Producción heteróloga de la D - Coastwise Ventures Group Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8551 (2023) Citar este artículo

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La tuberculosis (TB) es la segunda causa principal de muerte por una sola enfermedad infecciosa detrás de COVID-19. A pesar de un siglo de esfuerzos, la vacuna actual contra la TB no previene eficazmente la TB pulmonar, promueve la inmunidad colectiva ni previene la transmisión. Por lo tanto, se necesitan enfoques alternativos. Buscamos desarrollar una terapia celular que produzca un antibiótico efectivo en respuesta a la infección de TB. La D-cicloserina (D-CS) es un antibiótico de segunda línea para la TB que inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana. Hemos determinado que D-CS es el candidato óptimo para la terapia celular antituberculosa debido a su eficacia contra la tuberculosis, su ruta biosintética relativamente corta y su baja incidencia de resistencia. El primer paso comprometido hacia la síntesis de D-CS está catalizado por la L-serina-O-acetiltransferasa (DcsE) que convierte la L-serina y la acetil-CoA en O-acetil-L-serina (L-OAS). Para probar si la vía D-CS podría ser una profilaxis eficaz para la TB, nos esforzamos por expresar DcsE funcional en células A549 como un modelo pulmonar humano. Observamos la expresión de DcsE-FLAG-GFP mediante microscopía de fluorescencia. DcsE purificado de células A549 catalizó la síntesis de L-OAS según lo observado por HPLC-MS. Por lo tanto, las células humanas sintetizan DcsE funcional capaz de convertir L-serina y acetil-CoA en L-OAS, lo que demuestra el primer paso hacia la producción de D-CS en células humanas.

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa principalmente respiratoria causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis (Mtb)1. La TB sigue siendo una de las principales causas de muerte por una enfermedad transmisible en todo el mundo, infectando a 10 millones de personas y matando a 1,5 millones de personas en 20212. El actual La vacuna Bacillus Calmette-Guérin (BCG) para la TB tiene tasas de protección variables para la TB pulmonar que no duran hasta la edad adulta y pueden provocar efectos adversos (para una revisión, consulte la ref. 3). Se desarrollaron otros intentos de vacunas, como la vacuna MVA85A, para complementar la BCG, pero fracasaron en los ensayos de fase IIIb, por lo que la profilaxis de la TB sigue siendo difícil de alcanzar4.

El desarrollo de una profilaxis eficaz contra la TB presenta una importante oportunidad para enfoques alternativos. La exitosa historia de la quimioprofilaxis y las terapias génicas emergentes han sentado las bases para la posibilidad de desarrollar una profilaxis genética que produzca un antibiótico en células humanas (quimioprofilaxis genética). La isoniazida se ha utilizado como quimioprofilaxis que disminuye las probabilidades de desarrollar TB en un 40% durante 2 o más años5. Recientemente se ha descubierto que las terapias génicas son eficaces contra el cáncer. La terapia de células T con receptor de antígeno quimérico (CAR-T) modifica genéticamente las células T para incluir un receptor de antígeno quimérico. Esto ayuda a las células T a atacar las células cancerosas, específicamente la leucemia linfoblástica aguda y los linfomas de células B grandes6. En un ensayo clínico que inscribió a niños con leucemia linfoblástica aguda B para tratamientos con CAR T-22, 17 de 20 participantes lograron al menos un año de remisión7. Después de que la terapia CAR-T demostrara que es posible modificar genéticamente las células para atacar las células cancerosas, se desarrollaron numerosos métodos alternativos de administración y terapias basadas en células8. Debido a la efectividad de la quimioprofilaxis y la aparición de la terapia génica, buscamos explorar la viabilidad de una quimioprofilaxis genética que produzca un antibiótico para prevenir la TB.

Después de evaluar todos los antibióticos de TB de primera y segunda línea, seleccionamos la vía biosintética de D-cicloserina (D-CS) como un candidato óptimo para la quimioprofilaxis genética. En este estudio, nos enfocamos en la primera enzima en la vía biosintética, L-serina-O-acetiltransferasa (DcsE), que produce O-acetil-L-serina (L-OAS) a partir de L-serina y acetil-CoA9 (Fig. . 1). Intentamos probar si DcsE funcional podría expresarse en células A549, un modelo de células pulmonares humanas de tipo II10. Transfectamos DcsE etiquetados con FLAG y proteína fluorescente verde (GFP) en células A549 y observamos una producción de alto nivel de DcsE-FLAG-GFP mediante microscopía de fluorescencia. Observamos la síntesis in vitro de L-OAS específicamente mediante DcsE purificada mediante HPLC-MS. Proporcionamos evidencia de que DcsE funcional se puede sintetizar en células humanas como un primer paso para la síntesis profiláctica de D-CS.

Vía biosintética para D-CS9,14. Reacción en caja catalizada por DcsE. La D-cicloserina se puede producir biosintéticamente utilizando seis enzimas, DcsA-G, (en negrita) y reactivos biológicamente disponibles: L-serina, L-arginina y acetil-CoA12.

