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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8967 (2023) Citar este artículo

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El cálculo dental es un recurso valioso para la reconstrucción de los hábitos alimentarios y el microbioma oral de poblaciones pasadas. En 2020, se exhumaron los restos del duque Alessandro Farnese y su esposa Maria D'Aviz para obtener nuevos conocimientos sobre las causas de la muerte. Este estudio tuvo como objetivo investigar el metaboloma del cálculo dental de la pareja noble mediante metabolómica no dirigida. Las muestras pulverizadas se descalcificaron en una mezcla de agua y ácido fórmico, se extrajeron con metanol/acetonitrilo y se analizaron mediante cromatografía líquida de ultra alta resolución acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (UHPLC-HRMS) utilizando una separación de fase inversa seguida de ionización por electropulverización y Escaneo completo en modo de iones positivos y negativos. Se utilizó un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de cuadrupolo híbrido de alta definición Synapt-G2-Si de Waters. A continuación, se identificaron las características significativas utilizando el modo de adquisición MSE, registrando información sobre el precursor de masa exacta y los iones de fragmento dentro de la misma ejecución. Este enfoque, junto con el pretratamiento de datos y el análisis estadístico multivariado, permitió la identificación de compuestos capaces de diferenciar entre las muestras investigadas. Se identificaron más de 200 metabolitos, siendo los ácidos grasos, alcoholes, aldehídos, fosfatidilcolinas, fosfatidilgliceroles, ceramidas y fosfatidilserinas las clases más abundantes. También se determinaron metabolitos derivados de alimentos, bacterias y hongos, brindando información sobre los hábitos y el estado de salud bucal de la pareja.

El cálculo dental es una placa microbiana mineralizada que se acumula en la superficie del diente1. El mineral se deposita a partir del líquido crevicular, pero finalmente deriva por precipitación de las sales de calcio salivales, por lo que la concentración de cálculo es mayor en los sitios más cercanos a los conductos de las glándulas salivales2. Al estar compuesto principalmente por constituyentes inorgánicos, entre los que se encuentran la hidroxiapatita, la fluorapatita, el fosfato octacálcico y la whitlockita3, el cálculo dental está bien conservado en muestras arqueológicas y puede sepultar biomoléculas (p. ej., ADN, proteínas y lípidos) asociadas a la microbiota oral, el huésped, y microdesechos de origen exógeno4,5,6,7. Por lo tanto, en las últimas dos décadas, el cálculo dental ha sido un recurso importante para investigar el estado de salud, el estilo de vida y la dieta en las poblaciones pasadas. La microscopía óptica8, la microscopía electrónica de barrido, también acoplada a la espectroscopia de rayos X de dispersión de energía9,10, la pirólisis, la cromatografía de gases, la espectrometría de masas11 y las técnicas multiómicas, incluidas la proteómica, la genómica y la metabolómica12,13, demostraron ser técnicas valiosas para caracterizar los desechos exógenos atrapados en cálculo dental, proporcionando información sobre los hábitos y la salud de las personas que vivían en el pasado. Las estrategias ómicas basadas en la espectrometría de masas, que pueden proporcionar una toma de huellas dactilares completa de las muestras investigadas, son particularmente prometedoras gracias a su sensibilidad, alto rendimiento y poder de discriminación. Una de las ventajas más importantes de estas técnicas se basa en su naturaleza no dirigida, lo que proporciona información sobre una gran cantidad de biomoléculas y permite la identificación de biomarcadores.

