Enzima

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 312 (2023) Citar este artículo

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El piridoxal-5′-fosfato (PLP) es un cofactor versátil que ayuda en diferentes tipos de reacciones enzimáticas. También se ha informado que PLP reacciona con sustratos y cataliza algunas de estas reacciones independientemente de las enzimas. Una de estas reacciones catalíticas es la descomposición de la cisteína para producir sulfuro de hidrógeno (H2S) en presencia de iones metálicos multivalentes. Sin embargo, se desconoce la actividad catalítica independiente de enzimas de la PLP en la catabolización de cisteína en ausencia de iones multivalentes. En este estudio, mostramos que el PLP reacciona con la cisteína para formar un producto de tiazolidina, lo cual está respaldado por cálculos químicos cuánticos del espectro de absorción. La reacción de PLP con cisteína depende de la fuerza iónica y el pH. El producto de tiazolidina se descompone lentamente para producir H2S y el PLP se regenera a su forma activa con tiempos de reacción más prolongados (> 24 h), lo que sugiere que el PLP puede actuar como catalizador. Proponemos un mecanismo de reacción plausible independiente de enzimas para la descomposición de cisteína catalizada por PLP para producir H2S, que procede a través de la formación de intermediarios del anillo de tiazolidina que luego se hidroliza lentamente para regenerar el PLP. Este trabajo demuestra que el PLP cataliza la descomposición de la cisteína en ausencia de enzimas, bases e iones metálicos multivalentes para producir H2S.

Descubierto en 1942 por Snell et al. El piridoxal-5′-fosfato (PLP) es la forma metabólicamente activa de la vitamina B6. Es uno de los cofactores más versátiles para enzimas que catalizan multitud de reacciones con aminoácidos1. El PLP como cofactor se utiliza en casi el 4 % de todas las actividades enzimáticas2. Las enzimas dependientes de PLP catalizan transaminaciones, racemizaciones, descarboxilaciones, sustituciones y eliminaciones α, β y γ, transaldolaciones, condensaciones de Claisen y, más recientemente, desaminaciones oxidativas en presencia de aminoácidos3. Curiosamente, el PLP también puede catalizar algunas de estas reacciones de manera independiente de la enzima. Las transaminaciones, las sustituciones α, β y las descarboxilaciones con aminoácidos son catalizadas por PLP e iones metálicos multivalentes de forma no enzimática en soluciones acuosas4,5,6,7,8,9,10,11, aunque también se ha informado que proceden lentamente sin iones metálicos12. Por ejemplo, el PLP en ausencia de enzimas experimenta una transaminación lenta cuando se calienta con aminoácidos para producir piridoxamina4. Estos estudios concluyeron que el grupo aldehído de PLP actúa como el sitio activo y reacciona rápida y reversiblemente con los aminoácidos para formar bases de Schiff, que dependiendo de otras condiciones de reacción, reaccionan más para formar productos. Dado que la PLP genera estos productos independientemente de la enzima, es importante comprender la interacción directa de la PLP con los aminoácidos esenciales.

Aún no se ha explorado el papel catalítico independiente de enzimas del PLP en la reacción con cisteína en ausencia de iones metálicos multivalentes. Esto se debe a que se ha informado ampliamente que la reacción de PLP con cisteína forma un producto estable, un anillo de tiazolidina, a través de la condensación13,14,15,16,17. Los primeros estudios concluyeron que la formación del anillo de tiazolidina se produce en tres pasos: primero, la adición del grupo amina de la cisteína en el grupo aldehído del PLP, segundo, la eliminación del agua para formar una base aldimínica de Schiff y el tercer cierre del anillo (Fig. 1A) . Se informó que el anillo de tiazolidina es estable durante más de 24 h; sin embargo, no se informaron estudios más prolongados15. Alternativamente, el grupo tiol de la cisteína también puede reaccionar con el grupo aldehído del PLP para formar un hemimercaptal o un intermediario mercaptal17. Curiosamente, cuando los derivados de cisteína como S-(fenilo p-sustituido) cisteínas se hicieron reaccionar con PLP en condiciones ligeramente alcalinas, se someten a eliminaciones α, β para producir amoníaco, piruvato y análogos de S-(fenilo p-sustituido) y el PLP se regenera (Fig. 1B). Esto confirmó el papel catalítico de la PLP en la descomposición de la cisteína sustituida en S en condiciones ligeramente alcalinas18,19.

