La deficiencia de poli - Coastwise Ventures Group Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2800 (2023) Citar este artículo

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Acinetobacter baumannii es un patógeno nosocomial que puede ser resistente a los antibióticos al modular rápidamente sus mecanismos antidrogas. El A. baumannii multirresistente ha sido considerado uno de los patógenos más amenazantes para nuestra sociedad. La formación de biopelículas y las células persistentes dentro de la matriz de biopelículas se reconocen como problemas intratables, especialmente en infecciones adquiridas en hospitales. La poli-β-1,6-N-acetil-glucosamina (PNAG) es uno de los componentes básicos importantes de la biopelícula de A. baumannii. Aquí, descubrimos una regulación de fosforilo de proteína en PNAG desacetilasa, AbPgaB1, en la que se fosforiló el residuo Ser411. La regulación de fosforilo en AbPgaB1 modula la tasa de rotación del producto en la que se produce PNAG desacetilado y se refleja en la producción de biopelículas. Además, descubrimos que la cepa de A. baumannii deficiente en PgaB muestra el nivel más bajo de producción de biopelículas, pero tiene una concentración de inhibición mínima alta para los antibióticos colistina y tetraciclina. Sobre la base de los efectos post-antibióticos bactericidas y los ensayos de destrucción dependientes del tiempo con fármacos antibacterianos, afirmamos que A. baumannii deficiente en PgaB se convierte en células tolerantes a la colistina. Este estudio utiliza un modelo tolerante a la colistina independiente del biofilm de A. baumannii para investigar más a fondo sus características y mecanismos para comprender mejor los resultados clínicos.

En las últimas décadas, el aumento de la resistencia a los antibióticos ha resultado en un mayor riesgo de infecciones patógenas nosocomiales. Acinetobacter baumannii resistente a los carbapenémicos es una causa frecuente de infecciones oportunistas que a menudo ponen en peligro la vida en pacientes en estado crítico. La expresión de carbapenemasas es el mecanismo más importante para conferir resistencia a carbapenemas en patógenos resistentes a fármacos1,2. Evidencias como la pérdida de la porina de la membrana externa3,4, la expresión diferencial de la proteína de unión a penicilina5 y la sobreproducción de sistemas de salida6 también se han descrito como implicados en la resistencia a los carbapenémicos en A. baumannii. La formación de biopelículas permite a A. baumannii colonizar en diferentes ambientes y suele estar asociada a la virulencia7,8. El primer paso para iniciar la formación de biopelículas es que las células planctónicas necesitan adherirse a superficies bióticas o abióticas. A través de los procedimientos de adhesión celular y proliferación celular, las estructuras de biopelículas maduran y reanudan un estilo de vida planctónico cuando se dispersan a nuevos entornos. Se han identificado varios factores asociados con la formación de biopelículas en A. baumannii, incluido el sistema de ensamblaje de chaperonas ujieres CsuA/BABCDE pili9,10, el sistema de dos componentes BfmS/BfmR11, la proteína de membrana externa OmpA12,13, la proteína asociada a biopelículas14,15 , autoinductor sintasa AbaI16 y el complejo proteico PgaABCD que se requiere para la síntesis de poli-beta-1–6-N-acetilglucosamina (PNAG)17.

El PNAG parcialmente desacetilado (dPNAG) se considera un exopolisacárido necesario para estructurar biopelículas en varios patógenos humanos, como A. baumannii17, Aggregatibacter spp.18, Bordetella pertussis19,20, Klebsiella pneumonia21, Staphylococcus aureus22 y S. epidermidis23. El exopolisacárido dPNAG se polimeriza y transloca a través del sistema PgaABCD en A. baumannii17. El sistema homólogo en E. coli muestra que se requieren PgaC y PgaD para la polimerización de PNAG24. El PNAG polimerizado es parcialmente desacetilado por PgaB y posteriormente translocado por PgaA24. Los resultados de detección de biopelículas de las cepas knockout de E. coli revelaron que PgaA y PgaB son necesarias para la translocación de PNAG, mientras que la cepa con deleción de PgaC poseía PNAG polimerizado indetectable17,24. El transportador PgaA de PNAG poseía varios residuos cargados negativamente dentro de su poro de secreción de barril β para la unión inicial a dPNAG25. La mutación dirigida al sitio y la detección de biopelículas revelaron que los residuos cargados negativamente en el poro de secreción de PgaA dan como resultado la preferencia por interactuar con dPNAG25 cargado positivamente. Por lo tanto, no se consideró que el PNAG completamente acetilado se exportara para servir como exopolisacárido de soporte de biopelículas25.

La N-desacetilasa PgaB de PNAG desempeña un papel fundamental en la regulación de los niveles de acetilo de PNAG y sirve como puente para la translocación de dPNAG por parte de PgaA26. Los dominios N- y C-terminal de PgaB son necesarios para procesar la des-N-acetilación de PNAG26. La región catalítica de des-N-acetilación está ubicada en el dominio N-terminal de PgaB, mientras que el dominio C-terminal posee actividad de hidrólisis de glicosil y es fundamental para la exportación de PNAG20,26. Según el análisis de la estructura cristalina de EcPgaB, se afirmó que un bucle de horquilla β específico (residuos 610–623) interactúa con PNAG/dPNAG para la exportación26. PgaB mostró actividad dependiente de cobalto y níquel para desacetilar parcialmente β-1,6-glucosamina pero no oligómero de β-1,4-glucosamina27. La posición de des-N-acetilación específica en el pentasacárido de glucosamina ocurrió en el segundo o tercer monosacárido del terminal no reductor27. Aunque las posiciones de des-N-acetilación se determinaron utilizando pentasacárido de β-1,6-glucosamina completamente acetilado junto con el tratamiento de exoglicosidasa SpHex27, el exopolisacárido natural PNAG aislado de bacterias aún mostraba una gran diversidad de longitud y sus posiciones desacetiladas.

La actividad de glicosil hidrolasa de Bordetella bronchiseptica PgaB (BbPgaB) descubre un nuevo mecanismo de modulación en la producción de PNAG, lo que demuestra la digestión con glucósidos de PNAG20 desacetilado. El dominio C-terminal de BbPgaB se clasificó en la familia de glicósido hidrolasa 153 (GH153) y ortólogo a E. coli PgaB20. La actividad de desacetilación de PgaB requiere dominios N- y C-terminal, mientras que los dominios C-terminal truncados de BbPgaB y EcPgaB pueden hidrolizar dPNAG20. El motivo requerido del polímero dPNAG para la escisión se identificó como GlcN-GlcNAc-GlcNAc, lo que demostró que la PNAG completamente acetilada no se reconoció como sustrato para el dominio C-terminal de BbPgaB20.

Las matrices de biopelículas se consideran protectores físicos para las bacterias, lo que conduce a una mayor tolerancia a los antibióticos. Los estudios proteómicos y de mutagénesis demostraron que OmpA, Omp33, CarO, la proteína similar a OprD, la proteína similar a DcaP supuesta y el metabolismo de la histidina son esenciales para la formación de biopelículas21. Sin embargo, hay menos información sobre el estudio de la resistencia a los medicamentos en A. baumannii para vincular su formación de biopelículas mediada por PNAG. Comparaciones previas en el transcriptoma de cepas clínicas de A. baumannii revelaron que el nivel transcripcional de PgaB (A1S_0938) en una cepa resistente a la colistina fue significativamente mayor que en una cepa sensible a la colistina28. Las modificaciones postraduccionales de proteínas son regulaciones reversibles que modulan las funciones de las proteínas en respuesta a varias reacciones fisiológicas. Nuestro estudio anterior descubrió que la PgaB de la cepa clínica SK17 de A. baumannii estaba fosforilada29. Este estudio confirmó la fosfo-regulación de la producción de biopelículas mediada por PgaB en A. baumannii ATCC15151. De acuerdo con la mutación dirigida al sitio y el ensayo de actividad de N-desacetilación, la fosfomodificación en el residuo Ser411 de PgaB mostró una tasa de rotación significativamente más alta que resultó en una mayor producción de dPNAG que sirve como componente básico para la biopelícula. Notamos que la cantidad de producción de biopelícula mediada por PNAG se correlacionó negativamente con la resistencia a la colistina en A. baumannii. La cepa con deleción de PgaB produjo la menor cantidad de biopelícula pero poseía una resistencia a la colistina significativamente mayor. Presumimos que la cepa de A. baumannii deficiente en PgaB acumula PNAG en el periplasma, lo que puede impedir la capacidad de la colistina para atacar la membrana citoplasmática de A. baumannii.

