Regulación reversible de las actividades Cas12a por AcrVA5

Cell Discovery volumen 8, Número de artículo: 45 (2022) Citar este artículo

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Estimado editor,

El sistema de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR)/asociadas a CRISPR (Cas) agrupadas y regularmente interespaciadas protege a las bacterias y las arqueas de los elementos genéticos móviles (MGEs) como los bacteriófagos1. El efector Cas puede ser guiado por un CRISPR RNA (crRNA) para dirigirse a los ácidos nucleicos invasores mediante el emparejamiento de bases y luego escinde el objetivo para proporcionar inmunidad al huésped2,3. Para hacer frente a la presión inmunitaria impuesta por el sistema CRISPR del huésped, los fagos han desarrollado diferentes tipos de sistemas anti-CRISPR (Acr) para inactivar las nucleasas Cas y, a su vez, cerrar el sistema inmunitario del huésped4. Las proteínas Acr pueden interactuar directamente con las proteínas Cas para evitar la carga de crRNA o la unión al objetivo; alternativamente, poseen actividades enzimáticas para escindir los crRNA o modificar postraduccionalmente las proteínas Cas4. Entre ellos, existe una acetiltransferasa de la familia GNAT recientemente informada, a saber, AcrVA5, que está codificada por los MGE e inhibe específicamente el efector tipo VA Cas12a a través de la modificación con acetilo de un sitio clave de lisina. El Cas12a inactivado con AcrVA5 pierde la capacidad de interactuar con el sitio del motivo adyacente del protoespaciador (PAM) y falla en la protección de los huéspedes al escindir los MGE invasores5,6. Mediante la inactivación del sistema Cas12a, los MGE que contienen el gen acrVA5 pueden apagar de manera efectiva el sistema de inmunidad bacteriana y tienen el potencial de propagarse ampliamente entre los huéspedes que albergan Cas12a. Sin embargo, para nuestra gran sorpresa, el gen acrVA5 existe solo en tres cepas de Moraxella bovoculi que han perdido sus desacetilasas (Tabla complementaria S1). Por lo tanto, es razonable sospechar que puede existir una relación competitiva entre la acetiltransferasa AcrVA5 y las desacetilasas bacterianas ampliamente distribuidas7, que pueden reactivar Cas12a por desacetilación para proteger a los huéspedes de la invasión de MGE que albergan el casete acrVA5.

Primero realizamos el experimento de acetilación in vitro mediado por AcrVA5 y mostramos que la bacteria Lachnospiraceae (Lb) Cas12a acetilada con AcrVA5 perdió las actividades de escisión tanto cis como trans hacia el ADN diana de doble cadena (dsDNA) (Figura complementaria S1a, b) , que fue consistente con los hallazgos anteriores5,6, sin embargo, el tratamiento con AcrVA5 no mostró ningún efecto sobre las actividades de escisión trans de LbCas12a cuando se activó por el ADN monocatenario objetivo (ssDNA) (Fig. S1c complementaria). Como el sitio PAM solo es necesario para que Cas12a reconozca el dsDNA objetivo pero no el ssDNA8, los resultados anteriores confirmaron además que la acetilación mediada por AcrVA5 impidió que Cas12a interactuara con las secuencias PAM en el dsDNA5 objetivo.

Además de LbCas12a, también analizamos ortólogos Cas12a de Francisella tularensis subsp. novicida (FnCas12a) y Acidaminococcus sp. (AsCas12a) y demostró que AcrVA5 pudo inactivar ambos ortólogos (Figuras complementarias S2 y S3). Notablemente, AcrVA5 alguna vez demostró ser ineficaz contra AsCas12a en un estudio anterior6, sin embargo, encontramos que AsCas12a contenía el residuo de lisina conservado (Fig. S3c complementaria) y mostró que el tratamiento mediado por AcrVA5 condujo a la pérdida de ambos cis- y actividades de escisión trans de AsCas12a con dsDNA diana.