Combinada con el uso de bioinformática y enfoques computacionales, la metabolómica juega un papel clave en la comprensión del metaboloma y en la identificación de metabolitos presentes en muestras biológicas14,15,16. Diferentes plataformas analíticas, entre las que se pueden aplicar espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) acoplada a cromatografía de gases y líquidos (GC-HRMS, GCxGC-HRMS y LC-HRMS) y resonancia magnética nuclear (NMR) para lograr una cobertura integral de metaboloma. Debido a la mayor especificidad, sensibilidad y disponibilidad de grandes bases de datos espectrales en comparación con la RMN, la HRMS se ha aplicado ampliamente para la elaboración de perfiles metabolómicos de diferentes biofluidos, tejidos y otras muestras biológicas17,18,19. En particular, las estrategias analíticas que involucran el acoplamiento en línea de separaciones UHPLC ortogonales con HRMS representan las mejores herramientas para ampliar la cobertura de metabolitos20, porque UHPLC se encuentra entre las técnicas de separación más eficientes21 y su combinación con HRMS permite la identificación de una amplia gama de metabolitos22.

Recientemente, Velsko y sus coautores investigaron el metaboloma del cálculo dental en especímenes modernos y antiguos mediante el uso de enfoques basados ​​en la EM dirigidos y no dirigidos23. En particular, el uso de UHPLC junto con espectrometría de masas en tándem de alta resolución (UHPLC-HRMS/MS) y GC-HRMS permitió la identificación de metabolitos pertenecientes a diferentes clases químicas, principalmente lípidos y aminoácidos, junto con varios compuestos xenobióticos, proporcionando información sobre la actividad del microbioma, los procesos metabólicos y los patrones de degradación.

En el presente estudio, se aplicó UHPLC-HRMS utilizando un espectrómetro de masas QTOF Synapt-G2-Si High-Definition (HD)MS de cuadrupolo híbrido de Waters para investigar el metaboloma del cálculo dental de Duke Alessandro Farnese y su esposa Maria D'Aviz, que gobernó el Ducado de Parma y Piacenza en el siglo XVI. Alessandro Farnese (1545–1592), un miembro clave de la corte de Felipe II de España, fue uno de los líderes militares y políticos más influyentes del siglo XVI y logró numerosas victorias, particularmente en Flandes, donde fue gobernador durante 15 años. La envidia que despertó su éxito hizo sospechar que su muerte podría ser causada por un envenenamiento. Para disipar esta duda, en 2020 se exhumaron los restos tanto de Alessandro Farnese como de su esposa de la cripta de la basílica de Santa Maria della Steccata en Parma (Italia). Después de abrir el estuche de plomo que contenía los restos, los dientes fueron sometidos a análisis morfológico. La característica principal en la dentición de Alessandro Farnese fue el desgaste severo, mientras que los dientes de Maria D'Aviz se caracterizaron por la presencia de caries y enfermedades periodontales24. Estos hallazgos podrían estar asociados con el estilo de vida diferente de la pareja noble, el duque Farnesio pasó la mayor parte de su vida adulta en los campos de batalla de toda Europa y su esposa mantuvo los hábitos de la corte portuguesa en la ciudad de Parma. En este contexto, probamos la capacidad de UHPLC-HRMS operando en modo MSE de exploración para investigar las diferencias en el perfil metabolómico del cálculo dental del duque y su esposa, con el objetivo final de lograr nuevos conocimientos sobre las causas de la muerte de Alessandro Farnese. así como sobre los hábitos, estado de salud y alimentación de la noble pareja.

Se aplicó el análisis HRMS para lograr una identificación altamente confiable de los metabolitos presentes en el cálculo dental de la pareja noble. Las capacidades del espectrómetro de masas Waters Synapt G2-Si HD para el perfilado de matrices complejas se aprovecharon operando en modo MSE: el uso de una adquisición de exploración alternativa de perfiles de alta y baja energía proporciona información sobre iones precursores y fragmentos en un solo funciona con un ciclo de trabajo superior al de otras técnicas de análisis independientes de datos.