Para identificar el antibiótico óptimo para la síntesis en células humanas, seleccionamos antibióticos de TB conocidos con perfiles de resistencia bajos, vías biosintéticas cortas y precursores presentes en células humanas. Limitamos nuestra búsqueda a los doce fármacos antituberculosos de primera y segunda línea, dada su conocida eficacia frente a la TB (tabla 1). Se excluyeron los quimioterapéuticos y los antibióticos semisintéticos que no se podían producir biosintéticamente (Tabla 1). Por ejemplo, la isoniazida se produce mediante síntesis orgánica y no existe una vía biosintética conocida para su producción11. Asimismo, el compuesto semisintético amikacina se deriva de la kanamicina A a través de una reacción de acilación con ácido L-(-)-4-amino-2-hidroxibutírico que no se detecta en el metaboloma humano12. Por lo tanto, debido a que la amikacina no se puede producir biosintéticamente sin la síntesis adicional de ácido L-(-)-4-amino-2-hidroxibutírico, se excluye. De las doce terapias de primera y segunda línea, solo la capreomicina IA/IB, D-CS, la kanamicina A, la estreptomicina y la rifamicina SV pudieron producirse en células humanas porque sus precursores estaban presentes en las células humanas y sus vías son totalmente biosintéticas. Entre esas rutas, D-CS es la ruta más corta que requiere solo seis pasos para la síntesis (Tabla 1). Por el contrario, la capreomicina IA/IB requiere catorce pasos, la kanamicina requiere ocho pasos, la estreptomicina requiere veinticinco pasos y la rifamicina SV requiere veintisiete pasos. D-CS es un antibiótico de segunda línea capaz de tratar la TB multirresistente y es producido por varias especies de Streptomyces13. S. lavendulae produce D-CS usando L-serina, acetil-CoA, L-arginina y seis enzimas codificadas por DcsABCDEG (Fig. 1). Esta ruta biosintética se ha reproducido heterólogamente en Escherichia coli y se demostró que sintetiza concentraciones micromolares de D-CS14. Además, D-CS inhibe dos enzimas esenciales para la síntesis de la pared celular bacteriana, la alanina racemasa y la D-alanil-D-alanina ligasa15, lo que contribuye a la baja incidencia de resistencia a D-CS16. Debido a que D-CS se sintetiza en una ruta relativamente corta, los precursores están presentes en las células humanas y existe una baja incidencia de resistencia 16, la ruta D-CS es óptima para la quimioprofilaxis genética propuesta.

Intentamos probar si DcsE, la primera enzima de la vía biosintética de S. lavendulae D-CS, es funcional cuando se sintetiza en células humanas. Para expresar DcsE-FLAG-GFP en células de pulmón humano (A549), transfectamos las células con ADN plasmídico que contenía DcsE-FLAG-GFP o FLAG-GFP como control negativo. La fluorescencia de GFP se puede utilizar como una medida de si se expresa DcsE y su ubicación dentro de la célula. Después de doce horas de transfección, observamos fluorescencia difusa de GFP en las células transfectadas con FLAG-GFP (Fig. 2a). Por el contrario, observamos tanto la fluorescencia difusa de GFP como los puntos en las células transfectadas con DcsE-FLAG-GFP (Fig. 2b). En base a estas observaciones, concluimos que DcsE-FLAG-GFP se expresa en células A549.

Las células A549 expresan FLAG-GFP y DcsE marcadas con FLAG y GFP. ( a ) GFP en células A549 transfectadas con FLAG-GFP (control negativo) indica expresión de GFP-FLAG y proteína más difundida. ( b ) GFP en células A549 transfectadas con DcsE-FLAG-GFP indica una expresión más punteada de DcsE-FLAG-GFP. Microscopía óptica (LM), Proteína Verde Fluorescente (GFP). La barra de escala es de 100 µm.

Desarrollamos un método para detectar L-OAS y los reactivos en un tampón de reacción adecuado para DcsE usando HPLC-MS/MS. Observamos tiempos de retención específicos para L-serina a 0,9 min (Fig. 3a), L-OAS a 1,1 min (Fig. 3b) y acetil CoA (Fig. S1) con masas que corresponden a L-serina y L-OAS (Figs. 3c-f). Un ion original de un estándar de L-serina produjo una masa de 106,049 m/z y se fragmenta en una masa de 88,0396 m/z, lo que es consistente con la pérdida de un grupo de alcohol (Fig. 3e). Un ion original de un estándar L-OAS arrojó una masa de 148,06 m/z con tres iones de fragmento de 130,05 m/z (de acuerdo con la pérdida de un grupo de alcohol de L-OAS), 106,049 m/z (de acuerdo con la pérdida del grupo acetilo en L-OAS), y 88,0396 m/z (consistente con la pérdida de un grupo alcohol de la serina desacetilada; Fig. 3f).