En los operones Pga, la N-acetilglucosamina desacetilasa PgaB posee la capacidad de regular el grado de acetilación en PNAG, lo que modula directamente la afinidad de unión de PNAG a la estructura del lumen de barril β de PgaA25. Luego, el PNAG parcialmente desacetilado (dPNAG) se transportó como un polisacárido extracelular a través de PgaA (Fig. 1a). El dominio TPR de PgaA en E. coli participó en la interacción proteína-proteína con PgaB, que es fundamental para la exportación de PNAG parcialmente desacetilado30. Con base en esta información, planteamos la hipótesis de que la formación de biopelículas en A. baumannii puede estar regulada por la N-desacetilasa PgaB. Hay dos operones Pga, A1S0938 a A1S0940 y A1S2162 a A1S2159, entre todas las cepas secuenciadas de A. baumannii (Fig. 1a). Ambas copias de N-acetilglucosamina desacetilasa (A1S0938 y A1S2161) se anotaron como PgaB y se clasificaron en la familia de carbohidrato esterasa (familia CE4) dentro de la base de datos de enzimas activas de carbohidratos definida actualmente (CAZy). Las proteínas codificantes de los genes A1S0938 y A1S2161 se definieron respectivamente como AbPgaB1 y AbPgaB2 en este estudio. PgaB es una proteína anclada a la membrana externa en la que los residuos S12 a N194 de AbPgaB1 y H35 a W70 de AbPgaB2 son regiones transmembrana predichas por TMRPres2D31 (Fig. S1). AbPgaB1 comparte 35,68 % y 41,64 % de identidades de secuencia con EcPgaB y BbPgaB, respectivamente. Según el análisis filogenético, AbPgaB1 (A1S0938) está cerca de B. bronchiseptica, que puede tener actividad de hidrólisis de glucósidos en el dominio C-terminal (Fig. 1b). Aunque AbPgaB1 y AbPgaB2 comparten una identidad de secuencia baja (32 %), todavía se agrupan dentro de PgaB de Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, B. bronchiseptica, B. pertussis e IcaB de Staphylococcus pero no de polisacárido desacetilasa de Pseudomonas. (Figura 1b).

Ilustración esquemática de dos operones de síntesis de PNAG en A. baumannii. ( a ) Los genes codificantes A1S-0938 a A1S-0940 y A1S-2162 a A1S-2159 se anotaron como operones de síntesis de PNAG en A. baumannii. Los complejos de proteína PgaC (marrón) y PgaD (naranja) se ubicaron en la membrana citoplasmática para polimerizar N-acetilglucosamina. PgaB es una PNAG desacetilasa que se ancla en la membrana externa y se localiza en el periplasma. La proteína transportadora de membrana externa PgaA contribuyó al transporte de PNAG parcialmente desacetilado como un exopolisacárido. ( b ) Análisis filogenético de polisacáridos desacetilasas en la familia CE4 de la base de datos CAZy de bacterias basadas en el método de agrupación Neighbor Joining.

Se considera que PgaB modula la proporción del grupo acetilo en PNAG. Sin embargo, la regulación de PgaB para producir PNAG acetilado diferencial como matriz de biopelícula aún no está clara. Se construyeron cepas de deleción de un solo gen (ΔAbpgaB1) y deleción de doble gen (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) de A. baumannii para el análisis de exopolisacáridos. El exopolisacárido de nivel de acetilo (incluido PNAG) extraído de A. baumannii ATCC 15151 (Ab15151) y sus cepas mutantes derivadas se determinaron en función del análisis de RMN de protones (Fig. S2). La señal de PNAG acetilado se cuantificó relativamente en función del área integral del pico a 2,0 ppm en los perfiles de RMN de protones (Fig. S2). El nivel de acetilación de los polisacáridos extraídos aumentó ligeramente desde ΔAbpgaB1 y aumentó aún más en la doble deleción. El exopolisacárido extraído de la cepa de doble deleción de pgaB representó señales de nivel de acetilo más altas que Ab15151, lo que demostró que la actividad de N-desacetilasa tanto de AbPgaB1 como de AbPgaB2 podría modular el nivel de acetilación de PNAG en Ab15151.

Realizamos análisis proteómicos y fosfoproteómicos para investigar las proteínas expresadas diferenciales entre los estilos de vida planctónicos y biofilm de A. baumannii. Con una combinación de datos proteómicos, se pudieron identificar 1334 proteínas expresadas constitutivas a partir de estilos de vida planctónicos y biofilm de Ab15151 (Fig. S3). Hubo 174 y 226 proteínas únicas que solo se identificaron a partir del plancton y la biopelícula de A. baumannii, respectivamente (Fig. S3). Entre estas proteínas identificadas, AbPgaB1 (A1S0938) se definió como una fosfoproteína confiable mediante análisis fosfoproteómico utilizando los procedimientos estándar descritos en Métodos. El gen codificante de AbPgaB1 se construyó y transformó en Ab15151 para la sobreexpresión y sus sitios fosforilados (sitios p) se confirmaron en función del AbPgaB1 purificado a través del análisis LC-MS/MS. Se identificaron siete sitios p inequívocos de cuatro péptidos fosforilados (péptidos p) en AbPgaB1 (Tabla S1). De acuerdo con la predicción de la estructura secundaria de la proteína de AbPgaB1 por Jpred432, el sitio p H229 está ubicado en la hélice α 7 (α7) en el dominio N-terminal, mientras que los sitios p T407, D408, S411 y D413 están ubicados en el bucle 11 en el dominio C-terminal (Fig. 2a). Había otros dos sitios p, Y482 e Y507, ubicados en α13 y α14 en el dominio C-terminal, respectivamente (Fig. 2a). La estructura de AbPgaB1 fue predicha por SWISS-MODEL basándose en la estructura cristalina de E. coli PgaB como plantilla (PDB: 4P7R)26. De acuerdo con los datos de MS/MS, se marcaron siete sitios p en AbPgaB1 en los dominios N y C que se anotaron respectivamente para tener actividad de PNAG desacetilasa y actividad de hidrólisis de glicosil (Fig. 2b). Para descubrir la regulación de la modificación de fosforilo en AbPgaB1, el tetrasacárido de N-acetilglucosamina (4-NAG) se acopló a la estructura modelada de AbPgaB1 (Fig. 2b). Los sitios p S411 y D413 estaban cerca de 4-NAG en AbPgaB1, lo que reveló que pueden ser candidatos para la investigación de la regulación de fosforilo en AbPgaB1. Los espectros MS/MS del péptido p "407TDPVSKDLVVTEQAK421" en el bucle 11 que contenía los sitios p T407, D408, S411 y D413 se muestran en la Fig. 2c. Estos resultados demuestran que la regulación de fosforilo del dominio C-terminal de AbPgaB1, específicamente los residuos S411 y D413, puede modular su actividad.