Mecanismo de reacción propuesto de interacción química independiente de enzimas de PLP con cisteína. (A) Mecanismo de formación del anillo de tiazolidina con PLP y cisteína en ausencia de una base y de iones metálicos. La formación de la base de Schiff es un paso intermedio. (B) Mecanismo para el comportamiento catalítico de PLP en reacción con cisteínas sustituidas en S en condiciones ligeramente alcalinas. El PLP se regenera produciendo análogos sustituidos en S, amoníaco y piruvato.

Recientemente, Hine et al. investigó el papel no enzimático del PLP en la descomposición de la cisteína para producir sulfuro de hidrógeno (H2S) en presencia de iones metálicos trivalentes9. El H2S endógeno se produce predominantemente a partir de cisteína y homocisteína por enzimas como la cistationina-β-sintasa (CBS), la cistationina-γ-liasa (CGL) y la 3-mercaptopiruvato azufre-transferasa (3-MST) con PLP como cofactor20. El H2S es un nutriente esencial para el cuerpo y las deficiencias en la producción de H2S enzimático endógeno o la actividad de CBS, CGL y 3-MST están asociadas con varios efectos perjudiciales para la salud, incluidos los trastornos neurodegenerativos21,22. Por lo tanto, la investigación del papel catalítico independiente de la enzima de la PLP en la descomposición de la cisteína se vuelve inminente para evaluar su capacidad para rescatar posibles deficiencias enzimáticas responsables de la progresión de los trastornos neurodegenerativos.

La literatura actual sobre el papel catalítico independiente de enzimas de la PLP en el metabolismo de la cisteína carece de investigación sobre esta interacción en condiciones fisiológicas. El papel catalítico de PLP en presencia de una base o iones metálicos multivalentes está bien establecido, sin embargo, el comportamiento catalítico dependiente del tiempo de PLP en ausencia de ambos debe determinarse para una comprensión holística de las interacciones de PLP con cisteína. Por lo tanto, en este estudio, investigamos las interacciones de PLP con cisteína en condiciones fisiológicas. Se utilizaron espectroscopia 1H-NMR y UV-Vis para controlar el progreso de la reacción. Se realizó una cromatografía en papel para controlar la evolución del producto gaseoso H2S. Se realizaron cálculos de química cuántica en los probables intermediarios para predecir su absorción UV-Vis y se compararon con datos experimentales.

En la literatura se plantean hipótesis sobre diferentes intermedios de la reacción de PLP con cisteína13,14,15,16,17, que incluyen la formación de una estructura de base de Schiff, hemimercaptal y tiazolidina de anillo cerrado (fig. 2A). Estos diferentes productos potenciales de PLP-Cys se investigaron mediante espectroscopia 1H-NMR y UV-Vis.

Espectro ampliado de 1H-NMR de mezcla de reacción molar 1:1 de PLP y (A) cisteína, (B) S-metilcisteína (SMC) y (C) N-acetilcisteína (NAC) en D2O reaccionado a 37 °C durante 2 h . La base de Schiff se forma con la reacción de PLP y SMC. El protón aldimínico de una base de Schiff se observa en δ ≈ 8 ppm. El hemimercaptal se forma con la reacción de PLP y NAC. El protón enólico del hemimercaptal se observa en δ ≈ 6,5 ppm. Se observa la presencia de base de Schiff, hemimercaptal y anillo de tiazolidina (δ = 6,05, 6,10 ppm) con reacción de PLP y cisteína.