Tiempos de retención, resultados de MS, MSMS y curvas estándar para L-serina y L-OAS en tampón de reacción mediante HPLC-MS. ( a ) Cromatograma de HPLC que muestra el tiempo de retención frente a los recuentos para L-serina 500 µM (0,9 min). (b) Cromatograma de HPLC de un estándar L-OAS puro de 125 µM. L-OAS (negro) y la fragmentación de L-OAS a L-serina (rojo) aparecen en el tiempo de retención de 1,1 min. ( c ) Pico de modo positivo ESI-TOF para L-serina 106,05 m / z (peso molecular (MW) de L-serina 105,09). ( d ) Pico de modo positivo ESI-TOF para L-OAS 148.0581 m / z (MW de L-OAS 147.13) y L-OAS fragmentado a L-serina 106.0499 m / z. (e) Tandem MS para L-serina a 5 V muestra un solo fragmento de 88,0396 m/z y L-serina intacta a 106,0499 m/z. (f) Tandem MS para L-OAS a 5 V muestra fragmentos de 88,0396, 106,0499, 130,0500 y L-OAS intacto a 148,0602 m/z. ( g ) Relación lineal entre el área máxima de L-OAS de la curva estándar y el área máxima de L-OAS fragmentada a L-serina. ( h ) Curva estándar de L-OAS (concentraciones que van desde 1 mM a 7,8 µM). El esquema químico insertado muestra la fragmentación consistente con los iones de fragmento observados.

Un estándar de L-serina pura revela solo una masa de L-serina a los 0,9 min (Fig. 3c). Un estándar de L-OAS puro revela masas tanto de L-serina como de L-OAS en el tiempo de retención de 1,1 min sin pico de serina a los 0,9 min (Fig. 3b, d). Esta observación es coherente con la desacetilación del estándar L-OAS en L-serina por el ionizador de electropulverización después de la elución por HPLC. Si la serina estuviera presente en el estándar L-OAS original, se habría observado un tiempo de retención separado.

Para probar si la desacetilación por ESI afecta la cuantificación de L-OAS, comparamos la proporción del área máxima de L-serina (a 1,1 min) y el área máxima de L-OAS (a 1,1 min) a través de nuestra curva estándar L-OAS. Observamos que la fragmentación de L-OAS en L-serina es proporcional a la concentración (Fig. 3g). Por lo tanto, nuestro método es adecuado para la detección y cuantificación de L-OAS (Fig. 3h).

Después de observar la expresión de DcsE-FLAG-GFP en células A549, buscamos determinar si L-OAS podría detectarse a partir de los medios de transfección. Los medios de células A549 que expresan DcsE-FLAG-GFP y FLAG-GFP como control negativo se analizaron mediante HPLC-MS para detectar L-OAS. No se detectó L-OAS en los medios de células transfectadas con DcsE-FLAG-GFP en comparación con FLAG-GFP (Fig. 4). En ambas muestras, se detectó una masa de 148,058 m/z con una abundancia relativa similar (Fig. 4b, c); sin embargo, se identificaron fragmentos insuficientes de iones asociados con un estándar L-OAS (Fig. 3f) (Fig. 4d, e) ). Se detectó un fragmento de 130 m/z del medio de transfección FLAG-GFP indicativo de una pérdida de un grupo alcohol del compuesto con una masa de 148 m/z; sin embargo, no se detectaron el pico de serina (106 m/z) ni el ion del fragmento de serina (Fig. 4d). No se detectaron iones de fragmento del medio de transfección DcsE-FLAG-GFP, lo que indica que el compuesto con una masa de 148 m/z no era L-OAS (Fig. 4e). En conjunto, concluimos que no se pudo detectar L-OAS en los medios de transfección.

Sin detección de L-OAS en los medios de células A549 transfectadas con DcsE-FLAG-GFP o FLAG-GFP. ( a ) Cromatograma de sospecha de L-OAS (148 m / z) detectado a partir de medios de transfección FLAG-GFP (rojo) y DcsE-FLAG-GFP (negro). (b, c) Picos de ESI-TOF de 148,058 m/z que representan la sospecha de L-OAS a los 1,14 min de los medios de transfección FLAG-GFP (b) y DcsE-FLAG-GFP (c). (d, e) MS en tándem de 148 m/z de (b) y (c), respectivamente, muestra fragmentos de 84,0444, 102,0545, 130,0497 y 148,06 m/z a 5 V. Los iones de fragmento esperados de 88,0396 y 106,05 de un No se detectó el estándar L-OAS.

Para entender si DcsE-FLAG-GFP producido en células A549 es capaz de catalizar la reacción de L-serina y acetil-CoA para formar L-OAS, purificamos la enzima de las células usando la etiqueta FLAG. Para determinar si FLAG-GFP y DcsE-FLAG-GFP se purificaron después de la inmunoprecipitación, realizamos un análisis de inmunotransferencia en lisado de células completas y seleccionamos fracciones de inmunoprecipitación (ver materiales y métodos y la Fig. 5). Como era de esperar, se observan DcsE-FLAG-GFP (67 kDa) y FLAG-GFP (28 kDa) en sus respectivos lisados (Fig. 5). FLAG-GFP y DcsE-FLAG-GFP no se detectan en el flujo continuo ni en los lavados, lo que indica proteína expresada capturada en gel de afinidad FLAG. Después de la elución con péptido FLAG 3 ×, la presencia de FLAG-GFP y DcsE-FLAG-GFP indica que el péptido FLAG 3 × eluye la proteína objetivo. La presencia de bandas adicionales en las eluciones concentradas indica una degradación parcial de la proteína. La presencia de tubulina en el lisado y las fracciones de flujo y la falta de tubulina en las eluciones indica que FLAG-GFP y DcsE-FLAG-GFP están purificadas de otras proteínas celulares (Fig. 5). Juntos, estos resultados indican que la precipitación y elución de FLAG purifica FLAG-GFP y DcsE-FLAG-GFP.