Los sitios fosforilados identificados en AbPgaB1 marcados en estructura secundaria y estructura terciaria. ( a ) Jpred4 predijo la estructura secundaria de AbPgaB1. Las estructuras de hélice alfa y hoja beta se marcaron en púrpura y amarillo, respectivamente. Los sitios p identificados se marcaron con "p" (rojo) en las secuencias de AbPgaB1. (b) El tetrasacárido de PNAG, 4-NAG, que la cadena principal mostraba en barras (verde) se acopló a la estructura modelada de AbPgaB1 (caricatura, predicha en base a la plantilla PDB: 4P7R26 por SWISS-MODEL) para mostrar la ubicación de los residuos fosforilados (amarillo) dentro de la estructura 3D. La estructura modelada fue editada usando PyMOL. (c) Espectros MS/MS del p-péptido "407TDPVSKDLVVTEQAK421" en AbPgaB1. Cada pico revela la m/z de los fragmentos después de la separación por espectrometría de masas en tándem y es procesado por MaxQuant. Los fragmentos N-terminal b-ion y C-terminal y-ion se resaltaron en azul y rojo, respectivamente.

De acuerdo con el análisis de la estructura de modelado, planteamos la hipótesis de que el sitio p Ser411 era fundamental para unir y liberar el producto dPNAG. Después, el residuo Ser411 de AbPgaB1 se reemplazó por Ala o Asp para imitar las condiciones fosforiladas o no fosforiladas. El AbPgaB1 y sus derivados mutados directamente en el sitio se construyeron respectivamente en el vector de expresión pABCLIIa para generar proteínas de fusión C-terminal His-tag para una mayor purificación por afinidad. AbPgaB1 sobreexpresado y sus derivados se purificaron para el ensayo de actividad de desacetilación usando PNAG parcialmente desacetilado como sustrato. Los parámetros cinéticos de la actividad desacetilasa de AbPgaB1 revelaron que el valor de Km aumentó 4,9 veces cuando se reemplazó Ser411 con Asp (Tabla 1). Por otro lado, la velocidad máxima de AbPgaB1 aumentó 8,4 veces cuando se fosforiló Ser411 (Tabla 1). En comparación con el AbPgaB1 mutado con S411A no fosforilado, el AbPgaB1 fosfomimético (S411D) poseía un número de recambio espectacularmente mayor, lo que implica una producción de PNAG más desacetilada.

Para descubrir la regulación mediada por fosforilo de AbPgaB1, se construyó la estructura de modelado del dominio C-terminal de AbPgaB1 (residuos 308–659, AbPgaB1308–659) basada en la estructura cristalina EcPgaB (PDB: 4P7R)26 del tetrasacárido GlcNAc incorporado como plantilla . La estructura de modelado AbPgaB1308–659 se alineó con EcPgaB (PDB: 4P7R) y B. bronchiseptica PgaB (BbPgaB, PDB: 6AU1) 20 que mostró residuos de interacción de tetrasacárido GlcNAc altamente conservados (Fig. S4a, b). De acuerdo con el análisis de la estructura cristalina de EcPgaB, el residuo W552 forma una interacción de apilamiento estrecho con el anillo piranoide y los enlaces de hidrógeno D472 con OH-3 y OH-4 de GlcNAc. Los reordenamientos espaciales de los residuos W549 y D470 de AbPgaB1 y los residuos W561 y D480 de BbPgaB estaban altamente conservados en los residuos W552 y D472 en EcPgaB, lo que implica la participación de estos residuos en la unión del tetrasacárido GlcNAc (Fig. S4a). Además, el residuo D473 de AbPgaB1308–659 era idéntico al residuo D475 en EcPgaB (PDB: 4F9J), que se consideró que formaba enlaces de hidrógeno bidentados con el tetrasacárido GlcNAc27. Por lo tanto, los residuos cercanos, como W549, D470 y D473 en AbPgaB1308–659, se definieron como los sitios activos que permiten el acoplamiento flexible del ligando de tetrasacárido GlcNAc. Entre los distintos rotámeros resultantes de esta interacción, se seleccionó el de menor energía como el tetrasacárido GlcNAc incorporado en la estructura modelada de AbPgaB1308–659 (Fig. S4c).

El extremo reductor del tetrasacárido GlcNAc en la estructura de modelado AbPgaB1308–659 se definió como la subunidad + 1 (Fig. S4c). En AbPgaB1308–659, el residuo W549 participa en la interacción de apilamiento con el anillo piranoide y su enlace de hidrógeno de la cadena principal con el resto N-acetilo de + 2 GlcNAc. El oxígeno de la cadena principal en el residuo Y430 formó un resto N-acetilo de enlace de hidrógeno de la subunidad + 1 de GlcNAc (Fig. S4c). AbPgaB1308–659 estaba fuertemente coordinado con + 1 GlcNAc por una red de enlaces de hidrógeno, incluida la cadena lateral de los residuos D413, R432, E472, S469, T467 y la cadena principal de Y430. La interacción única CH-π entre el residuo E472 y + 1 GlcNAc también contribuyó a la unión del ligando (Fig. S4c). El puente salino R432-E472 conservado (Fig. S4b) puede contribuir a la acomodación de + 1 GlcNAc y estabilizar esos bucles en la unión de PNAG (Fig. S4b, c). Por lo tanto, el imitador fosforilado Ser411 (S411D) ubicado cerca de R432 rompería el puente salino R432-E472 preexistente para desencadenar un despliegue parcial de los bucles27 (modelo de competencia de puente salino)33 (Fig. S4d, e). Este evento probablemente afectaría la red de puentes de hidrógeno que permite el alojamiento de + 1 GlcNAc. Además, en comparación con el complejo de tipo salvaje modelado, el grupo fosforilo a granel de S411D en AbPgaB308–659 causaría la repulsión espacial de PNAG para dificultar su unión (Fig. S4d, e).

Para investigar los efectos de la regulación mediada por fosfo sobre AbPgaB1 en la formación de biopelículas, se observaron Ab15151 y sus cepas mutantes derivadas mediante microscopio electrónico de barrido (SEM). Las biopelículas de Ab15151 de tipo salvaje mostraron una estructura agregada y un exopolisacárido unido a la célula (Fig. 3a). La cepa de eliminación de AbPgaB1 (ΔAbpgaB1) mostró células agregadas en la matriz de biopelícula sin exopolisacárido observable (Fig. 3a). Este exopolisacárido unido a la célula se produjo cuando se complementó con AbpgaB1. Además, notamos que el AbPgaB1 fosfo-mimético complementado (Δ + S411D) mostró agregación celular y exopolisacárido unido a la célula en la estructura del biofilm. Por el contrario, no se observó exopolisacárido unido a células de la cepa complementada con AbPgaB1 no fosfomimético (Δ + S411A) (Fig. 3a). La cantidad de producción de biopelícula de Ab15151 y sus cepas mutantes derivadas se cuantificó mediante tinción con cristal violeta. Todos los valores cuantificados se normalizaron en función de las cantidades de biopelículas de Ab15151. A. baumannii produce menos biopelícula (58%) cuando su AbpgaB1 estaba inactiva (Fig. 3b). La producción de biopelícula se recuperó al 83 % de Ab15151 cuando la AbpgaB1 de tipo salvaje se complementó con la cepa de eliminación de AbpgaB1 (Fig. 3b). Es de destacar que las cantidades relativas de biopelícula de la cepa complementada con AbPgaB1 no fosforilado (Δ + S411A) y AbPgaB1 fosforilado (Δ + S411D) fueron del 61% y 101%, respectivamente (Fig. 3b). Demostró que el nivel de desacetilación de PNAG estaba regulado por la modificación mediada por fosforilo en el residuo Ser411 en AbPgaB1, lo que reflejaba la producción de biopelículas en A. baumannii.