Debido a la baja cantidad de muestra disponible, las condiciones experimentales más adecuadas tanto para la extracción como para el análisis se evaluaron de forma preliminar utilizando muestras de cálculo dental modernas operando tanto en modo PI como NI. Se investigaron los efectos tanto de la relación entre la fase acuosa y orgánica para el procedimiento de extracción como del volumen de inyección: se utilizó una relación 1:3 para inducir la precipitación de proteínas, evitando una alta dilución de los metabolitos extraídos, mientras que se inyectaron 8 µL para obtener intensidades de señal adecuadas para realizar las mediciones (Fig. 1). También se obtuvo una buena repetibilidad en términos de área de los picos cromatográficos seleccionados con desviaciones estándar relativas siempre inferiores al 5 y 7% para los modos PI y NI, respectivamente.

Cromatogramas UHPLC-HRMS en modo PI de muestras de cálculo dental de: arriba) Maria D'Aviz y abajo) Duke Alessandro Farnese. Columna: Atlantis Premier BEH C18 AX 1,7 μm (2,1 × 100 mm); fase móvil: (A) agua + 0,1% (v/v) de ácido fórmico y (B) acetonitrilo + 0,1% (v/v) de ácido fórmico; volumen de inyección: 8 µL.

La gran cantidad de características generadas por HRMS es uno de los aspectos más desafiantes de la metabolómica no dirigida: en este contexto, se deben aplicar estrategias de filtrado y reducción de datos para seleccionar los valores significativos de m/z para su identificación posterior en función de la precisión medida. masa de iones precursores y fragmentos.

Se extrajeron un total de 5918 y 5689 características en la muestra de cálculo dental de Duke Alessandro Farnese operando en modo PI y NI, respectivamente, mientras que en la muestra de su esposa Maria D'Aviz se registraron 5525 y 4728 características. Para resaltar las características responsables de la diferenciación entre las muestras de la pareja noble, solo se utilizaron para el procesamiento posterior aquellas que tenían una variabilidad intragrupo de máximo 10%. También se aplicó un cambio de pliegue mínimo de 3 en comparación con las muestras en blanco de extracción para corregir el nivel de ruido en los cromatogramas de las muestras de cálculo dental. Finalmente, se fijó un valor de 0,8 como valor de referencia para el análisis de poder estadístico para detectar efectos reales en el conjunto de datos analizado. Aplicando los filtros mencionados anteriormente se obtuvo un total de 4859 características.

El análisis estadístico multivariante se realizó mediante el análisis de componentes principales (PCA) con el 99% de la varianza total explicada por las primeras 6 PC. Como se muestra en la Fig. 2, se logró una buena separación entre las muestras de cálculo dental de Duke Alessandro Farnese y su esposa a lo largo de PC1, lo que representa más del 87 % de la varianza total. Se logró una reducción adicional en el número de características (4227) al enviar al proceso de identificación solo las variables que tenían una puntuación absoluta en el gráfico de carga superior a 0,8 en PC1 (Fig. 2c).

PCA: (a) gráfico de carga y (b) gráfico de puntuación de todas las características; (c) resaltado de las características que tienen |carga |> 0.8.

Teniendo en cuenta que no se disponía de información a priori con fines de elucidación, la identificación de compuestos se realizó considerando toda la información derivada de mediciones de masa precisas, estudios de fragmentación, análisis del patrón isotópico, comparación de bibliotecas y ajuste de puntuación.

Se identificaron un total de 217 metabolitos pertenecientes a diferentes clases (Tabla S1). Los esfingolípidos, los glicerofosfolípidos y los acilos grasos fueron las clases químicas más abundantes, con 132 compuestos. La presencia de un elevado número de lípidos no sorprende: en un estudio previo sobre el metaboloma antiguo y moderno del cálculo dental, Velsko et al. destacó la influencia de la solubilidad acuosa en la conservación de los compuestos, asumiendo que los compuestos caracterizados por una alta solubilidad en agua podrían degradarse más fácilmente23. En base a estos hallazgos, la naturaleza no polar de los lípidos puede favorecer su conservación en el tiempo. Además, la presencia de ácidos grasos saturados fue casi el doble que la de los insaturados: según Rogoz et al.12, este comportamiento puede atribuirse a la menor estabilidad oxidativa de los compuestos insaturados, lo que conduce a una degradación más fácil. Se detectaron once aminoácidos: estos compuestos también podrían sufrir modificaciones con el tiempo; por ejemplo, la presencia de tiramina puede estar relacionada con la descarboxilación de tirosina como resultado de procesos de fermentación o descomposición bacteriana. La tiramina se detectó principalmente en el cálculo dental del duque Alessandro Farnese. Teniendo en cuenta que el duque pasó la mayor parte de su vida en los campos de batalla del norte de Europa, la presencia de tiramina podría estar relacionada con el consumo de alimentos de larga duración, como el queso sazonado, el arenque seco o ahumado, el venado, los embutidos y las bebidas fermentadas25.