La acetilación de lisina postraduccional juega un papel importante en diversos procesos celulares en organismos desde bacterias hasta humanos9. En bacterias, la CobB de tipo sirtuina dependiente de NAD+ desacetila un gran número de proteínas y regula el nivel de acetilación global7. Para probar si CobB puede desacetilar el Cas12a tratado con AcrVA5 y reactivar sus actividades de escisión cis y trans, luego purificamos E. coli CobB y LbCas12a recombinantes y realizamos el ensayo de desacetilación in vitro. Según los resultados de la transferencia Western, AcrVA5 acetiló con éxito Cas12a en presencia de acetil-CoA, y la modificación de acetilo se pudo eliminar de manera eficiente después de ser tratada con CobB. De acuerdo con hallazgos anteriores7, la desacetilación mediada por CobB requiere estrictamente NAD+ como cofactor (Fig. S4 complementaria). En consecuencia, el LbCas12a acetilado con AcrVA5 perdió las actividades de escisión tanto cis como trans con el dsDNA objetivo, pero recuperó ambas actividades en gran medida después de ser desacetilado por CobB (Fig. 1a, b). Además, probamos varios ortólogos de Cas12a, como FnCas12a y AsCas12a, y descubrimos que CobB podía desacetilar y reactivar ambos ortólogos de Cas12a (Figuras complementarias S5–S8). Cabe mencionar que la reactivación exitosa de AsCas12a acetilado mediante el tratamiento con CobB demostró una vez más que AsCas12a es un objetivo de AcrVA5 (Figura complementaria S3), mientras que la razón de los resultados distintos entre este trabajo y el estudio anterior6 aún se desconocía y podría ser una pregunta interesante sujeta a una mayor investigación. Sobre la base de los resultados anteriores, se puede concluir que AcrVA5 y CobB regulan de forma reversible las actividades de escisión cis y trans de Cas12a al modular su estado de acetilo in vitro.

a El experimento de escisión en cis de LbCas12a con dsDNA objetivo. Como se ilustra a continuación, el Cas12a activo escindió con éxito el dsDNA objetivo en dos partes con la guía del crRNA; sin embargo, el Cas12a acetilado se inactivó y perdió las actividades de escisión en cis contra el dsDNA objetivo. M, escalera de ADN de 1 kb (Thermo Fisher Scientific); S, sustrato de dsDNA; P, productos escindidos en cis de Cas12a. b El experimento de escisión trans LbCas12a con dsDNA objetivo. Como se ilustra a continuación, las actividades de escisión en trans de las proteínas Cas12a activas fueron activadas por el ADNds diana, escindiendo en trans el informador extintor de fluorescencia (informador FQ) e iluminando las señales fluorescentes. Sin embargo, una vez que se acetiló Cas12a, se inactivó y perdió las actividades de escisión trans en presencia del dsDNA objetivo. La señal de fluorescencia se recolectó con una máquina qPCR en tiempo real y los valores se mostraron restando la señal de fondo. NC, la reacción de control negativo sin diana añadida; LbCas12a, reacción usando LbCas12a sin tratar; LbCas12a-AcCoA, reacción usando LbCas12a tratada solo con acetil-CoA; LbCas12a-AcCoA-AcrVA5, reacción usando LbCas12a tratada con AcrVA5 en presencia de acetil-CoA; acLbCas12a, LbCas12a acetilado con AcrVA5; acLbCas12a-NAD+, LbCas12a acetilada tratada solo con NAD+; acLbCas12a-NAD+-CobB, LbCas12a acetilada tratada con CobB en presencia de NAD+. c Análisis del papel fisiológico de CobB en la protección del huésped contra la invasión del plásmido reportero apr extraño. W3110/cas12a, el tipo salvaje que expresa el complejo LbCas12a/crRNA; ΔcobB, el mutante nulo cobB que expresa el complejo LbCas12a/crRNA; W3110/cobB+cas12a, el tipo salvaje que expresa el complejo LbCas12a/crRNA así como el CobB. apr-WT, plásmido informador con el gen apr de tipo salvaje; apr-Mut, plásmido informador con el gen apr mutante que puede escapar de la escisión por Cas12a. d Un modelo regulador de la regulación reversible mediada por AcrVA5 y CobB de las actividades de Cas12a. La acetiltransferasa AcrVA5 usa acetil-CoA para acetilar Cas12a, inactivando Cas12a y el sistema de resistencia del huésped contra los MGE; sin embargo, el huésped posee el CobB dependiente de NAD+, que desacetila y reactiva Cas12a y proporciona al huésped una protección secundaria contra el ácido nucleico invasor. ácidos.