Observación y cuantificación de la producción de biopelículas en A. baumannii ATCC15151 y las cepas mutantes mediadas por AbpgaB1. ( a ) Observación de la formación de biopelículas en Ab15151 y sus derivados a través de SEM. El panel superior mostraba la vista con un aumento de 7500 × y el panel inferior mostraba un aumento de 10 000 ×. La barra indicaba una escala de 1 µm. (b) La biopelícula se cuantificó mediante tinción con cristal violeta y se determinó la absorbancia a 595 nm. Los valores de OD595 de Ab15151 se definieron como 100 % para calcular las cantidades relativas de biopelícula de sus cepas mutantes derivadas. Cada punto de datos se promedió a partir de al menos 6 repeticiones. *Indicó una diferencia significativa de Ab15151 cuyo valor p de la prueba t fue inferior a 0,001.

La capacidad de producción de biopelículas en A. baumannii tendió en una dirección positiva en relación con su toxicidad y resistencia a los medicamentos. La evidencia anterior revela que la producción de biopelículas en A. baumannii está regulada por la modificación con fosforilo de un residuo en AbPgaB1. Además, planteamos la hipótesis de que la resistencia a los antibióticos en A. baumannii debería disminuir cuando AbPgaB1 se desfosforila en el residuo Ser411. Dado que A. baumannii tiene dos copias de pgaB en el genoma, construimos cepas de deleción de pgaB simple y doble para más ensayos sensibles a los antibióticos. De acuerdo con la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC) basada en el método de dilución en caldo, no hay una diferencia significativa en los valores de MIC frente a imipenem, ciprofloxacina, apramicina y vancomicina entre las cepas de A. baumannii analizadas (Tabla 2). Reveló la independencia de la formación de biopelículas y la tolerancia a estos cuatro antibióticos. Notamos que los valores de MIC de las cepas de A. baumannii para colistina y tetraciclina aumentaron significativamente (colistina 2,0 a 16,0 mg/L y tetraciclina 0,5 a 16,0 mg/L) cuando se eliminaron tanto AbpgaB1 como AbpgaB2 (Tabla 2, ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2, ΔΔ). Estos datos refutan nuestra hipótesis de que la cepa de doble deleción de PgaB produjo las cantidades más bajas de biopelícula entre las cepas de A. baumannii en este estudio, pero poseía la mayor tolerancia a los antibióticos colistina y tetraciclina (Tabla 2, Fig. S5). La colistina, también conocida como polimixina E, podría apuntar al lipopolisacárido (LPS) en las bacterias para alterar la integridad de la membrana celular y matar las bacterias. Se considera un tratamiento de último recurso para la infección por patógenos multirresistentes. Hasta donde sabemos, no hay evidencia que respalde la correlación entre la PNAG desacetilasa PgaB y la estructura de LPS. Curiosamente, la tolerancia de A. baumannii frente a la colistina está relacionada con su PNAG N-desacetilasa PgaB. Y hay evidencia de que la colistina afecta al LPS en la membrana citoplasmática34. Por lo tanto, planteamos además la hipótesis de que la cepa de doble deleción de PgaB mostraba una cepa deficiente de bombeo de PNAG en la que se acumula PNAG acetilado en el periplasma para impedir la interrupción por el tratamiento con colistina. Sin embargo, todavía necesitamos más evidencia para descubrir el mecanismo detallado involucrado en la tolerancia a la colistina cuando se eliminaron ambas PgaB.

La tetraciclina es un tipo de antibiótico que se une a los ribosomas 30S y da como resultado la inhibición de la síntesis de proteínas. Las cepas de doble deleción de PgaB tenían valores de CIM de tetraciclina más altos (Tabla 2). La apramicina es otro antibiótico utilizado en este estudio. La apramicina se dirige a la síntesis de proteínas para inhibir las bacterias. La MIC para apramicina no mostró diferencias entre todas las cepas de A. baumannii analizadas en este estudio (Tabla 2). Por lo tanto, consideramos que la tolerancia a tetraciclina de las cepas de doble deleción de PgaB se debe a su deficiente capacidad para penetrar en las células bacterianas. Sin embargo, se necesitan más estudios para validar esta hipótesis. De acuerdo con la MIC de las cepas Ab complementadas con AbpgaB1, el AbPgaB1 mutado WT, S411A o S411D, en el fondo ΔAbpgaB1 o ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 mostró una susceptibilidad similar a la colistina y la tetraciclina (Tabla 2, Fig. S6). Esto indicó que se produjo tolerancia a colistina o tetraciclina en ambas cepas con deleción de PgaB y que podría recuperarse mediante complementación con AbpgaB1 (Tabla 2).

Para determinar la tolerabilidad de los antibióticos en condiciones de biopelícula cuando se eliminan AbpgaB1 y/o AbpgaB2, se examinaron las concentraciones mínimas de erradicación de biopelícula (MBEC) (Tabla 3). El MBEC de todas las cepas probadas es más alto que el MIC, lo que indica que las células bacterianas incrustadas en la biopelícula pueden superar un mayor estrés antibiótico. No hay MBEC significativamente diferente de la cepa ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 y las otras cepas probadas. Los datos de MBEC revelan que la producción de biopelículas no contribuyó a la tolerancia a colistina y tetraciclina en la cepa ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2. Para confirmar que la tolerancia al fármaco que se produjo en la cepa de doble deleción de PgaB era repetible, se determinó la CIM de los fármacos antibacterianos en 4 pases. Notamos que la MIC de la cepa ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 para colistina y tetraciclina aumentó cuando se subtransfirió del primer pase al cuarto pase (Fig. S6). Este fenómeno fue repetible en al menos tres pruebas independientes. Nos llevó a proponer la hipótesis de que A. baumannii deficiente en PgaB puede convertirse en células tolerantes a los antibióticos para superar el efecto bactericida de la colistina. Las células persistentes muestran una población de bacterias que sobreviven a la exposición a un antibiótico bactericida35. Las bacterias resistentes a los antibióticos no provocan un aumento de la CMI, pero mueren a un ritmo menor que las células no persistentes35. El aumento de la MIC de la cepa ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 frente a colistina y tetraciclina durante 4 pases indicó que no se debe a la cantidad de células persistentes. El estrés por inanición es la principal presión selectiva durante la incubación de 4 pases. Demostró que la deficiencia de PgaB en A. baumannii puede conducir a la evolución para superar el estrés antibiótico.

Se realizaron efectos posteriores al antibiótico (PAE) de la colistina en A. baumannii para investigar la tolerancia a los antibióticos entre las cepas WT y mutantes en este estudio. Las cepas de Ab cultivadas durante la noche se diluyeron a OD600 0,1 para la administración de colistina. Después de una hora de tratamiento con colistina con la concentración probada, cada cepa de Ab probada se diluyó en serie y se colocó en placas de agar LB (Fig. 4a). Notamos que Ab15151, ΔAbpgaB1 y ΔAbpgaB2 eran todos susceptibles a la colistina en la concentración de 16,0 a 64,0 µg/mL (Fig. 4a). Sin embargo, la cepa de doble deleción de PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) mostró la mayor tolerancia cuando se trató con 16,0, 32,0 o 64,0 µg/mL de colistina durante 1 h (Fig. 4a). Para distinguir la persistencia del antibiótico de la tolerancia, la cepa ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 se eliminó a un ritmo más lento que otras cepas en presencia de 16,0 µg/mL de colistina durante un tratamiento de 0 a 4 h (Fig. 4b). La susceptibilidad de la cepa de doble deleción de PgaB se recuperó cuando se complementó con AbpgaB1 (Tabla 2, Fig. 4a,b). Tanto la PAE dependiente de la dosis como la dependiente del tiempo demostraron que la cepa con doble deleción de pgaB posee una alta tolerancia a la colistina. Apoya nuestra hipótesis de que después del tratamiento con colistina, las células persistentes de A. baumannii con deficiencia de PgaB pueden tener la capacidad de convertirse en células tolerantes a la colistina. Demuestra que la incidencia de la evolución que se produce en la cepa ΔpgaB1ΔpgaB2 puede ser más rápida que en las otras cepas de A. baumannii analizadas en este estudio. La tetraciclina PAE mostró perfiles similares entre las cepas de Ab en todas las dosis y períodos probados. (Fig. 4c, d). Reveló que las células bacterianas cargadas inicialmente (~ 106 CFU/mL) no fueron destruidas por el fármaco bacteriostático, tetraciclina, en la concentración de 4,0, 8,0 o 16,0 µg/mL de tratamiento durante 1 h (Fig. 4c) o después de 8,0 administración de tetraciclina µg/mL durante 4 h (Fig. 4d). Notamos que la persistencia del antibiótico en la cepa de doble deleción de PgaB no se observó cuando se administró con el fármaco bactericida ciprofloxacina o el fármaco bacteriostático apramicina (Fig. S7). Esto significa que la A. baumannii deficiente en PgaB es específicamente resistente a los antibióticos colistina y tetraciclina.