Entre los compuestos potencialmente atribuibles a los hábitos alimentarios del duque, la cucurbitina y la catequina 5-O-beta-d-glucopiranósido-4'-Me podrían estar relacionados con el consumo de alimentos típicos presentes en las mesas del norte de Europa como las cucurbitáceas y el ruibarbo26, 27 Por el contrario, el 3-hidroxi-3-metiloxindol, el ribósido del ácido imidazolacético, el 2-(metilamino)-1-feniletanol y la arginil hidroxiprolina pueden estar relacionados con los hábitos alimentarios de Maria D'Aviz: de hecho, según Human Metabolome DataBase and Food DataBase (FooDB), estos compuestos podrían ser considerados biomarcadores potenciales para el consumo de anátidos, pollos y cerdos domésticos y se sabe que Maria D'Aviz utilizó aves de corral como ingrediente principal de varias recetas descritas en su famoso libro de cocina28.

Entre los metabolitos que se encuentran comúnmente en las especias y el té, el salicilaldehído, el DAG (32:4), la capsiamida, el estragol, las fenilpiridinas y la eugenol quinona metida (EQM) fueron algunos de los compuestos detectados mayoritariamente en el cálculo dental de Maria D'Aviz. El consumo de estos alimentos no sorprende: Maria D'Aviz era miembro de la corte portuguesa, y las especias, que se citan con frecuencia en el libro de cocina de la noble, podían importarse fácilmente tanto de las Azores, la colonia más importante de el imperio portugués y Asia29.

En cuanto a los salicilatos, están contenidos en hierbas, especias y té30 y se sabe que los extractos de plantas ricos en salicilatos, debido a sus efectos antiinflamatorios y antipiréticos, se han utilizado en la antigüedad para tratar diferentes enfermedades humanas31.

La presencia de EQM, un derivado de la oxidación del eugenol32,33, puede explicarse no solo considerando la ingesta dietética de especias como el clavo, la nuez moscada y la canela34, sino también los efectos antiinflamatorios y analgésicos de los remedios a base de eugenol35, que han sido se utiliza para tratar el dolor de muelas, una patología que ha afectado a Maria D'Aviz. Sin embargo, la presencia de EQM también podría atribuirse al uso de esencias para el embalsamamiento, práctica utilizada por los nobles en el siglo XVI36,37. Asimismo, la presencia de otros metabolitos derivados de frutas y cítricos como hesperidina, neohesperidina, narirutina, naringina chalcona, dihidroxicitracridona I, anfibina H, que se observaron en el cálculo dental de la pareja noble, podría explicarse teniendo en cuenta tanto el consumo de alimentos como su uso como perfumes y esencias utilizadas en la práctica del embalsamamiento.

Con respecto al microbioma oral, algunos de los compuestos detectados también pueden atribuirse al metabolismo de hongos y bacterias. Un resultado interesante está relacionado con la presencia del metabolito TMC-34 derivado de Actinomyces, que están involucrados en el desarrollo de la periodontitis38,39,40. Este metabolito estaba presente principalmente en el cálculo dental de Maria D'Aviz, y se sabe que la noble mujer sufría de caries y enfermedades periodontales24.