DcsE-FLAG-GFP se purifica y concentra después de la inmunoprecipitación FLAG. Análisis de transferencia Western de las fracciones indicadas de la purificación de DcsE-FLAG-GFP (67 kDa) o FLAG-GFP (28 kDa) de células A549 transfectadas. Se cargaron 7 µl de la fracción indicada por carril. La membrana se sondeó primero con anticuerpo anti-FLAG y luego se extrajo y volvió a probar usando antitubulina como se detalla en materiales y métodos. Las transferencias de tamaño completo y las imágenes en escalera se proporcionan como datos complementarios (Fig. S2).

Para probar si la DcsE purificada producida en células A549 puede catalizar la reacción de L-serina y acetil-CoA a L-OAS, hicimos reaccionar L-serina y acetil-CoA en presencia de DcsE-FLAG-GFP o FLAG-GFP purificada como un control y usó HPLC-MS para detectar el producto esperado L-OAS. Observamos L-OAS en la muestra que contenía DcsE-FLAG-GFP pero no FLAG-GFP (Fig. 6a). L-OAS producido por DcsE-FLAG-GFP tuvo un tiempo de retención de 1,117 min (Fig. 6a) y 148,0606 m/z (Fig. 6c). Tandem MS muestra L-OAS producido por fragmentos DcsE-FLAG-GFP en fragmentos de 131,0335, 106,0498 y 88,0395 m/z (Fig. 6d), de acuerdo con los datos de MS en tándem para un estándar L-OAS (Fig. 3f). No se detectó L-OAS en la reacción FLAG-GFP (Fig. 6b). Simultáneamente, ejecutamos una curva estándar de L-OAS (Fig. 3h) para calcular el L-OAS producido por DcsE-FLAG-GFP. Observamos que DcsE-FLAG-GFP produjo L-OAS de 40,3 µM después de una reacción de 1 hora a 30 °C. A partir de esto, concluimos la producción heteróloga activa de DcsE-FLAG-GFP en células A549.

Síntesis del intermedio D-CS, L-OAS, mediante DcsE-FLAG-GFP purificado heterólogo. La DcsE purificada reaccionó con L-Serina y Acetil-CoA fue funcional según lo determinado por la presencia del producto enzimático, L-OAS usando HPLC-MS según lo analizado por MassHunter. ( a ) Cromatograma HPLC de L-OAS producido por DcsE-FLAG-GFP (en negro) a 1.117 min. No se detectó L-OAS a partir de una reacción que contenía FLAG-GFP (en rojo). (b) Las muestras que contienen FLAG-GFP no producen un pico detectable de 148,06 m/z a los 1,117 min, lo que sugiere que no hay producción de L-OAS. (c) Las muestras que contienen DcsE-FLAG-GFP producen un pico ESI-TOF de 148,06 m/z a los 1,117 min, que corresponde a la masa de L-OAS. (d) la MS en tándem de L-OAS producida por DcsE crea fragmentos a 88,04, 106,05 y 131,03 m/z.

En este estudio, observamos que las células de pulmón humano transfectadas con DcsE-FLAG-GFP son capaces de sintetizar DcsE funcional, que cataliza el primer paso hacia la síntesis de D-CS. D-CS es un candidato óptimo para una quimioprofilaxis genética contra la TB porque es la vía más corta conocida para un antibiótico anti-TB con precursores biológicamente disponibles (Tabla 1). DcsE etiquetado con FLAG-GFP se puede expresar en células A549 (Fig. 2), pero no hay una diferencia apreciable entre el L-OAS detectado a partir de medios de transfección DcsE-FLAG-GFP y FLAG-GFP (Fig. 4). Sin embargo, la DcsE-FLAG-GFP purificada (Fig. 5) cataliza la formación de L-OAS a partir de L-serina y acetil-CoA (Fig. 6). L-OAS producido por DcsE-FLAG-GFP purificado tiene el tiempo de retención esperado de 1,1 min (Fig. 6a), una masa de 148,13 m/z (Fig. 6c) y produjo los mismos 106 m/z y 131 m/z fragmentos a 5 V (Fig. 6d) como el estándar L-OAS 0,5 mM en tampón de reacción (Fig. 3f). No se detectó L-OAS de una reacción que contenía FLAG-GFP purificada (Fig. 6b).

La producción de una enzima DcsE activa en células pulmonares humanas demuestra el progreso hacia una quimioprofilaxis genética contra la TB. Estudios previos han demostrado que otros antibióticos para la TB, como la isoniazida, se pueden usar de manera profiláctica para prevenir la infección de TB en personas infectadas con el VIH y en personas que han dado positivo en la prueba cutánea de la tuberculosis26. La isoniazida no es el único antibiótico antituberculoso que se usa quimioprofilácticamente; También se ha demostrado que la rifampicina, la piridoxina y las combinaciones de rifampicina y piridoxina reducen la incidencia de infección de TB en comparación con un placebo27.

