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Younes, A. et al. Resultados de un estudio fundamental de fase II de brentuximab vedotina para pacientes con linfoma de Hodgkin en recaída o refractario. J. Clin. oncol. 30, 2183–2189 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Pro, B. et al. Brentuximab vedotin (SGN-35) en pacientes con linfoma anaplásico de células grandes sistémico en recaída o refractario: resultados de un estudio de fase II. J. Clin. oncol. 30, 2190–2196 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Theocharopoulos, C., Lialios, PP, Gogas, H. & Ziogas, DC Una descripción general de los conjugados de anticuerpo-fármaco en la práctica oncológica. El r. Adv. Medicina. oncol. 12, 1–20 (2020).

Artículo Google Académico

Joubert, N., Beck, A., Dumontet, C. y Denevault-Sabourin, C. Conjugados de anticuerpo-fármaco: la última década. Productos farmacéuticos 13, 245–276 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Dean, AQ, Luo, S., Twomey, JD y Zhang, B. Tratamiento del cáncer con conjugados de anticuerpo y fármaco: promesas y desafíos. MAbs 13, 1951427 (2021).

Marks, S. & Naidoo, J. Conjugados de fármacos y anticuerpos en el cáncer de pulmón de células no pequeñas: un enfoque terapéutico emergente. Cáncer de pulmón 163, 59–68 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Gray, BP & Brown, KC Bibliotecas de péptidos combinatorios: minería de péptidos de unión a células. química Rev. 114, 1020–1081 (2014).

Artículo CAS Google Académico

McGuire, MJ et al. Identificación y caracterización de un conjunto de péptidos dirigidos a tumores para el cáncer de pulmón de células no pequeñas. ciencia Rep. 4, 4480 (2014).

Artículo Google Académico

Síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc: un enfoque práctico. 346 (Prensa de la Universidad de Oxford, 2000).

Muttenthaler, M., King, GF, Adams, DJ y Alewood, PF Tendencias en el descubrimiento de fármacos de péptidos. Nat. Rev. Descubrimiento de Drogas. 20, 309–325 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Rudnick, SI & Adams, GP Affinity and Avidity in Antibody-Based Tumor Targeting. Cáncer Biother Radiopharm. 24, 155–161 (2009).

CAS Google Académico

Wittrup, KD, Thurber, GM, Schmidt, MM y Rhoden, JJ Guía teórica práctica para el diseño de agentes dirigidos contra tumores. Métodos Enzymol. 503, 255–268 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Polito, L., Bortolotti, M., Mercatelli, D., Battelli, MG & Bolognesi, A. Saporin-S6: una herramienta útil en la terapia del cáncer. Toxinas 5, 1698-1722 (2013).

Artículo Google Académico

Polito, L., Bortolotti, M., Pedrazzi, M. & Bolognesi, A. Inmunotoxinas y otros conjugados que contienen Saporin-S6 para la terapia del cáncer. Toxinas 3, 697–720 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Bolognesi, A., Bortolotti, M., Maiello, S., Battelli, M. y Polito, L. Proteínas que inactivan los ribosomas de las plantas: una descripción histórica. Moléculas 21, 1627 (2016).

Artículo Google Académico

Le Joncour, V. & Laakkonen, P. Seek & Destroy, Uso de péptidos dirigidos para la detección del cáncer y la administración de fármacos. Biorg. Medicina. química 26, 2797–2806 (2018).

Artículo Google Académico

Gilad, Y., Firer, M. & Gellerman, G. Innovaciones recientes en la administración de fármacos dirigidos basados ​​en péptidos a las células cancerosas. Biomedicinas 4, 20011 (2016).

Alas, M., Saghaeidehkordi, A. & Kaur, K. Conjugados de péptido-fármaco con diferentes enlazadores para la terapia del cáncer. J.Med. química 64, 216–232 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Mousavizadeh, A., Jabbari, A., Akrami, M. & Bardania, H. Péptidos dirigidos a células como ligandos inteligentes para el direccionamiento de agentes terapéuticos o de diagnóstico: una revisión sistemática. Surf de coloides. B. Biointerfaces 158, 507–517 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Strosberg, J. et al. Ensayo de fase 3 de 177Lu-dotatato para tumores neuroendocrinos del intestino medio. N. ingl. J.Med. 376, 125–135 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Kumthekar, P. et al. ANG1005, un conjugado de péptido-fármaco que penetra en el cerebro, muestra actividad en pacientes con cáncer de mama con carcinomatosis leptomeníngea y metástasis cerebrales recurrentes. clin. Cáncer Res. 26, 2789–2799 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Currie, JC et al. El conjugado de péptido-fármaco TH1902: una nueva terapia contra el cáncer mediada por el receptor de sortilina contra los cánceres de ovario y endometrio. Cánceres (Basilea) 14, 81877 (2022).