También se identificaron metabolitos adicionales como los glicerofosfolípidos PIM1(37:3), LPIM4(18:2) y LPIM4(19:2) relacionados con la bacteria Mycobacterium tuberculosis41. Después de su muerte, la autopsia del duque Alessandro Farnese reveló la presencia de enfermedades pulmonares42 confirmadas además por los resultados obtenidos durante la exhumación en 202043, lo que sugiere neumonía, una enfermedad muy extendida en los siglos XV y XVI44,45.

También hay que destacar la presencia de diferentes metabolitos de Saccharomyces cerevisiae, a saber, fitoesfingosina C16, fitoesfingosina C20, MIPC 42:0;O3, MIPC 40:0;O2, PI-Cer(d46:0)46, que pueden estar relacionados a los procesos de panificación y fermentación asociados con la elaboración del vino y la elaboración de cerveza47,48. Finalmente, la presencia de otros metabolitos como el penipacido B (ácido 2-[[N-(2-metoxi-2-metilpropil)-C-metilcarbonimidoil]amino]benzoico), versixantona E, asperversina G o 2,4,6,8 -tetrametil-3,4-dihidroxidec-8(9)-enolido, derivado de los hongos Penicillium paneum, Aspergillus versicolor y Botrytis cinerea, se puede relacionar con los hábitos alimentarios de la pareja noble. Estos mohos, capaces de contaminar cereales, semillas oleaginosas y frutos secos, están implicados principalmente en el deterioro del pan49,50,51. Estos hallazgos sugieren que también los miembros de las clases altas que vivían en el Renacimiento consumían pan seco y mal conservado.

La metabolómica no dirigida utilizando UHPLC acoplado al sistema Waters Synapt G2-Si HDMS se aplicó con éxito para analizar el metaboloma del cálculo dental de las personas que vivían en la antigüedad. Con respecto a la metabolómica no dirigida de Duke Alessandro Farnese y su esposa Maria D'Aviz, la capacidad de separar de manera eficiente los componentes de muestras tan complejas combinada con la adquisición independiente de datos mediante MSE de alta resolución permite maximizar la información obtenida de las muestras investigadas mediante el registro tanto de baja -Perfiles de energía y energía de alta colisión relacionados con todos los compuestos en una sola ejecución. UHPLC-HRMS seguido de análisis de componentes principales se utilizó con éxito para la diferenciación de las muestras de la pareja noble, lo que permitió la identificación de más de 200 metabolitos capaces de proporcionar nuevos conocimientos sobre los hábitos dietéticos y el estado de salud del duque Alessandro Farnese y su esposa. A partir del resultado del análisis metabolómico, se sugirió que la combinación de LC-HRMS con PCA ofrece una poderosa técnica analítica para diferenciar el cálculo dental en especímenes antiguos e identificar marcadores de metabolitos, que tienen funciones esenciales en la diferenciación de muestras, según el análisis forense de los restos. , la presencia de metabolitos relacionados con Mycobacterium tuberculosis puede considerarse un paso valioso para esclarecer las causas de la muerte del duque, mientras que la identificación de compuestos derivados del consumo de alimentos confirmó los diferentes estilos de vida de la noble pareja.

El agua de grado LC-MS, el acetonitrilo, el metanol y el ácido fórmico se compraron de Honeywell Burdick & Jackson (Charlotte, NC, EE. UU.). El estándar de leucina encefalina se obtuvo del Waters TOF G2-S Sample Kit-1 (Waters, Milford, MA, EE. UU.).

Se recolectó cálculo dental histórico de los restos del duque Alessandro Farnese y Maria D'Aviz después de su exhumación en 2020 de la Basílica de Santa Maria della Steccata (Parma, Italia). El notario Dr. Marco Micheli en Parma autorizó la exhumación y el análisis posterior. Durante los procedimientos de examen físico de los dientes, el cálculo de la pareja fue recolectado con el uso de una cureta estéril siguiendo los protocolos para evitar la contaminación cruzada, luego fue almacenado en viales de vidrio hasta el análisis52,53. De acuerdo con las directrices para la identificación de casos que se presentarán al Comité de Ética del Área Vasta Emilia Nord (https://www.aou.mo.it/ComitatoEticoAVEN), no se requirió aprobación.