Exploramos más a fondo el papel fisiológico de CobB en la protección del huésped que contiene Cas12a de la invasión de MGE que albergan el gen acrVA5. Primero construimos un plásmido CRISPR que expresaba tanto LbCas12a como un crRNA dirigido a una secuencia específica en el gen de resistencia a la apramicina (apr) y lo transformamos en cepas de E. coli con o sin un alto nivel de expresión de CobB (Figura complementaria S9). Debido al bajo nivel de expresión del gen cobB nativo en E. coli10 (Fig. S10 complementaria), el tipo salvaje W3110, así como las cepas con eliminación de cobB, se consideraron como el huésped negativo para cobB, mientras que la cepa con sobreexpresión de cobB fue la huésped positivo para cobB. Para preparar un plásmido informador sin la secuencia de orientación del complejo Cas12a/crRNA, mutamos la secuencia de ADN dirigida a Cas12a en el gen apr sin cambiar la secuencia de aminoácidos ni la resistencia a la apramicina (Fig. S11 complementaria), obteniendo una mutación gen apr. Debido a que la mutación sin sentido cambió tanto el sitio PAM como la secuencia guía, Cas12a no logró escindir la secuencia objetivo in vitro (Fig. S11b complementaria). Como resultado, el plásmido informador con apr mutante escapó efectivamente del sistema de defensa del huésped y mostró altas eficiencias de transformación de manera independiente a acrVA5 (Fig. 1c), que por lo tanto se empleó como control del ensayo de transformación.

El plásmido informador que contenía el gen apr de tipo salvaje se transformó luego en cepas de E. coli que expresan Cas12a para imitar la invasión de MGE y, como se esperaba, en ausencia del gen acrVA5, no se pudieron obtener transformantes en todas las cepas probadas independientemente de la expresión. el nivel de CobB, que representa la invasión del plásmido extraño, podría ser completamente bloqueado por los huéspedes (Fig. 1c). Sin embargo, si el plásmido informador contenía tanto apr como acrVA5, imitando a los MGE que albergaban el casete acrVA5, la alta eficiencia de transformación del plásmido informador se obtuvo en los huéspedes cobB-negativos, lo que concordaba con los hallazgos anteriores de que AcrVA5 inactivaba efectivamente a Cas12a. Como la sobreexpresión de CobB en el huésped positivo para cobB podría desacetilar y reactivar Cas12a acetilado con AcrVA5, la transformación del plásmido informador se bloqueó en gran medida. Como era de esperar, la eficiencia del plásmido informador aún era mucho más baja que la del control, aunque la sobreexpresión de CobB y AcrVA5 puede reducir severamente las eficiencias de transformación de E. coli (Fig. 1c). Con base en los resultados anteriores, se puede concluir que AcrVA5 y CobB regularon reversiblemente las actividades de Cas12a in vivo a través de la acetilación y la desacetilación, respectivamente.

Como la modificación acetilada de Cas12a mediada por AcrVA5 ha sido considerada como una estrategia anti-Cas12a eficaz por los MGE5,6, la reactivación de la desacetilación de Cas12a mediada por CobB a través de la modificación puede tomarse tanto como una estrategia de prevención de los elementos anti-CRISPR como una salvaguardar el sistema de defensa CRISPR, protegiendo a los hosts de la invasión de los MGE que contienen acrVA5 (Fig. 1d). Además, este estudio destaca el potencial para crear sistemas más complejos para regular las actividades de escisión de Cas12a, lo que puede facilitar tanto la edición de genes in vivo como la detección de ácidos nucleicos diana in vitro11.