Efectos postantibióticos dependientes del tiempo de colistina y tetraciclina en cepas de A. baumannii en este estudio. Los cultivos de toda la noche se diluyeron a OD600 0,1 para colistina o 0,01 para administración de tetraciclina. Después de un tratamiento de 1 h con colistina (a) o tetraciclina (c), los cultivos se diluyeron diez veces en serie para manchar la placa de agar LB. Con la administración de 32 µg/mL de colistina (b) o 8 µg/mL de tetraciclina (d) dentro de las 4 h, todas las cepas analizadas se diluyeron diez veces y se incubaron durante la noche para evaluar su tasa de supervivencia.

Las características específicas de las células persistentes de antibióticos son que la tasa de replicación en presencia de antibióticos fue menor que en las células no persistentes35. Para distinguir las células tolerantes a los antibióticos de las células heterorresistentes, se llevaron a cabo ensayos de destrucción dependientes del tiempo de las cepas de A. baumannii bajo la administración de antibióticos. Todas las cepas de A. baumannii analizadas mostraron una curva de crecimiento similar sin la administración de antibióticos, lo que reveló que la deleción de pgaB y las cepas del complemento en este estudio no afectaron la replicación (Fig. 5). Los cultivos de cepas Ab con 16,0 µg/mL de tetraciclina mostraron un crecimiento estancado entre todas las cepas analizadas (Fig. 5). Las curvas de crecimiento de todas las cepas de Ab analizadas a las que se les administró 16,0 µg/mL de colistina también estaban estancadas excepto para la cepa deficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) (Fig. 5). La replicación de la cepa ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 también se inhibió cuando se trató con colistina, sin embargo, el crecimiento se recuperó después de un período de retraso (Fig. 5). Presumimos que las células sobrevivientes en un fondo deficiente en PgaB pueden convertirse en células tolerantes a la colistina y crecer durante la incubación durante la noche.

Los ensayos de destrucción dependientes del tiempo de las cepas mutantes de A. baumannii mediadas por WT y PgaB demostraron su tolerancia a la colistina. En este estudio, los cultivos de la noche a la mañana de las cepas de A. baumannii se diluyeron a OD600 0,05 para la determinación de la curva de crecimiento. Se administraron los antibióticos colistina (rojo) y tetraciclina (azul) con una concentración final de 16,0 µg/mL después de 2 h de incubación. Durante 27 h de incubación, se determinó la densidad óptica de cada cultivo a 600 nm mediante un lector de microplacas. La curva de crecimiento dibujada en negro era la condición sin administración de antibiótico como control.

La construcción de este estudio de cepas mutantes pgaB se basó en su región de recombinación homóloga para eliminar AbpgaB1 o AbpgaB2 en el genoma Ab15151. Para descartar los efectos de la mutación polar en la expresión de pgaC y pgaD aguas abajo, el pgaBCD (A1S0938 ~ A1S0940) se construyó en el vector de expresión pABCLIIb y luego se transformó en Ab15151 con eliminación de pgaB (ΔAbpgaB1 o ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) como cepas complementarias de AbpgaB1 (+ WT, + S411A) , o + S411D). Los ensayos de formación de biopelículas mostraron que la cepa del complemento AbpgaB1 (Δ + WT) puede recuperar la producción de biopelículas (Fig. 3b). La determinación de MIC también indicó que las cepas del complemento AbpgaB1 (incluidas las cepas AbpgaB1 mutadas S411A o S411D) podrían recuperar la susceptibilidad a la colistina y la tetraciclina en el fondo ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 (Fig. S4). De acuerdo con nuestras experiencias previas, la proteína complementada inducida por IPTG en la determinación de CIM de dilución en caldo puede no expresarse constitutivamente36. También confirmamos la expresión de PgaB1 en ensayos MIC de dilución en caldo mediante el uso de Western para detectar señales de fusión de etiqueta His en AbPgaB1 complementado (Fig. S8). El AbPgaB1 complementado podría recuperar la producción de biopelícula en el fondo ΔAbpgaB1 y recuperar la susceptibilidad tanto a la colistina como a la tetraciclina en el fondo ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2. Nuestros datos respaldan que no hubo efectos de mutación polar en nuestras cepas Ab construidas.

En este estudio, usamos ninhidrina para cuantificar la amina libre expuesta cuando PNAG fue desacetilado por AbPgaB1. El sustrato de AbPgaB1 es PNAG aislado de la cepa clínica SK17 de A. baumannii. Dado que ambos operones PGA existen en todas las cepas secuenciadas de A. baumannii, PNAG debería ser uno de los componentes de sus exopolisacáridos. La posición específica de des-N-acetilación se descubrió utilizando pentasacárido PNAG completamente acetilado como sustrato27,37. El PNAG nativo aislado de bacterias todavía mostraba una gran diversidad de niveles de acetilación, posiciones desacetiladas y pesos moleculares. Para averiguar la regulación de fosforilo en el residuo Ser411 en AbPgaB1, los parámetros cinéticos entre AbPgaB1 y sus derivados mutantes directos al sitio se determinaron usando ensayos de ninhidrina con PNAG extraído nativo como sustrato. Recolectamos un lote de PNAG de extracción nativa para todos los ensayos de actividad de ninhidrina en este estudio para limitar la variación entre diferentes lotes de PNAG de extracción nativa. Debido a que la PNAG extraída ya está parcialmente desacetilada, es posible que la actividad específica de AbPgaB1 en este estudio no se compare con otros datos publicados en la misma línea base. Sin embargo, es apropiado comparar los parámetros cinéticos entre AbPgaB1 y su mutante en este estudio utilizando PNAG aislado del mismo lote. Con base en los ensayos de actividad de AbPgaB1 y el mutante dirigido al sitio S411A o S411D, concluimos que AbPgaB1 fosforilado (S411D) tiene un número de recambio de dPNAG de producto más alto que WT y AbPgaB1 no fosforilado (S411A) (Tabla 1). Revela que AbPgaB1_S411D tiene una mayor eficacia para desacetilar PNAG para el bombeo de PgaA como bloque de construcción de biopelícula. Este resultado también es consistente con la cuantificación de biopelículas y la observación SEM entre Ab15151 y sus cepas derivadas (Fig. 3).