En el caso de la espectroscopia 1H-NMR, se hizo reaccionar PLP y cisteína en agua deuterada (D2O) a 37 °C en una relación molar 1:1 durante 2 h. La versión ampliada del espectro 1H-NMR se muestra en la Fig. 2A (espectro completo en la Fig. S1). PLP exhibe tautomerismo de ceto-enol por encima de pH 5 a través de su resto de aldehído cuyo α-hidrógeno (4) se observa en δ = 10.4 ppm y el de la forma enol de PLP (4 ') se observa en δ = 6.45 ppm (Fig. S2 )23. PLP al reaccionar con cisteína presenta dos nuevos picos que aparecen en δ = 6.05 ppm y 6.10 ppm correspondientes al protón metino (z) de la mezcla racémica del anillo tiazolidínico formado con PLP y cisteína24. Se observó un tercer pico nuevo (x) a δ = 8,09 ppm que puede corresponder al protón aldimínico de la base de Schiff formado entre PLP y cisteína. No se observaron picos correspondientes a los productos intermedios cuando PLP y cisteína reaccionaron en una proporción molar de 1:10, en cambio, se observaron picos para el anillo de tiazolidina (Fig. S3). Para confirmar la posición del protón aldimínico y, por lo tanto, la formación de la base de Schiff, se hicieron reaccionar de manera similar PLP y S-metilcisteína (SMC), un análogo de cisteína que no tiene un tiol libre para el cierre del anillo. Esta reacción produjo un nuevo pico (x) en δ = 8,05 ppm que corresponde al protón aldimínico de la base de Schiff formado entre SMC y PLP (Fig. 2B, espectro completo en la Fig. S4). SMC y PLP forman una base de Schiff dentro de las 2 h del tiempo de reacción, como se observa por el cambio en el máximo de absorbancia en el espectro UV-Vis de la mezcla de reacción de 388 nm, transiciones típicamente atribuidas al grupo aldehído, a 401 nm (Fig. S5 ). Por lo tanto, el pico que aparece en δ ≈ 8 ppm para la reacción de PLP-cisteína se atribuye a la presencia de la estructura de base de Schiff. Alternativamente, la cisteína también puede reaccionar con el PLP a través de la formación de un hemimercaptal (Fig. 2A)17, lo cual es posible por la interacción del par de electrones solitarios en el azufre con el protón enólico del PLP. Se observó un pequeño pico de hombro (y) en δ = 6,49 ppm en la Fig. 2A, lo que sugiere la posibilidad de la formación de un hemimercaptal. Para confirmar la formación de un hemimercaptal, se hicieron reaccionar PLP y N-acetilcisteína (NAC), un análogo de cisteína que tiene tiol libre para la formación de hemimercaptal pero no una amina libre para formar la base de Schiff, y se observó un nuevo pico (y) en δ = 6,47 ppm que corresponde al protón enólico del hemimercaptal formado entre NAC y PLP (Fig. 2C, espectro completo en la Fig. S6). No se observó ningún cambio en la intensidad del pico de PLP a 388 nm en el espectro UV-Vis después de hacer reaccionar NAC y PLP durante 2 h (Fig. S7). Para asegurarse de que la amina secundaria de NAC no forma base de Schiff produciendo el nuevo pico a δ = 6,47 ppm, se hicieron reaccionar PLP y N-acetilmetionina (NAM), un análogo de cisteína sin amina libre o tiol, y no se observaron nuevos picos después de la reacción. 2 h de reacción confirmando la posición del protón hemimercaptal en δ ≈ 6.47 ppm (Fig. S8). Con base en estas observaciones, podemos proponer que la reacción de cisteína y PLP en agua da como resultado la formación de los tres productos: estructura de anillo de tiazolidina, base de Schiff y hemimercaptal.

La interacción de PLP con cisteína en condiciones fisiológicas de fuerza iónica y temperatura se determinó con espectroscopía de absorción. El PLP y la cisteína se hicieron reaccionar en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 °C durante 2 h. Para determinar los posibles productos de reacción de los experimentos, se calculó computacionalmente el espectro UV-Vis para los productos potenciales (coordenadas xyz para estructuras en la Fig. S9) con la teoría funcional de la densidad híbrida.