Okeley, NM et al. Activación intracelular de SGN-35, un potente conjugado de fármaco y anticuerpo anti-CD30. clin. Cáncer Res. 16, 888–897 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Maass, KF, Kulkarni, C., Betts, AM y Wittrup, KD La determinación de las tasas de procesamiento celular para un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC) de trastuzumab-maitansinoide destaca los parámetros clave para el diseño de ADC. AAPS J. 18, 635–646 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Moran, U., Phillips, R. y Milo, R. Instantánea: números clave en biología. Celda 141, 1262–1263 (2010).

Artículo Google Académico

Bolognesi, A. et al. Endocitosis y localización intracelular de la proteína inactivadora de ribosomas tipo 1 Saporin-S6. J. Biol. Reg. Homeósteo. Agentes 26, 97–109 (2010).

Google Académico

Polito, L. et al. Saporin induce múltiples vías de muerte en células de linfoma con diferente intensidad y sincronización en comparación con la ricina. Int J. Biochem Cell Biol. 41, 1055–1061 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Sikriwal, D., Ghosh, P. & Batra, JK La proteína que inactiva los ribosomas Saporin induce la apoptosis a través de la cascada mitocondrial, independientemente de la inhibición de la traducción. En t. J. Bioquímica. Biol celular. 40, 2880–2888 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Polito, L. et al. Inmunotoxina ATG-Saporin-S6: un nuevo fármaco potente y selectivo para eliminar los linfocitos activados y las células de linfoma. Hermano J. Haematol. 147, 710–718 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Bagga, S., Seth, D. & Batra, JK La actividad citotóxica de la proteína inactivadora de ribosomas Saporin-6 se atribuye a sus actividades de fragmentación de ADN internucleosómico y ARNr N-glucosidasa. J. Biol. química 278, 4813–4820 (2003).

Artículo CAS Google Académico

Bostad, M. et al. Escape endosomal controlado por la luz de la nueva inmunotoxina AC133-Saporina dirigida a CD133 mediante internalización fotoquímica: una estrategia de orientación a células madre cancerosas mínimamente invasiva. J.Control. Versión 206, 37–48 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Geden, SE y col. El tratamiento con lipopoliamina aumenta la eficacia de la intoxicación con saporina y un conjugado de saporina contra el cáncer. FEBS J. 274, 4825–4836 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Stratford, EW et al. La internalización fotoquímica de inmunotoxinas dirigidas a CD133 agota eficientemente las células de sarcoma con propiedades similares a las del tallo y reduce la tumorigenicidad. bioquimica Biografía. Acta 1830, 4235–4243 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Gilabert-Oriol, R. et al. Inmunotoxinas construidas con proteínas que inactivan los ribosomas y sus potenciadores: un cóctel letal con eficacia específica para tumores. actual Farmacia Des. 20, 6584–6643 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Falini, B. et al. Respuesta de la enfermedad de Hodgkin refractaria a la inmunotoxina monoclonal anti-CD30. Lancet 339, 1195–1196 (1992).

Artículo CAS Google Académico

French, RR, Tutt, AL, Glennie, MJ, Hamblin, TJ & Bell, AJ Tratamiento de linfomas de células B con combinación de anticuerpos biespecíficos y saporina. Lancet 346, 223–224 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Brown, DC & Agnello, K. Sustancia intratecal P-Saporin en el perro: eficacia en el dolor del cáncer de hueso. Anestesiología 119, 1178–1185 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Bortolotti, M., Bolognesi, A., Battelli, MG & Polito, L. Alta eficacia antitumoral in vitro de la inmunotoxina dimérica Rituximab/Saporin-S6. Toxinas 8, 192 (2016).

Artículo Google Académico

Polito, L. et al. Dos inmunotoxinas que contienen saporina específicas para CD20 y CD22 muestran un comportamiento diferente en la eliminación de células de linfoma. Toxinas 9, 182 (2017).

Artículo Google Académico

Ah, S. et al. Una nueva toxina dirigida biespecífica de inmunogenicidad reducida que reconoce simultáneamente el factor de crecimiento epidérmico humano y los receptores de interleucina-4 en un modelo de ratón de carcinoma de mama metastásico. clin. Cáncer Res. 15, 6137–6147 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Ehrlich, D., Wang, B., Lu, W., Dowling, P. & Yuan, R. Terapia de inmunotoxina anti-HuD intratumoral para el cáncer de pulmón de células pequeñas y el neuroblastoma. J. Hematol. oncol. 7, https://doi.org/10.1186/s13045-014-0091-3 (2014).

Knödler, M. & Buyel, JF Bloques de construcción de inmunotoxinas fabricados en plantas: una hoja de ruta para producir fusiones terapéuticas de anticuerpos y toxinas. Biotecnología. Adv. 47, 107683 (2021).