Hasta donde sabemos, hay dos operones PGA altamente conservados en todas las cepas secuenciadas de A. baumannii. La fosforilación postraduccional de proteínas se encontró en PNAG N-desacetilasa AbPgaB1 (A1S_0938) en lugar de AbPgaB2 (A1S_2161). Se construyeron cepas individuales con deleción de AbPgaB1 o AbPgaB2 (ΔAbpgaB1 o ΔAbpgaB2) y la cepa de doble deleción de PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) para dilucidar la contribución a la producción de biopelículas y las tolerancias a los fármacos antibacterianos. La cepa Ab15151 con eliminación de AbPgaB1 (ΔAbpgaB1) produce menos biopelícula, cuyo fenotipo se invirtió en ΔAbpgaB1 complementado con AbpgaB1_WT (Δ + WT) o AbpgaB1 contenía mutante fosfomimético en el residuo Ser411 (Δ + S411D) (Fig. 3). El alto nivel de acetilo de PNAG parece unirse a PgaA en menor medida contra la exportación de exopolisacáridos30, lo que refleja la menor producción de biopelículas en ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 (Fig. S5). La cepa deficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) poseía alta tolerancia a colistina y tetraciclina entre todas las cepas analizadas (Tabla 2 y Fig. 4). Este resultado demostró una estrategia independiente del biofilm de A. baumannii para superar el estrés por antibióticos. El estudio anterior mencionó que la E. coli deficiente en PgaB no puede formar una biopelícula debido a la acumulación de PNAG en el periplasma24. El estudio de BbPgaB en B. bronchiseptica mostró que la BbPgaB y su actividad desacetiladora no son necesarias para la translocación de PNAG38. Hay dos posibilidades para dar como resultado la translocación PNAG independiente de BbPgaB en B. bronchiseptica38. Uno es el dominio TPR más pequeño en BbPgaA que EcPgaA, que posee la capacidad de interactuar con PgaB para afectar su actividad de translocación PNAG. Se confirmó mediante un estudio adicional de la interacción proteína-proteína entre el dominio TPR de PgaA y PgaB30. La otra posibilidad es que los residuos deficientes en el dominio BbPgaA TPR puedan conducir a que la estructura de la porina esté abierta para la translocación de PNAG38. El alineamiento de secuencias de AbPgaA (A1S-2162, 812 aa) y EcPgaA (807 aa) muestra un 55% de identidad de secuencia que indica el dominio TPR altamente conservado y la estructura de porina entre AbPgaA y EcPgaA. La estructura de modelado de AbPgaA que construye SWISS-MODEL con PDB 4y25 como plantilla muestra que la estructura de porina de AbPgaA posee varios residuos cargados negativamente (Fig. S9). Esta característica estructural es consistente con la hipótesis descrita en el estudio EcPgaA de que AbPgaA puede preferir translocar PNAG desacetilado que PNAG acetilado. Consideramos que la cepa deficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) en este estudio puede acumular PNAG en el periplasma, lo que impide que la colistina neutralice el LPS en la membrana citoplasmática y resulte en una mayor tolerancia a la colistina (Tabla 2 y Fig. 4).

Debido a la nefrotoxicidad y neurotoxicidad de la colistina, el uso de este fármaco antibacteriano se está volviendo raro. Sin embargo, la colistina todavía se considera un antibiótico de último recurso contra las bacterias gramnegativas, especialmente en la infección por patógenos MDR resistentes a carbapenem. Informes recientes reevaluaron el riesgo de los efectos secundarios de la colistina y demostraron su seguridad y alta eficacia contra la infección por patógenos gramnegativos multirresistentes39,40,41,42. El aumento de patógenos MDR resistentes a carbapenémicos clínicos aislados hace que la colistina sea un antibiótico de último recurso a considerar. En la actualidad, cada vez hay más heterorresistencias y fracasos terapéuticos en el tratamiento con colistina, por lo que es necesario identificar los mecanismos de resistencia a la colistina43,44,45. Los estudios actuales de resistencia a la colistina están involucrados en la investigación mediada por cromosomas y por plásmidos. La pérdida de regiones genómicas que contienen mrkC, mrkD, modA, modB, modC, modD y ppk, que participan en la producción de biopelículas, se observó en cepas de A. baumannii resistentes a la colistina46. Se informaron los genes mcr-1 y mcr-2 que median la resistencia a la colistina transmitida por plásmidos47,48. Los sistemas de dos componentes PmrA/PmrB y PhoP/PhoQ están asociados a la regulación de la modificación de LPS40,42. Estos informes demostraron que la mayoría de los mecanismos resistentes a la colistina se centran en la modificación de LPS y la producción de biopelículas mediada por ensamblaje de pili. En este estudio, descubrimos una nueva posibilidad de que A. baumannii supere a la colistina al obstaculizar el transporte de PNAG como componente básico de la biopelícula. Y de alguna manera, este fenotipo de A. baumannii podría convertirse en células tolerantes a la colistina que sobreviven cuando se estimulan con el antibiótico bactericida colistina.

En conclusión, la producción de biopelículas asociadas a PNAG estaba regulada por la PNAG desacetilasa, PgaB, que generalmente existía en A. baumannii. Hay dos copias de PgaB involucradas en la producción de biopelículas de A. baumannii. AbPgaB1 está regulado por fosforilo en el residuo Ser411 para modular el número de recambio de dPNAG y está directamente asociado con la producción de biopelículas. Tanto la determinación de MIC como los ensayos de eliminación de fármacos antibacterianos revelaron que la cepa de A. baumannii deficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) tiene una mayor tolerancia a los antibióticos colistina y tetraciclina que las cepas de tipo salvaje y otras cepas derivadas en este estudio. Dependiendo de la determinación de MIC durante 4 pasajes, consideramos que la cepa de A. baumannii deficiente en PgaB (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) se desencadenó para convertirse en células tolerantes a la colistina más fácilmente que otras durante el subcultivo de cuatro pasajes sin administración de ningún fármaco antibacteriano. Este estudio descubre un nuevo modelo fenotípico para determinar la transición de A. baumannii tolerante a la colistina. Debido a que la producción de PNAG puede diferir entre diferentes cepas de A. baumannii y, en algún momento, es posible que no contribuya a aumentar el nivel de producción de biopelículas entre todas las cepas clínicas. Este estudio podría proporcionar un posible mecanismo para determinar la resistencia a la colistina de A. baumannii en la práctica clínica.

Las secuencias de A1S-0938 y A1S-2161 se descargaron del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y sus números de acceso fueron ABO11370 y ABO12588, respectivamente. La identidad de la secuencia se analizó mediante la alineación de Needleman-Wunsch en NCBI. El polisacárido desacetilasa de las bacterias se alineó mediante ClustalW y el árbol filogenético se dibujó con base en el método de agrupamiento Neighbor-Joining utilizando Molecular Evolutionary Genetics Analysis versión 6.0 (MEGA6)49. Los otros números de acceso de las secuencias de proteínas utilizadas en este estudio son los siguientes: pgaB de E. coli (AWY89024), K. pneumonia (AUH99166), B. bronchiseptica (AUV49813), IcaB de S. aureus (AAD52057), S. epidermidis (AAZ78359), polisacárido desacetilasa de P. aeruginosa (AAG04906), L. monocytogenes (NP_463944), B. subtilis (API95827) y C. difficile (AYD08208). La región transmembrana de A1S-0938 (AbpgaB1) y A1S-2161 (AbpgaB2) fue predicha por la herramienta TransMembrane protein Re-Presentation in 2Dimensions' (TMRPres2D)31.

La cepa 15151 de A. baumannii se cultivó regularmente a 37 °C en medio LB con agitación. Para construir las cepas Ab de eliminación de pgaB, el fragmento contenía 600 pb corriente arriba de A1S_0938 (incluido el A1S_0937 de longitud completa y el promotor A1S_0938) y 1300 pb corriente abajo de A1S_0938 (que contenía A1S_0939 de longitud completa) y se definió como dpgaB1. El fragmento de dpgaB1 se clonó en el vector pK18mobsacB (ATCC87097™). A continuación, el plásmido construido se transformó en E. coli S17-1 para la conjugación con la cepa 15151 de A. baumannii. El dpgaB1 construido se integró en el cromosoma basándose en la recombinación homóloga con un gen resistente a la kanamicina como marcador de selección. Los mutantes knockout se seleccionaron cultivando las células en un medio que contenía sacarosa al 10 % sin tratamiento con antibióticos. Las cepas de Ab con doble deleción AbpgaB1 y AbpgaB2 siguieron una estrategia similar a la construcción del fragmento AbpgaB2 (A1S_2161) y el objetivo de conjugación fue la cepa Ab con deleción AbPgaB1 (ΔAbpgaB1). Para la complementación in-trans, el fragmento que albergaba los genes A1S_0938, A1S_0939 y A1S_0940 se clonó en el vector lanzadera pABCLIIc, derivado de pABYM250, para generar la cepa Ab del complemento AbpgaB1 (Δ + WT). Se generaron mutantes que imitaban AbPgaB1 fosforilada y no fosforilada mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando la cepa del complemento AbpgaB1 como plantilla. Para una mayor purificación en columna de afinidad, AbpgaB1 WT y sus mutantes derivados se subclonaron en el vector lanzadera pABCLIIa que consiste en LacI, LacO y 6 × His-tag fusionados en el C-terminal del objetivo.