El espectro de absorción PLP calculado (Fig. 3A) se caracteriza por una fuerte respuesta óptica en el rango UV con picos dominantes a 228 nm y 392 nm. Aparecen picos menos intensos a 205 nm y 250 nm. Se calcula que la transición HOMO-LUMO para PLP es de 2,33 eV o 532 nm correspondiente a una transferencia de densidad electrónica del grupo fosfato al grupo aromático (Fig. S10A). En el pico de interés (392 nm), los orbitales de transición naturales muestran la redistribución de los estados de densidad electrónica en el grupo aromático (Fig. 3A). El espectro experimental para la solución de PLP en PBS exhibe dos picos dominantes a 225 nm y 388 nm, lo que coincide bien con el espectro calculado (Fig. 3A). El espectro experimental también tiene un pico de hombro a 328 nm, que está ausente en el espectro calculado. Este pico adicional podría atribuirse a estados de equilibrio zwitteriónico adicionales de PLP25,26,27 Además del pico del hombro, el espectro experimental se reproduce bien en los cálculos. Dado que PLP puede exhibir tautomerismo ceto-enol a través de su fracción aldehído por encima de pH 5, también se calculó el espectro UV-Vis para la forma enol de PLP (Fig. S11). El espectro calculado tiene picos dominantes a 451 nm, 290 nm y 223 nm. Los picos calculados no coinciden con los datos experimentales y, por lo tanto, sugieren que el PLP existe solo como una forma de aldehído en condiciones fisiológicas de fuerza iónica y temperatura.

Comparación de espectros de absorción experimentales (líneas continuas) y calculados (líneas azules discontinuas) para (A) PLP, (B) PLP-cisteína base de Schiff y (C) estructuras de anillo de tiazolidina PLP-cisteína. El lado izquierdo de cada panel muestra la estructura molecular y el lado derecho de cada panel muestra los orbitales de transición naturales en el pico de interés. El espectro experimental de PLP coincide bien con el espectro calculado. El espectro experimental de la reacción de PLP-cisteína después de 2 h en PBS coincide con la formación de la estructura de tiazolidina y no con la base de Schiff.

El espectro de absorción calculado para la base PLP-Cys Schiff (Fig. 3B) muestra picos dominantes a 441 nm y 387 nm, que juntos producen un pico gaussiano a 428 nm. Varios picos menos intensos en el rango de 201 a 262 nm mejoran el amplio pico gaussiano en 203 nm. Se calcula que la transición HOMO-LUMO para la estructura de la base PLP-Cys Schiff es de 1,46 eV o 849 nm correspondiente a una transferencia de densidad electrónica del grupo fosfato al grupo aromático y la cisteína conectada a la base de Schiff (Fig. S10B). En el pico de interés (441 nm), los orbitales de transición naturales muestran la redistribución de los estados de densidad de electrones en el grupo aromático, así como la transferencia del grupo de ácido carboxílico a la estructura de aldimina (Fig. 3B). De manera similar, el espectro de absorción calculado para la estructura de tiazolidina PLP-Cys (Fig. 3C) exhibe picos dominantes a 333 nm y 212 nm. Varios picos menos intensos en el rango de 204 a 220 nm mejoran el amplio pico gaussiano a 210 nm. Se calcula que la transición HOMO-LUMO para la estructura de tiazolidina PLP-Cys es de 2,49 eV o 497 nm correspondiente a una transferencia de densidad electrónica del grupo fosfato a los grupos aromático y tiofeno (Fig. S10C). En el pico de interés (333 nm), los orbitales de transición naturales muestran la redistribución de los estados de densidad de electrones en el grupo aromático, así como la transferencia al grupo tiofeno (Fig. 3C).

El espectro experimental para la mezcla de cisteína PLP en PBS muestra un pico amplio a 203 nm con un pico de hombro a 220 nm y un segundo pico dominante a 333 nm con un pico de hombro a 294 nm. La presencia de un pico a 333 nm y la ausencia de absorción por encima de 400 nm sugiere que el PLP y la cisteína no forman una base de Schiff o que la base de Schiff es inestable y se cicla rápidamente para formar el anillo17. Curiosamente, los datos experimentales coinciden con el espectro de absorción de tiazolidina PLP-Cys calculado. El pico de hombro a 294 nm no se predice y podría atribuirse a estados de equilibrio zwitteriónico desplazados de PLP.