Además de Cas12a, AcrVA5 puede funcionar como una acetiltransferasa de amplio espectro e influye en los procesos metabólicos celulares. A continuación, realizamos el análisis de transferencia Western in vitro mediante el uso de extractos celulares de E. coli y AcrVA5 purificado y descubrimos que AcrVA5 podía acetilar una gran cantidad de proteínas (Fig. S12 complementaria). De manera similar, después de la sobreexpresión de AcrVA5 en E. coli, el nivel de acetilación celular total aumentó considerablemente, y CobB podría desacetilar las proteínas acetiladas de manera eficiente en presencia de NAD + (Fig. S13 complementaria). Con el empleo de espectrometría de masas, caracterizamos además 2688 sitios y 1101 proteínas como objetivos potenciales de AcrVA5 (Tabla complementaria S2). Probablemente debido al pequeño tamaño de la proteína y al impedimento estérico reducido a su vez, AcrVA5 no mostró una preferencia obvia de secuencia objetivo, pero favoreció los aminoácidos cargados positivamente como la lisina, la arginina y la histidina (Fig. S14 complementaria). Teniendo en cuenta los amplios objetivos de AcrVA5, uno puede imaginar que CobB y AcrVA5 compiten por el control del sistema inmunitario del huésped y más allá. Además, recientemente se descubrió que las proteínas Dsr, que contienen los dominios de desacetilasa, protegen a los huéspedes contra la invasión de los fagos dsDNA12, y el presente estudio posiblemente proporcione una pista sobre los mecanismos poco claros.

En conjunto, se podría inferir que las guerras entre los MGE invasores y los huéspedes microbianos nunca terminarán, y además de la modificación con acetilo y desacetilo, probablemente existan otros tipos de mecanismos competitivos sujetos a futuras investigaciones. Mientras que tal como dice el idioma chino, uno puede creer que un vicio sube un pie, pero las virtudes suben diez.

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Agradecemos al profesor Jiaoyu Deng (Instituto de Virología de Wuhan, CAS) por proporcionar generosamente la cepa E. coli W3110 y los mutantes. Agradecemos a Qiuxiang Cheng (Tolo Biotech.) por su ayuda en el análisis de datos, a Weixin Li, Yuangang Ni y Bangtai Luo (Tolo Biotech.) por su ayuda en la purificación de proteínas, y a Jiacheng Wu (Shanghai Tech University) por su ayuda en bioinformática. análisis. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31922046, 31770057), el Proyecto de Medicina Sanming en Shenzhen (SZSM202011017) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2018YFA0903700).

Estos autores contribuyeron por igual: Xiaoman Kang, Lei Yin, Songkuan Zhuang

Centro CAS para la Excelencia en Ciencias Moleculares de Plantas, Academia de Ciencias de China, Shanghái, China

Xiaoman Kang y Guoping Zhao

Universidad de la Academia China de Ciencias, Beijing, China

Xiaoman Kang

Tolo Biotechnology Company Limited, Shanghái, China

lei yin

Departamento de Laboratorio Clínico, Segundo Hospital Popular de Shenzhen e Instituto de Medicina Traslacional/Primer Hospital Afiliado del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Shenzhen, Shenzhen, China

Songkuan Zhuang, Tianshuai Hu, Yong Xu y Jin Wang

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Normal de Shanghái, Shanghái, China

Zhile Wu

Instituto de Antibióticos, Hospital Huashan, Universidad de Fudan, Shanghái, China

Yijian Chen

Laboratorio Clave de Farmacología Clínica de Antibióticos, Comisión Nacional de Salud, Shanghái, China

Yijian Chen

Laboratorio clave de biología de sistemas y biología sintética para tumores urogenitales de Guangdong, segundo hospital popular de Shenzhen/primer hospital afiliado de la Universidad de Shenzhen, Shenzhen, China

jin wang

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JW concibió el proyecto y diseñó los experimentos. XK, LY y SZ realizaron la mayoría de los experimentos y contribuyeron igualmente a este trabajo. TH ayudó con la purificación de proteínas. ZW realizó el trabajo de bioinformática. GZ, YC, YX y JW analizaron los datos experimentales. JW escribió el manuscrito y todos los autores revisaron el manuscrito y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Yijian Chen, Yong Xu o Jin Wang.

JW y GZ son cofundadores de Tolo Biotechnology Co., Ltd. LY es un empleado de Tolo Biotechnology Co., Ltd. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Kang, X., Yin, L., Zhuang, S. et al. Regulación reversible de las actividades de Cas12a por acetilación mediada por AcrVA5 y desacetilación mediada por CobB. Descubrimiento celular 8, 45 (2022). https://doi.org/10.1038/s41421-022-00396-0

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Recibido: 15 noviembre 2021

Aceptado: 10 de marzo de 2022

Publicado: 17 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41421-022-00396-0

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