Una limitación del uso de D-CS para la terapia génica propuesta es la concentración inhibitoria mínima (MIC) comparativamente alta para Mtb de 10–50 µg/mL que podría restringir la eficacia de la terapia dependiendo de la cantidad de D-CS que se pueda producir en humanos En este estudio, se produjeron 40,3 µM de L-OAS después de una reacción de 1 h a 30 °C, lo que equivale a 5,94 µg/mL de L-OAS, lo que significa que la concentración de un precursor es menor que la CIM de D-CS. Además, no se detectó L-OAS en medios de células transfectadas con FLAG-GFP y DcsE-FLAG-GFP (Fig. 4), por lo que es necesario optimizar DcsE y otros genes biosintéticos de D-CS.

Sin embargo, la expresión de D-CS no necesita alcanzar la concentración MIC completa para ser efectiva. Por lo general, D-CS no alcanza concentraciones de MIC en pacientes, lo que sugiere que no se requiere alcanzar MIC para la eficacia terapéutica. D-CS es conocido por su escasa penetración en la cavidad pulmonar; la dosis clínica para adultos de 250 mg solo alcanza concentraciones de menos de 2 µg/mL en el pulmón28, lo que significa que pequeñas cantidades de D-CS que se producen intracelularmente mientras la infección es leve podrían ser clínicamente relevantes. Los experimentos futuros en condiciones que modelen más de cerca el entorno complejo del sistema humano podrían determinar mejor las concentraciones realistas de D-CS que podrían producirse. Por ejemplo, podrían usarse modelos de células no cancerosas como Beas-2B, macrófagos y modelos in vivo. Además, los modelos in vivo representarán mejor cómo la expresión local de D-CS podría proteger a nivel de órganos en los sistemas corporales.

Para aplicar de manera segura la quimioprofilaxis genética para la TB, proponemos desarrollar una terapia génica extirpable que administre D-CS específicamente en presencia de infección de TB, como se muestra en la Fig. 7. Dicha terapia génica deberá ser extirpable en el caso de efectos adversos, inducible en caso de infección, y activo específicamente en respuesta a la TB. La recombinación específica del sitio del sistema CRE/loxP1 podría usarse para eliminar permanentemente dcsABCDEG en el caso de efectos adversos. Como se visualiza en la Fig. 7a, la expresión de la recombinasa CRE es activada por el fármaco tamoxifeno29. Cuando se expresa, CRE escinde los dos sitios loxP, eliminando así la construcción responsable de la producción de D-CS (Fig. 7b). El sistema CRE/loxP1 es un sistema adecuado para esta aplicación porque es preciso, está controlado por un fármaco que no está presente de forma natural en las células humanas y es capaz de detener la expresión de D-CS de forma rápida y permanente. Además, dcsABCDEG se expresará selectivamente en presencia de infección a través de un elemento promotor sensible a la infección apropiado (InfRE; Fig. 7c). Por ejemplo, el promotor MIP-2 podría usarse para activar el plásmido en presencia de bacterias intracelulares como Mtb30,31. Dado que el promotor de MIP-2 responde a todas las infecciones intracelulares, será necesaria una ingeniería molecular adicional. Para lograr esto, la proteasa32 MycP1, producida por Mtb, podría usarse para controlar la expresión de enzimas funcionales. Al unir DcsABCDEG con el polipéptido SLKPASAGGG específico de MycP1, esperamos que la enzima activa solo se produzca en presencia de TB. Al incluir un promotor inducido por infección, sitios MycP1 entre cada enzima para controlar la funcionalidad de las enzimas en presencia de TB y un plásmido escindible controlado por CRE/loxP1 en nuestro diseño, se controla la expresión de genes de síntesis de D-CS.

Plásmido D-CS escindible propuesto para expresión inducible por TB. ( a ) Mapa del plásmido D-CS propuesto. Promotor del elemento sensible a la infección (gris: InfRE), promotor inducible por tamoxifeno (gris: TAM), genes DcsABCDEG y CRE (rojos), sitios loxP extirpables (dorado), sitios de escisión de Mtb MycP1 SLKPASAGGG (líneas de puntos). (b) Célula con plásmido extirpado activado por tamoxifeno que expresa CRE recombinasa para cortar en los sitios loxP. ( c ) Célula que no expresa DcsABCDEG en el caso de que no haya infección de TB. ( d ) Célula que expresa DcsABCDEG en el caso de infección por TB.

Otro factor de seguridad importante es la tolerancia por parte del huésped. Como se muestra en la Fig. 1, DcsA y B sintetizan hidroxiurea a partir de L-arginina14. Se sabe que la hidroxiurea es citotóxica para las células humanas en concentraciones de 2 a 10 mM 33. Si bien estas concentraciones superan con creces la concentración in vivo esperada de D-CS de aproximadamente 50 µM, un importante área futura de estudio será determinar si la hidroxiurea alcanza niveles tóxicos. niveles, o es consumido lo suficientemente rápido por DcsD para evitar cualquier efecto citotóxico.