Los resultados de la espectroscopia de 1H-NMR y UV-Vis junto con los espectros de absorción calculados confirman la presencia del anillo de tiazolidina con la reacción de PLP-Cys. De manera similar, la formación de hemimercaptal está respaldada por espectroscopía de 1H-NMR. Sin embargo, es interesante notar que la estructura aldimínica de la base de Schiff se observa con la espectroscopia de RMN donde el solvente era D2O, pero no con la espectroscopia UV-Vis donde el solvente era PBS. Esto podría deberse a las diferencias en la concentración de los reactivos, la fuerza iónica del solvente o el pH bajo el cual la base de Schiff es inestable y se cicla rápidamente para formar el anillo de tiazolidina17. Se emplearon diferentes concentraciones de PLP porque una concentración de PLP por debajo de 10 mM no es detectable en el espectro de 1H-RMN, y una concentración por encima de 0,1 mM saturó la señal UV-Vis a 388 nm, que es el pico de interés. Para verificar la formación de diferentes intermedios entre PLP y cisteína, las mezclas de reacción de PLP y cisteína en agua desionizada y PBS se analizaron con LC/MS. Se observó una abundancia muy baja de iones intermedios de masas consistentes con la base de PLP-Cys Schiff, el anillo de tiazolidina y el hemimercaptal (Fig. S12). La señal para la base de PLP-Cys Schiff no fue significativamente mayor que la del control. Aunque la presencia de estos intermediarios es consistente con la espectroscopía de RMN y UV-Vis, se debe tener en cuenta que las señales de LC/MS detectadas no fueron lo suficientemente fuertes para confirmar la formación de estos intermediarios. Los intermedios pueden no ser estables en la columna o fase gaseosa durante el análisis MS, especialmente porque la fase móvil era ácida: 0,1 % de ácido fórmico (95 % en agua y 5 % en acetonitrilo).

La interacción dependiente del tiempo de PLP con cisteína se estudió mediante espectroscopia UV-Vis. Se hicieron reaccionar PLP y cisteína en PBS a 37 °C en una relación molar de 1:10 durante 14 días. Se obtuvo su espectro de absorbancia para monitorear la reacción (Fig. 4A). El espectro de absorbancia para PLP a pH = 7,2 muestra un máximo a 388 nm como se discutió anteriormente28. Después de la adición de cisteína, la absorción a 388 nm disminuye inmediatamente sugiriendo la formación de estructuras de hemimercaptal y tiazolidina17. Este pico desaparece por completo en 2 h, lo que sugiere que el grupo aldehído de PLP ha reaccionado completamente con la cisteína y ha formado un anillo de tiazolidina con un aumento máximo observado a 333 nm. El espectro UV-Vis muestra la misma tendencia hasta las 24 h de tiempo de reacción con mayor absorción para el anillo de tiazolidina, lo cual está de acuerdo con la literatura15. Sin embargo, a las 24 ha aparece un pequeño pico a 388 nm, correspondiente al grupo aldehído de PLP. La intensidad del pico a 388 nm aumenta con el tiempo (7 y 14 días) con una disminución concomitante del pico de tiazolidina a 333 nm. Esta inversión sugiere que el anillo de tiazolidina se está convirtiendo de nuevo a su forma PLP. Se observaron análogos de S-(fenilo p-sustituido) como subproducto cuando las S-(fenilo p-sustituido) cisteínas se hicieron reaccionar con PLP en condiciones ligeramente alcalinas regenerando el PLP18. Por lo tanto, proponemos que PLP funcione como un catalizador débil para catabolizar cisteína en ausencia de iones metálicos para formar sulfuro de hidrógeno (H2S).