Fleming, BD & Ho, M. Desarrollo de inmunotoxinas dirigidas a glipicano-3 para el tratamiento del cáncer de hígado: una actualización. Biomoléculas 10, 60934 (2020).

Dhez, A.-C. et al. Terapia dirigida del glioblastoma humano mediante la administración de una toxina a través de un péptido dirigido a la nucleolina de la superficie celular. J. celular. Fisiol. 233, 4091–4105 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Schmohl, J., Todhunter, D., Taras, E., Bachanova, V. & Vallera, D. Desarrollo de una inmunotoxina biespecífica desinmunizada DT2219 contra tumores malignos de células B. Toxinas 10, 32 (2018).

Artículo Google Académico

Giansanti, F., Flavell, D., Angelucci, F., Fabbrini, M. e Ippoliti, R. Estrategias para mejorar la utilidad clínica de las toxinas dirigidas a base de saporina. Toxinas 10, 82 (2018).

Artículo Google Académico

Onda, M. et al. Una inmunotoxina con inmunogenicidad muy reducida por identificación y eliminación de epítopos de células B. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 105, 11311–11316 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Mazor, R., King, EM & Pastan, I. Estrategias para reducir la inmunogenicidad de las inmunotoxinas recombinantes. Soy. J. Pathol. 188, 1736–1743 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Rust, A., Partridge, LJ, Davletov, B. & Hautbergue, GM El uso de proteínas inactivadoras de ribosomas derivadas de plantas en el desarrollo de inmunotoxinas: generaciones pasadas, presentes y futuras. Toxinas 9, 110344 (2017).

Borthakur, G. et al. Estudio de fase 1 de una inmunotoxina anti-CD33, anticuerpo monoclonal humanizado M195 conjugado con gelonina recombinante (HUM-195/rGEL), en pacientes con neoplasias malignas mieloides avanzadas. Haematologica 98, 217–221 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Kreitman, RJ et al. Ensayo de fase II de inmunotoxina recombinante RFB4 (dsFv)-PE38 (BL22) en pacientes con leucemia de células pilosas. J. Clin. oncol. 27, 2983–2990 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Allahyari , H. , Heidari , S. , Ghamgosha , M. , Saffarian , P. & Amani , J. Inmunotoxina: una nueva herramienta para la terapia del cáncer . Tumor Biol. 39, 1010428317692226 (2017).

Artículo Google Académico

Shafiee, F., Aucoin, MG y Jahanian-Najafabadi, A. Terapia dirigida basada en la toxina diftérica: un artículo de revisión. Frente. Microbiol. 10, 2340 (2019).

Artículo Google Académico

Kim, JS, Jun, SY & Kim, YS Temas críticos en el desarrollo de inmunotoxinas para la terapia contra el cáncer. J. Pharm. ciencia 109, 104–115 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Jen, EY et al. Resumen de aprobación de la FDA: Tagraxofusp-erzs para el tratamiento de la neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas. clin. Cáncer Res. 26, 532–536 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Lin, AY & Dinner, SN Moxetumomab Pasudotox para la leucemia de células peludas: desarrollo preclínico para la aprobación de la FDA. Sangre Adv. 3, 2905–2910 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Li, S. et al. Síntesis y caracterización de un ligando específico de αvβ6 de alta afinidad para aplicaciones in vitro e in vivo. mol. Cáncer Ther. 8, 1239–1249 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Descargar referencias

Damos las gracias a Emily Miller para la asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [IRO1CA164447-01] y fondos internos de investigación y desarrollo de SRI International.

SRI International, División de Biociencias, 140 Research Drive, Harrisonburg, VA, 22802, EE. UU.

Curtis A. Allred, Claire Gormley, Indu Venugopal, Shunzi Li, Michael J. McGuire y Kathlynn C. Brown

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

El concepto y el diseño del estudio estuvieron a cargo de CAAMJM y KCB. La adquisición de datos estuvo a cargo de CAA, CG y IV. La síntesis y caracterización de péptidos estuvo a cargo de SL. El análisis y la interpretación de los datos estuvieron a cargo de CAA, CG, IV, MJM y KCB. de la escritura fue realizada por CAA y KCB La financiación fue obtenida por KCB

Correspondencia a Kathlynn C. Brown.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Manish Charan, Andrea Bolognesi y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Marina Holz y Karli Montague-Cardoso.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Allred, CA, Gormley, C., Venugopal, I. et al. Entrega intracelular específica de tumor: transporte guiado por péptidos de una toxina catalítica. Comun Biol 6, 60 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04385-7

Descargar cita

Recibido: 01 junio 2021

Aceptado: 20 de diciembre de 2022

Publicado: 17 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04385-7

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.