Las cepas de A. baumannii (WT, ΔAbpgaB1 y ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) se cultivaron en un medio LB a 37 °C con agitación. En total, se cosechó 1 L de cultivos de cada cepa y se resuspendió en 50 mL de agua DI. Los extractos crudos de polisacárido extracelular (EPS) se resolvieron en agua DI y luego los cultivos suspendidos se incubaron a 100 °C con agua hervida dos veces durante 30 min. Después de enfriar a temperatura ambiente, la matriz insoluble se eliminó por centrifugación a 12.000 rpm durante 1 hora a 4 °C. Los extractos totales de EPS se precipitaron con una concentración final de etanol al 75 % a 4 °C durante la noche. Los precipitantes se recogieron mediante centrifugación a 12 000 rpm durante 1 hora a 4 °C y se resolvieron en tampón (Tris 25 mM, pH 8,0, MgCl2 5 mM, CaCl2 5 mM). Las muestras se trataron con DNase (Roche) y RNase (Sigma) a 37 °C durante 8 hy luego se trataron con proteinasa K (Bioscience) a 37 °C durante la noche para eliminar los ácidos nucleicos y las proteínas contaminados. Los extractos totales se incubaron en agua hervida a 100 °C durante 30 min para desnaturalizar todas las posibles proteínas restantes y luego se centrifugaron a 12 000 rpm durante 1 ha 4 °C. Los sobrenadantes se sometieron a diálisis en un volumen de 100 veces de agua DI mediante una membrana de 1 KDa a 4 °C. Las muestras se liofilizaron para su posterior análisis. Para cuantificar relativamente el nivel de acetilación de EPS, el EPS liofilizado se resolvió en D2O para el análisis de RMN de protones (Bruker UltraShield, 600 MHz/54 mm, imán superconductor de 14,1 Tesla).

La cepa 15151 de A. baumannii se cultivó periódicamente a 30 °C con una DO600 inicial de 0,1 en medio LB para la preparación de muestras de proteoma y fosfoproteoma. El cultivo se cosechó después de 6 h cuando la OD600 alcanzó 0,4, definida como la fase exponencial media de las células planctónicas en este estudio. Las células del biofilm se recolectaron después de 24 h de subcultivo, descartando el componente líquido y lavando los biofilms adheridos a la pared tres veces con PBS. Las células de la biopelícula se agitaron añadiendo PBS en los pocillos y agitando la microplaca durante 15 min. Los extractos totales de células planctónicas y de biopelícula se obtuvieron mediante sonicación. Las concentraciones de proteína se cuantificaron en base al ensayo de Bradford (Bio-Rad).

Se digirieron cinco miligramos de las proteínas extraídas utilizando tripsina (1:40 p/p) tanto en procedimientos basados en gel como sin gel51,52. Los péptidos trípticos se desalinizaron a través de SDB-XC StageTip para un análisis proteómico adicional. Los fosfopéptidos de células planctónicas y de biopelícula se enriquecieron con puntas HAMMOCK hechas a medida, preparadas con perlas de TiO2 de 0,5 mg (GL Sciences) empaquetadas en 10 μL C8-StageTips46. Los fosfopéptidos resultantes se liofilizaron para su posterior análisis mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas de ionización por electropulverización (LC-ESI-MS, Fusion) (Thermo Scientific). Los datos sin procesar de MS y MS/MS se analizaron utilizando el software MaxQuant (versión 1.5.1.2)50 basado en la base de datos de la cepa 1515153 de A. baumannii. La tasa de descubrimiento falso de los péptidos, proteínas y sitios de modificación se estableció en 0,1% y la puntuación MaxQuant mínima para los sitios de fosforilación fue de 40, con una probabilidad de localización de al menos el 75 %. La ontología génica de cada proteína identificada se anotó en base a la base de datos Uniprot (www.uniprot.org). Los datos de proteómica y fosfoproteómica de MS se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE54, con los identificadores de conjunto de datos PXD010140 y PXD010172, respectivamente.

La estructura proteica de AbPgaB1 en este estudio fue modelada por el software SWISS-MODEL con plantilla PDB: 4f9j. La estructura de modelado fue mostrada por PyMOL. Se consideró que la estructura de modelado podría proporcionar información fiable entre ligandos y proteínas. Las moléculas de boceto y los módulos de preparación de ligandos implementados en Discovery Studio 3.5 (Accelrys Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.) se emplearon para construir las estructuras moleculares de todos los compuestos. Los compuestos utilizados en el análisis de acoplamiento se prepararon en tres pasos: (1) las estructuras bidimensionales se convirtieron en estructuras tridimensionales, (2) se calcularon las cargas y (3) se agregaron átomos de H. Se utilizó el modelado molecular para reproducir la estructura compleja del complejo AbPgaB1-PNAG. Los residuos de AbPgaB1 V410, S411, K412, D413, L414, A422, G423, E424, H425, L426, W427, M428, G429, L431, R432, D444, T467, L468, S469, E472, W549 e Y550 se definieron como constituyentes. tintineo el sitio de unión en el acoplamiento flexible proteína-ligando, que se logró utilizando el programa de acoplamiento GOLD (Cambridge Crystallographic Data Center (CCDC), versión 5.1) con la función de puntuación GoldScore. Las cadenas laterales de los residuos del sitio de unión se configuraron para que fueran flexibles durante el análisis de acoplamiento. El tetrasacárido de N-acetilglucosamina construido, de energía minimizada, se acopló en el sitio de unión definido de acuerdo con la configuración de parámetros de acoplamiento modificada (número de operaciones = 1,600,000 y tamaño de población = 1000; se usaron configuraciones predeterminadas para los otros parámetros). Se analizó la orientación más probable y la posición de energía libre más favorable.

Una sola colonia de A. baumannii 15151 que porta el plásmido que permite la sobreexpresión de AbPgaB1 fusionado con la etiqueta His C-terminal se inoculó en el medio LB. Los cultivos de toda la noche se diluyeron en 1 L de medio LB nuevo en una proporción de 1:100 (v/v). La expresión de AbPgaB1 se indujo mediante la adición de IPTG 0,5 mM cuando la A600 de los cultivos alcanzó 0,7. Después de 12 h de incubación, las células se recolectaron y se rompieron utilizando un homogeneizador de alta presión (Nanolyzer) para obtener proteínas totales para una mayor purificación en una resina de afinidad cargada con níquel (GE Healthcare) de acuerdo con los procedimientos estándar. Las proteínas purificadas se concentraron usando un filtro centrífugo Amicon Ultra y su concentración se cuantificó en base a un ensayo de Bradford. Las proteínas purificadas se separaron mediante SDS-PAGE en un gel de acrilamida al 12 % (Tools, gel de gradiente HR, TFU-GG420).