(A) Espectro UV-Vis de la interacción química entre PLP y cisteína en condiciones fisiológicas monitoreadas a las 0 h, 2 h, 24 h y 14 días. (B) Producción de H2S a partir de la reacción de PLP y cisteína en agua DI, componentes individuales de PBS y PBS a 37 °C y 24 h. La producción de H2S es 9 veces mayor en PBS que en agua DI.

Para verificar la capacidad de PLP para catalizar la descomposición de cisteína para producir H2S, realizamos una cromatografía en papel (ensayo de acetato de plomo) para detectar la producción de gas H2S como uno de los subproductos. Cabe señalar que menos del 20% del H2S producido está en fase gaseosa a pH fisiológico29,30. La reacción de PLP y cisteína en condiciones fisiológicas en PBS generó H2S casi 70 µM en 24 h (Fig. 4B). No se observó producción de H2S en ausencia de PLP (Fig. S13A). Curiosamente, la evolución de H2S fue de 8,8 µM cuando la reacción se realizó en agua desionizada (DI) (Fig. 4B). El PBS tiene un pH de 7,4 y está compuesto por cloruro de sodio (NaCl) 137 mM, cloruro de potasio (KCl) 2,7 mM, fosfato de hidrógeno disódico 8 mM (Na2HPO4) y fosfato dihidrógeno de potasio 2 mM (KH2PO4). La reacción de PLP y cisteína en presencia de cada una de las sales generó individualmente casi 7,6 µM H2S con 137 mM NaCl, 58,9 µM H2S con 8 mM Na2HPO4 y 11,1 µM H2S con 2 mM KH2PO4, en 24 h. Estos resultados sugieren que la presencia de Na2HPO4 en PBS es un importante contribuyente a la producción de H2S. Puede deberse a que el Na2HPO4 en agua es moderadamente básico (pH 8,86) y libera un ion hidróxido que forma ácido fosfórico. El ion hidróxido liberado puede actuar como una base al extraer el protón α de la base PLP-Cys Schiff (discutido en la Fig. 5) y empujar la reacción hacia adelante para producir H2S. Dado que la descomposición de cisteína catalizada por PLP se acelera en medio básico18, se espera que la producción de H2S aumente en presencia de condiciones ligeramente alcalinas. Además, la solución de PLP en condiciones alcalinas exhibe un color amarillo más intenso como se ve con la solución de PLP en PBS en comparación con la solución de PLP en agua DI (Fig. S13B)28.

Mecanismo de reacción plausible propuesto para la degradación de cisteína catalizada por PLP independiente de enzimas para producir H2S en condiciones fisiológicas en ausencia de metal.

Después de 14 días de tiempo de reacción, el pico de absorbancia del grupo tiazolidina a 333 nm disminuye y el del grupo aldehído a 388 nm aumenta proporcionalmente. Esto sugiere que el PLP, además de producir H2S en condiciones fisiológicas, es capaz de regenerarse lentamente para comportarse como un catalizador. Estos resultados demuestran que el PLP puede funcionar como un catalizador para la descomposición de la cisteína para producir H2S en condiciones fisiológicas. Lo que es más importante, mostramos, por primera vez, que el PLP cataliza la descomposición de la cisteína en ausencia de (i) enzimas, (ii) bases y (iii) iones metálicos para producir H2S.

Con base en nuestros resultados y la literatura, proponemos un mecanismo de reacción plausible para la ruptura de cisteína catalizada por PLP en PBS para producir H2S como se presenta en la Fig. 5. Dado que la reacción de PLP y cisteína se completa en 2 h para formar un anillo de tiazolidina, el La vía de producción de H2S debe proceder a través del mecanismo de apertura del anillo. En ausencia de enzimas, bases e iones metálicos, el anillo de tiazolidina puede abrirse por hidrólisis (Fig. S14)31. Como se presenta en la Fig. 5, la hidrólisis del anillo puede proceder mediante el ataque del agua sobre el grupo de nitrógeno cargado positivamente de I para generar el ion hidronio que ataca el azufre en el anillo de II, lo que hace que el anillo se abra y probablemente forme una base de Schiff. tercero Dado que la base de Schiff es muy inestable17, las moléculas de agua o las bases débiles pueden extraer el protón α del metino activado de la cisteína de III y generar iones hidronio y una estructura quinonoide IV. Esta estructura quinonoide puede luego estabilizarse mediante la eliminación β del grupo tiol para formar V y generar H2S. La estructura formada V puede luego descomponerse para formar amoníaco y piruvato para regenerar el PLP VI. Estos productos intermedios o subproductos de reacción no se observaron con la espectroscopia 1H-NMR o UV-Vis y requerirán más investigación.