El sistema utilizado para administrar la quimioprofilaxis genética debe ser duradero y bien tolerado. Los virus adenoasociados (AAV) son una forma de administrar una construcción similar a la propuesta en la Fig. 7a. Los AAV son una forma versátil y eficaz de entregar material genético a través de una cubierta de proteína que contiene ADN de cadena sencilla34. En general, se considera que la capacidad del genoma de AAV es de alrededor de 4,5-5 kb, que está por debajo del tamaño estimado del plásmido propuesto en la Fig. 7. Sin embargo, se ha demostrado que AAV5, un serotipo de AAV, incorpora tamaños de genoma de hasta 8,9 kb35 que es más grande que el plásmido propuesto en la Fig. 7. Los liposomas catiónicos (CL) son otro ejemplo de una tecnología capaz de administrar una terapia génica. Los CL no son virales y usan una membrana de bicapa lipídica cerrada para entregar genes y proteger el ADN de la degradación36. Los CL son muy personalizables y pueden transferir hasta 1000 kb36 a las células, lo que los convierte en otra tecnología prometedora para aplicaciones de terapia génica. En general, tanto AAV como CL son métodos de administración que podrían usarse para administrar el tejido de construcción de manera específica, segura y confiable. La entrega in vivo de terapia génica es un área activa de investigación para aumentar la eficiencia de transfección relativamente baja usando AAV y CL37. Además, serían necesarios estudios futuros para determinar si los macrófagos o las células pulmonares serían un mejor objetivo final para este enfoque en función de la naturaleza de la infección por tuberculosis y la eficiencia de transfección de cada tipo de célula.

Al observar la producción heteróloga de DcsE-FLAG-GFP funcional, proporcionamos evidencia de que el primer paso para la síntesis profiláctica de D-CS es posible en células humanas. Nuestras direcciones futuras inmediatas incluyen el desarrollo de un método para observar esta actividad enzimática en células A549 vivas y, finalmente, avanzar hacia la síntesis de las seis enzimas en la vía D-CS a través del plásmido propuesto. Además, los estudios futuros podrían replicar este estudio en modelos de células no cancerosas como Beas-2B o macrófagos. Finalmente, los modelos in vivo serían finalmente necesarios para determinar la eficacia de la quimioprofilaxis genética propuesta. En general, con el rápido crecimiento de las terapias basadas en células, buscamos crear las herramientas ahora para prepararnos para un estado futuro en el que las terapias génicas sean comunes, seguras, económicamente plausibles y bien aceptadas.

Las células epiteliales respiratorias A549 (ATCC CCL-185) se mantuvieron en medio F-12 K completo compuesto por la modificación de Kaighn del medio F-12 K de Ham (ATCC 30–2004), 10 % de FBS (v/v; VWR 89,510–186) y penicilina-estreptomicina al 1% (v/v; ATCC 30–2300). Las células se mantuvieron de acuerdo con las pautas de manipulación de la ATCC para células A54938.

El gen DcsE está presente en la bacteria sintetizadora de D-cicloserina Streptomyces lavendulae. S. lavendulae (ATCC #11,924) se obtuvo de ATCC en forma liofilizada y se reanimó de acuerdo con las instrucciones del proveedor (ATCC, nd-c). El organismo se revivió en caldo de extracto de malta de levadura (5 g de dextrosa, 2,5 g de peptona, 1,5 g de extracto de malta y 1,5 g de extracto de levadura hasta 500 ml en diH2O) y se sembró en el mismo medio de agar, y el crecimiento se produjo dos días después. inoculación a 26 °C.

A continuación, se cultivó un cultivo líquido fresco de S. lavendulae a partir de una única colonia y, tras el crecimiento, se lisaron las células. Se sedimentaron 5 ml de células y se lavaron en 200 µl de tampón de digestión de lisozima. Luego, las células se transfirieron a un tubo de centrífuga con tapón de rosca que contenía perlas de vidrio de 0,1 mm y se homogeneizaron durante 30 s. A continuación, se extrajo el ADN genómico de las bacterias utilizando el minikit de ADN genómico PureLink (n.º de catálogo k182001). La solución eluida final se analizó usando una nanogota y reveló el pico limpio a 260 nm característico del ADN. Se realizaron dos lecturas de concentración que arrojaron una concentración aproximada de 15 ng/µl.

DcsE se clonó por primera vez en el vector pCOOFY50 (plásmido Addgene n.° 55,189) mediante ensamblaje de Gibson (https://www.nature.com/articles/nmeth.1318) utilizando el sistema de ADN NEB HiFi (n.° de catálogo E2621S). Se amplificaron 20 ng del esqueleto PCOOFY50 usando los cebadores AB0001 y AB0002 (Tabla 2) y la polimerasa de alta fidelidad pHusion (NEB # M0530S) de acuerdo con el protocolo de PCR descrito en la Tabla 3. Asimismo, se amplificó un fragmento DcsE usando 50 ng de ADN de S. lavendulae y cebadores AB0009 y AB0010 utilizando el mismo protocolo. Después de la limpieza del producto de PCR con el kit concentrador y de limpieza Zymo (Zymo n.° D4004), los extremos homólogos de los dos productos se reasociaron con el sistema de ADN NEB HiFi (n.° de catálogo E2621S) y se transformaron en DH5α E. coli como se describe a continuación.