En un estudio anterior, demostramos que el componente principal del exopolisacárido de la cepa SK17 de A. baumannii era PNAG parcialmente desacetilado (dPNAG), que se extrajo como sustrato de AbPgaB1. La actividad de N-acetilación de AbPgaB1 se realizó mediante ensayos de ninhidrina55. Brevemente, la mezcla de reacción de des-N-acetilación contenía NaCl 50 mM, CoCl2 10 μM y 0 ~ 4,0 mg de PNAG extraída/mL, preparada en tampón HEPES 50 mM (pH 7,5). La reacción (volumen de reacción final de 100 μL) se inició mediante la adición de AbPgaB1 o sus derivados. Después de una incubación de 1 h a 37 °C, la reacción finalizó con una incubación de 10 min a 100 °C. La coloración se logró incubando 50 μL de sobrenadante con 25 μL de ninhidrina (Sigma) a 100 °C durante 10 min. La mezcla se diluyó mediante la adición de 125 μL de etanol al 95 % y la cantidad de amina libre (glucosamina des-N-acetilada) se detectó midiendo la absorbancia a 570 nm seguido de una comparación con una curva estándar de glucosamina.

Los cultivos durante la noche se diluyeron en un medio LB que contenía glucosa al 1 % para obtener una DO600 inicial de 0,05. Después de 12 h de incubación a 30 °C con agitación de 180 rpm, la biopelícula resultante se lavó tres veces con agua. Para cuantificar la formación de biopelículas, las biopelículas adheridas a los pocillos de una placa de polipropileno de 96 pocillos se tiñeron con cristal violeta (CV) durante 20 min, se lavaron tres veces en agua y se solubilizaron con etanol al 95 % durante 10 min, y su absorbancia a 595 se determinó nm. Para la observación con microscopía electrónica de barrido (SEM), las biopelículas formadas en cubreobjetos en las mismas condiciones se fijaron en una solución de formaldehído al 2,5 %/glutaraldehído al 4 % y luego se deshidrataron.

Los cultivos de la noche a la mañana de las cepas de A. baumannii se diluyeron con caldo Mueller-Hinton fresco con una densidad óptica inicial de 0,005 a 600 nm. Los antibióticos se diluyeron en serie para su administración a las cepas Ab. Las células inoculadas con antibióticos diluidos en serie se incubaron a 37 °C durante 16 h. Después de la incubación, el lector de microplacas determinó la densidad óptica a 600 nm de los cultivos analizados. Durante varios pases de determinaciones de MIC, las cepas de Ab cultivadas durante la noche (16-20 h) se subtransfirieron con una proporción de 1:1000 en medio LB. La detección de MIC de P. aeruginosa ATCC 27.853 se realizó como control estándar en esta prueba.

Las concentraciones mínimas de erradicación del biofilm de A. baumannii ATCC15151 y sus cepas mutantes mediadas por AbpgaB1/AbpgaB2 se determinaron por protocolo56. Brevemente, los cultivos de toda la noche se diluyeron con caldo Mueller-Hinton a OD600 0,005. Cada cepa se cultivó en placas de 96 pocillos con tapa de clavija colocada en cada pocillo. Después de 24 h de incubación, las tapas de clavija con biopelícula de cada cepa se transfirieron a placas de 96 pocillos con caldo Mueller-Hinton que contenía solución antimicrobiana diluida dos veces. A continuación, las placas se incubaron durante 24 h para estimularlas con antibióticos. Luego, las tapas de clavija se colocaron en nuevas placas de 96 pocillos con caldo Mueller-Hinton fresco. Las células bacterianas incrustadas en biopelícula de cada cepa probada se liberarán en un medio nuevo después de sonicación de 1 minuto. Las placas de 96 pocillos se incubaron durante otras 24 h y luego se definió como MBEC la concentración más baja de antibióticos que impidió el crecimiento visible.

Para investigar las células de supervivencia cuando A. baumannii se trata con el fármaco bactericida colistina o el fármaco bacteriostático tetraciclina, los cultivos de tercera generación de cepas de A. baumannii se diluyeron a OD600 0,1 (107 CFU/mL) y OD600 0,01 (106 CFU/mL) para la administración de colistina y tetraciclina, respectivamente. Los cultivos de cepas Ab se trataron con 16,0, 32,0 o 64,0 μg/mL de colistina durante 1 hora para los ensayos de destrucción de colistina dependientes de la dosis. En el caso de la tetraciclina, los ensayos de muerte dependiente de la dosis se realizaron con 4,0, 8,0 o 16,0 μg/ml de tetraciclina. Después de 1 h de tratamiento, los cultivos se diluyeron diez veces en serie y luego se colocaron 2 μL en la placa de agar LB para otra incubación durante la noche a 37 °C. Los ensayos de muerte dependiente del tiempo se realizaron con 32,0 μg/mL de colistina o 8,0 μg/mL de administración de tetraciclina durante 4 h. Durante la estimulación con antibióticos, los cultivos se diluyeron diez veces en serie a las 0, 2 y 4 horas y se colocaron en una placa de agar LB para incubarlos durante la noche.

Para distinguir las células tolerantes a la colistina de las células heterorresistentes, la tercera generación de cepas Ab se diluyó a OD600 0,05 con MHB para la determinación de la curva de crecimiento. Las células de A. baumannii inoculadas se incubaron a 37 °C con agitación durante 2 hy luego se les administraron 16,0 μg/mL de colistina o tetraciclina durante otras 25 h de incubación. La condición de crecimiento sin antibióticos se determinó como control. La densidad óptica a 600 nm de cada cultivo Ab se detectó en varios momentos durante las 27 h de incubación.

La lista detallada de las fosfoproteínas y fosfopéptidos identificados en este estudio se proporcionó como Tabla S2. Los datos sin procesar de proteómica y fosfoproteómica de MS se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE, con los identificadores de conjuntos de datos PXD010140 y PXD010172, respectivamente. Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este manuscrito y sus archivos de información complementaria.

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Descargar referencias

Agradecemos a Yun-Ting Tseng y Chia-Yu Chen por su trabajo inicial en este proyecto. Estamos agradecidos por el apoyo de la tecnología SEM del Instituto de Ciencias Biomédicas, Academia Sínica.

Agradecemos el apoyo financiero del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST 110-2320-B-039-058) y la financiación de la Universidad Médica de China (CMU110-MF-98; CMU110-N-31).

Instituto de Graduados en Ciencias Biomédicas, Universidad Médica de China, Taichung, 404333, Taiwán

Shu Jung Lai

Centro de Investigación de Biología del Cáncer, Universidad Médica de China, Taichung, 404333, Taiwán

Shu Jung Lai

Instituto de Química Biológica, Academia Sinica, Taipei, 11529, Taiwán

I-Fan Tu y Shih-Hsiung Wu

Instituto de Biología Molecular, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, Taiwán

Tien-Sheng Tseng

Instituto de Fisiología Molecular, Laboratorio de la Bahía de Shenzhen, Shenzhen, 518132, China

Yu-Hsuan Tsai

Departamento de Química, Universidad Nacional de Taiwán, Taipei, 106, Taiwán

Shih-Hsiung Wu

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SJL y SHW concibieron y dirigieron la investigación. SJL diseñó el estudio de proteoma y fosfoproteoma de A. baumannii. SJL e IFT construyeron las cepas mutantes de A. baumannii. IFT y TST diseñaron y calcularon los análisis de la estructura de modelado. YHT calculado y análisis de los datos de RMN. SJL diseñó y realizó todos los demás experimentos (por ejemplo, análisis de secuencias, expresión y purificación de proteínas, ensayos de actividad, cuantificación de biopelículas, determinación de MIC, ensayos de eliminación de antibióticos y pruebas de crecimiento). Las figuras y los manuscritos fueron preparados por SJL. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Shu-Jung Lai o Shih-Hsiung Wu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Lai, SJ., Tu, IF., Tseng, TS. et al. La deficiencia de poli-β-1,6-N-acetil-glucosamina desacetilasa provoca que A. baumannii se convierta en células tolerantes a la colistina independientes del biofilm. Informe científico 13, 2800 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30065-5

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Recibido: 02 noviembre 2022

Aceptado: 15 febrero 2023

Publicado: 16 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30065-5

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