Hemos demostrado por primera vez que PLP catalizó la descomposición de cisteína en ausencia de (i) enzimas, (ii) bases y (iii) iones metálicos para producir H2S en condiciones fisiológicas. PLP reacciona completamente con la cisteína para formar un anillo de tiazolidina dentro de las 2 h de la reacción. La formación de anillos se observó con espectroscopía de 1H-NMR y UV-Vis. Los espectros UV-Vis obtenidos computacionalmente ayudaron a confirmar la formación de la estructura del anillo de tiazolidina entre el PLP y la cisteína. La observación directa de la base de Schiff y la formación de hemimercaptal entre cisteína y PLP no se ha informado previamente. El anillo de tiazolidina se descompone lentamente para generar H2S 70 µM en 24 h. Curiosamente, se produjo menos H2S (8,8 µM) en agua desionizada, lo que sugiere un papel dominante de la fuerza iónica y el pH. Más allá de las 24 h, se observa evidencia de regeneración de PLP con espectroscopia UV-Vis. Esto sugirió que el PLP, además de producir H2S en condiciones fisiológicas, es capaz de regenerarse lentamente para comportarse como un catalizador. Sobre la base de la evidencia espectroscópica y computacional proporcionada, se propuso un mecanismo de reacción plausible para la catálisis PLP. Esta investigación química de la catálisis PLP independiente de enzimas es importante debido a su relevancia biológica en la producción de H2S, que es un nutriente esencial para el cuerpo y su deficiencia endógena está asociada con varios efectos perjudiciales para la salud.

El hidrato de piridoxal-5′-fosfato (PLP), la L-cisteína (Cys), el fosfato de hidrógeno disódico (Na2HPO4) y el fosfato de dihidrógeno de potasio (KH2PO4) se obtuvieron de Alfa Aesar (MA, EE. UU.). El óxido de deuterio (D2O), la N-acetilcisteína (NAC), la N-acetilmetionina (NAM), el cloruro de sodio (NaCl) y el trihidrato de acetato de plomo (II) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (MO, EE. UU.). La S-metilcisteína (SMC) se obtuvo de TCI America (OR, EE. UU.). Todos los químicos fueron usados ​​sin purificación adicional.

Espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) Se mezclaron PLP 20 mM y Cys 20 mM en D2O en un tubo de RMN y se colocaron en una incubadora a 37 °C. Se usó espectroscopía de 1H-NMR para monitorear los productos de reacción. Se utilizó un espectrómetro Bruker de 400 MHz (MA, EE. UU.) para registrar los espectros de 1H-NMR en D2O con 16 escaneos. Se realizó un experimento similar usando PLP 20 mM y SMC 20 mM, NAC 20 mM, NAM 20 mM respectivamente para monitorear sus productos de reacción.

Espectroscopia UV-Vis Se mezclaron PLP 0,1 mM y Cys 1 mM en PBS (pH = 7,2) precalentados a 37 °C en una cubeta de cuarzo. El espectro de absorción del estado fundamental de los productos de reacción se obtuvo con un espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 1050 UV-Vis-NIR (Waltham, MA) y un portacubetas de temperatura controlada a 37 °C.

Ensayo de cromatografía en papel para la medición de H2S Se hicieron reaccionar PLP 1 mM y Cys 10 mM en agua DI en una placa de polipropileno de 96 pocillos en una incubadora a 37 °C durante 24 h. Se realizó un experimento similar con reactivos preparados en NaCl 137 mM, Na2HPO4 8 mM, KHPO4 2 mM y PBS. El H2S gaseoso que se desprendió de la reacción se cuantificó usando un ensayo de papel de acetato de plomo. El ensayo de papel de acetato de plomo y su análisis se realizaron como se informó anteriormente32.