Ni DcsE ni GFP se expresaron usando el vector pCOOFY50, por lo que DcsE se subclonó en pCS2 + (https://www.addgene.org/vector-database/2295/) que contenía FLAG-GFP corriente abajo del promotor CMV. DcsE se subclonó en pCS2+ usando amplificación por PCR seguida de ensamblaje Gibson como se describe anteriormente con las siguientes modificaciones: se usaron los cebadores ASB001 y ASB002 para amplificar el esqueleto de pCS2-FLAG-GFP y los cebadores ASB011 y ASB012 se usaron para amplificar DcsE de pCOOFY50 DcsE. Los plásmidos resultantes se denominaron pCS2-FLAG-GFP y pCS2-DcsE-FLAG-GFP.

Las secuencias del promotor y los marcos de lectura abiertos de los plásmidos se verificaron mediante secuenciación de Sanger en la instalación de secuenciación del Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Chicago (UCCC).

Para transformar DH5α competente con DcsE-FLAG-GFP o FLAG-GFP, se combinaron 50 µl de DH5α competente y 2 µl de plásmido purificado y se incubaron en hielo durante 30 min. Las muestras se sometieron a un choque térmico a 42 °C durante 45 s y se colocaron en hielo durante 5 min. Se añadieron 800 µl de SOC y se agitó durante una hora a temperatura ambiente. Se sembraron 150 µl de esta solución en placas de agar LB con 100 µg/ml de ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Una colonia se transfirió a 5 ml de caldo LB estéril con 100 µg/ml de ampicilina y se agitó a 37 °C durante 12 h. El ZymoPURE Plasmid Miniprep Kit se utilizó siguiendo el protocolo de centrifugación para purificar el plásmido puro.

Para transfectar células A549 con DcsE-FLAG-GFP o FLAG-GFP, las células se sembraron en placas de 60 mm tratadas con cultivo tisular a una concentración de 176 800 células/ml en medio F-12 K completo. 12 h después de la siembra, las células se transfectaron usando Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher L3000) y 6 ug de plásmido purificado siguiendo las pautas de Thermo Fisher para células A54939. Las células se transfectaron durante la noche durante 12 h a 37 °C con 4,5 % de CO2. Después de 12 h de transfección, se recogieron los medios y se guardaron para análisis posteriores.

Se tomaron imágenes de células A549 12 h después de la transfección utilizando un microscopio de contraste de fase invertido Nikon Eclipse TE2000-U (Tokio, Japón) con una fuente de alimentación Nikon TE2-PS100W, una lámpara de mercurio Chiu Technical Corporation de 100 W (Kings Park, EE. UU.) y Software NIS-Elements de Nikon. Las imágenes de las células se tomaron con el objetivo 10X, el zoom adicional de 1,5X y la fase 1. Para cada posición, se tomó una imagen usando el contraste de interferencia diferencial (DIC) para enfocar las células y la luz azul para obtener imágenes de fluorescencia GFP. ImageJ se utilizó para fusionar imágenes.

Las células A549 se lisaron inmediatamente después de la transfección y la formación de imágenes. Se eliminó el medio y se lavaron las células con 5 ml de PBS (ATCC 30–2200). Se añadieron 150 µl de tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación frío (RIPA) tampón de lisis que contenía NaCl 150 mM, IGEPAL CA-630 (NP40) al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS (dodecilsulfato de sodio) al 0,1 %, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 a cada plato. Las células se lisaron en hielo durante aproximadamente 30 s usando un raspador de células. Se usó un microscopio invertido para asegurar que todas las células fueran lisadas. Todo el líquido se transfirió a tubos de microcentrífuga preenfriados y se centrifugó a 13 000 xg durante 10 min a 4 °C. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se procedió inmediatamente a la purificación.

El lisado celular se purificó inmediatamente para eliminar las proteasas en el lisado crudo. La proteína se purificó usando Sigma Monoclonal ANTI-FLAG M2 Affinity Gel y se siguió el protocolo sigma "Inmunoprecipitación de FLAG Fusion Proteins usando Monoclonal Antibody Affinity Gels". Se usó TBS (Tris HCl 0,5 M, pH 7,5, NaCl 1 M) para lavar el gel antes de la inmunoprecipitación. Las muestras se eluyeron tres veces usando péptido FLAG 3 × (Rockland Immunochemicals) a una concentración de trabajo de 150 ng/µL en TBS. Después de la elución, las muestras se filtraron utilizando 500 µl de filtro de microcentrífuga de 10 kDa (Amicon) para filtrar el exceso de péptido FLAG 3 ×, cambiar el tampón de lisis por tampón de reacción 10 × que contenía Tris-HCl 40 mM (pH 7,6), NaCl 400 mM, NaCl 2 mM EDTA, modificado a partir de y para concentrar muestras hasta un volumen final de 50 µl.