Estudio computacional sobre interacciones PLP-cisteína Todos los cálculos para este estudio se realizaron con el código 2018-R1 del Sistema de Estructura Electrónica Molecular y Atómica General (GAMESS) usando la teoría del funcional de la densidad (DFT) y el funcional híbrido B3LYP34,35,36,37. Para todos los cálculos se empleó un modelo continuo polarizable estándar (PCM) con agua como disolvente. Las coordenadas cartesianas iniciales de las moléculas se obtuvieron con Avogadro (una herramienta de visualización y construcción molecular de código abierto)38 y las estructuras moleculares del estado fundamental se optimizaron con un conjunto de bases 6-311G(d, p). Los cálculos de la teoría funcional de densidad dependiente del tiempo (TDDFT) para las moléculas optimizadas de geometría se ejecutaron con funciones de onda Hartree-Fock (RHF) restringidas de capa cerrada. Los orbitales de transición naturales, así como los espectros que presentan la fuerza del oscilador en función de la longitud de onda (energía de excitación) y la curva obtenida por un ensanchamiento gaussiano (con un ancho completo de media altura de 0,08 eV), se adquirieron con el software Chemissian.

Cromatografía líquida-espectroscopia de masas La cromatografía líquida-espectroscopia de masas (LC-MS) se llevó a cabo en las instalaciones centrales de Proteómica y Metabolómica del Instituto de Investigación Lerner. La metabolómica no dirigida mediante cromatografía de fase inversa se realizó inyectando 4 µL de cada muestra en una columna Thermo Accucore Vanquish C18 con dimensiones de 100 × 2,1 mm, tamaño de partícula de 1,5 µm (Thermo P/N 27101‐102130) a 60 °C acoplada a un Thermo Vanquish UHPLC mediante elución en gradiente donde la fase móvil A es ácido fórmico al 0,1 % en agua y la fase móvil B es ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo. El Orbitrap Q Exactive HF se operó en modos de ionización por electropulverización positiva y negativa en diferentes ejecuciones de LC-MS en un rango de masas de 56–850 Da utilizando monitoreo de iones seleccionados (t-SIM) con MS1 ​​a una resolución de 120 000.

Los autores declaran que todos los demás datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y en la información complementaria.

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Los autores agradecen el apoyo financiero de la Fundación de la Familia Puzzitelio, la Fundación de la Familia Barney, el Centro de Nanomedicina Transformativa y los fondos iniciales del Instituto de Investigación Lerner. CC fue apoyado en parte por el apoyo de investigación de pregrado y esfuerzos creativos de la Universidad Case Western Reserve. Los autores agradecen a la Dra. Belinda Willard y Rebecca Williams del Metabolomic Core of Cleveland Clinic por el análisis LC-MS de las mezclas de PLP y cisteína. Los autores también agradecen a Alan Chen por preparar muestras para el análisis LC-MS. Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este documento pertenecen a los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de las agencias de financiamiento.

Departamento de Ingeniería Biomédica, Instituto de Investigación Lerner, Clínica Cleveland, Cleveland, OH, 44195, EE. UU.

Prajakatta Mulay, Cindy Chen y Vijay Krishna

Departamento de Ingeniería Biomédica, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, 44106, EE. UU.

vijay krishna

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PM, CC y VK concibieron la idea y diseñaron los experimentos y analizaron los datos. CC y PM realizaron los experimentos de espectroscopia UV-Vis y acetato de plomo/sulfuro de plomo. PM llevó a cabo los experimentos y análisis de RMN. VK llevó a cabo los cálculos químicos cuánticos. PM, CC y VK escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Vijay Krishna.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mulay, P., Chen, C. y Krishna, V. Catabolismo de cisteína independiente de enzimas con piridoxal-5′-fosfato. Informe científico 13, 312 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26966-6

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Recibido: 05 Agosto 2022

Aceptado: 22 de diciembre de 2022

Publicado: 06 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26966-6

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