La presencia de FLAG-GFP y DcsE-FLAG-GFP se detectó mediante el protocolo de Western blot de abcam40. Se cargaron 7 µl de cada fracción por carril junto con 2,5 µl de tampón de muestra 4 × LDS (Thermo Fisher NP0007). Se utilizó como referencia una escalera de proteína preteñida PageRuler de 5 µl (Thermo Fisher 26,616). Se utilizó un gel NuPAGE 4–12 % Bis-Tris (Thermo Fisher NP0321BOX) con tampón de ejecución NuPAGE MES SDS (Thermo Fisher NP0002) de acuerdo con las instrucciones del fabricante41. Los geles se transfirieron a una membrana de PVDF utilizando una celda de transferencia semiseca Bio-Rad Trans-Blot SD a 25 V durante 30 min con tampón de transferencia Bjerrum Schafer-Nielsen: Tris Base 48 mM y Glycine 39 mM (pH 9,2). La membrana se bloqueó en BSA al 3 % (p/v) en PBS con Tween 20 al 0,1 %. 1:10,000. El sustrato ECL (BioRad 1,705,062) se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante42 con un sistema de imágenes BioRad ChemiDoc. Las transferencias de Western se eliminaron y reprobaron usando el protocolo de eliminación de abcam para reprobar43. El anti-Tubulin primario (NOVUS NB600-936) se diluyó 1:1000 y el anti-Rabbit secundario (Promega W401B) se diluyó 1:2000. Se tomaron imágenes de las transferencias como se describe anteriormente.

Para realizar la síntesis de L-OAS in vitro14, se hicieron reaccionar 20 µl de DcsE-FLAG-GFP y FLAG-GFP purificados en una reacción de 50 µl a una concentración final de L-serina 1 mM y acetil-CoA 1 mM en un tampón de reacción44 que contiene Tris-HCl 4 mM (pH 7,6), NaCl 40 mM, EDTA 0,2 mM y ditiotreitol (DTT) 1 mM. Las muestras se hicieron reaccionar durante 1 hora a 30 °C.

Se utilizó HPLC-MS para detectar L-serina y L-OAS a partir de muestras de síntesis de L-OAS in vitro. Las muestras se separaron con un HPLC Agilent 1290 Infinity II con una columna C18 acuosa YMC ODS-AQ de 2,0 mm × 100 mm y 5 μm (YMC America) y un espectrómetro de masas LC/MS de tiempo de vuelo cuadrupolo Agilent 6545 en modo positivo en el Integrated Instalaciones del Centro de Educación e Investigación de Estructura Molecular (IMSERC) en la Universidad Northwestern. Se inyectó 1 µl de muestras comenzando con una concentración de 100 % de disolvente A (H2O + 0,1 % de ácido fórmico (FA)) y 0 % de disolvente B (ACN + 0,1 % de FA). La proporción de disolvente B se incrementó linealmente hasta el 50 % de 2,0 a 7,0 min. De 7,0 a 9,0 min, la relación de disolvente B se incrementó de nuevo linealmente hasta el 99%. De 11,0 min a 11,5 min se aumentó el disolvente A de 1,0% a 100%. El solvente A permaneció al 100% hasta que el método total alcanzó los 16 min. El caudal se fijó en 0,3 ml/min y todas las muestras se procesaron a temperatura ambiente.

Este método se utilizó para crear una curva estándar de diluciones en serie 1:1 para L-serina y L-OAS que oscilaban entre 500 uM y 3,9 uM. Las muestras que reaccionaron se prepararon añadiendo un volumen igual de FA al 0,1 % (Sigma 5.43804) en acetonitrilo (Sigma 34.851) inmediatamente después de completar la reacción. Las muestras se agitaron y centrifugaron a máxima velocidad durante 10 min y luego se transfirieron 75 µl del sobrenadante a viales de automuestreador. Utilizando el mismo método que el anterior, se utilizó HPLC-MS para detectar el producto en las muestras. Para MS en tándem, se utilizaron voltajes de 2,0 y 5,0 V. Se usó el software MassHunter Data Acquisition para operar el instrumento y MassHunter Qualitative Analysis se usó para el análisis de datos (Agilent MassHunter Quantitative Analysis, Version 10.0, Build 10.0.10305.0. RRID:SCR_016657).

Los datos subyacentes para este trabajo están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores agradecen al Dr. Fernando Tobias y al Dr. Ben Owen de las instalaciones de IMSERC de Northwestern por su asistencia en el uso de HPLC-MS y al laboratorio DebBurman por su microscopio de fluorescencia. Los autores también agradecen a Rebecca Delventhal y Karen Kirk por su lectura del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Bioquímica y Biología Molecular de Lake Forest College.

Departamento de Química y Bioquímica y Programa de Biología Molecular, Lake Forest College, Lake Forest, EE. UU.

Laurel Robbins, Ariane Balaram, Stefanie Dejneka, Matthew McMahon, Zarina Najibi, Peter Pawlowicz y William H. Conrad

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LR y WC escribieron el manuscrito principal y diseñaron experimentos. LR realizó todos los experimentos excepto el diseño de plásmidos. ZN diseñó experimentos y contribuyó a reproducir la Fig. 1. AB realizó la construcción y validación de plásmidos. LR generó todas las figuras excepto la Fig. 7 y MM preparó la Tabla 1. SD y PP contribuyeron a la introducción, los experimentos y la Fig. 7. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a William H. Conrad.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Robbins, L., Balaram, A., Dejneka, S. et al. Producción heteróloga del intermedio O-acetil-L-serina de D-cicloserina en un modelo de células pulmonares de tipo II humano. Informe científico 13, 8551 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35632-4

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Recibido: 19 Octubre 2022

Aceptado: 21 de mayo de 2023

Publicado: 26 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35632-4

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