Se obtuvieron muestras de cálculo dental moderno de cuatro donantes sanos para evaluar tanto la extracción como las condiciones cromatográficas durante sesiones de higiene oral profesional. De acuerdo con las directrices para la identificación de casos que se presentarán al Comité de Ética del Área Vasta Emilia Nord (https://www.aou.mo.it/ComitatoEticoAVEN), no se requirió aprobación. La recogida de muestras se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de los donantes.

Después de la recolección, las muestras de cálculo dental históricas y modernas se congelaron a -80 °C hasta la extracción del metabolito. La descalcificación de las muestras se realizó según Velsko et al.23 con una ligera modificación: las muestras (20 mg) se pulverizaron suavemente en un mortero de ágata, se colocaron en viales de vidrio estériles y se descalcificaron con 100 μL de ácido fórmico al 4% (v/v) en agua a 4 ° C durante 18 días realizando sonicación a intervalos regulares. Las muestras que iban a someterse a análisis UHPLC-HRMS en modo ESI− se neutralizaron mediante la adición de 15 µL de una solución de hidróxido de amonio 5 M. Finalmente, a las muestras se les adicionó 300 µL de una solución de acetonitrilo/metanol 1:1 (v:v), las cuales se centrifugaron a 12,000xga 4 °C por 30 min. A continuación, se recogió el sobrenadante y se sometió al análisis UHPLC-HRMS. Se utilizó como muestra de control de calidad una muestra obtenida mezclando los extractos tanto del duque Alessandro Farnese como de su esposa.

La separación cromatográfica se realizó en un sistema binario Acquity UHPLC I-Class (Waters) utilizando una columna Atlantis™ Premier BEH™ C18 AX de 1,7 μm (2,1 × 100 mm) (Waters), termostatizada a 40 °C. La fase móvil constaba de agua (disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B), ambos con un 0,1 % (v/v) de ácido fórmico. El caudal fue de 0,4 ml/min y el volumen de inyección fue de 8 μl. Se llevó a cabo una elución en gradiente lineal de varios pasos en las siguientes condiciones: el solvente B se ajustó al 2 % durante 1 min, seguido de un gradiente lineal al 60 % en 6 min, luego al 95 % en 1,5 min, se mantuvo durante 1,5 min antes de la columna. reequilibrio (5 min). La elución se realizó en 10 min.

Los análisis HRMS se realizaron en un espectrómetro de masas Synapt G2-Si HDMS QTOF (Waters SpA, Milán, Italia) con ionización por electropulverización (ESI) Zspray™ (Waters) tanto en modos de iones positivos (PI) como negativos (NI). La corrección de masa durante las corridas cromatográficas se realizó utilizando una solución de leucina-encefalina (50 ng/mL en acetonitrilo/agua, 50:50 (v/v) con ácido fórmico al 0,1 %) como masa de bloqueo, infundiéndola a través del sistema LockSpray™ (Waters ) con un intervalo de 15 s. Los experimentos se realizaron en modo de resolución (20000 FWHM). Los parámetros de operación fueron los siguientes: voltaje capilar, 0.80 y 0.50 kV en ESI+ y ESI− respectivamente; tensión de cono, 50 V; temperatura de la fuente, 150 °C; compensación de fuente 80 V; temperatura de desolvatación, 600 °C; gas de cono, 50 L/h; gas de desolvatación, 1000 L/h; presión del nebulizador 6,5 bar. Los espectros se adquirieron operando en modo de adquisición MSE independiente de los datos aplicando 5 V como energía de colisión para el perfil de baja energía y usando una rampa de energía de colisión de 25 a 45 V para el perfil de alta energía.

Los datos de UHPLC-HRMS se registraron en archivos *.raw utilizando el software MassLynx (v4.2) (Waters).

El análisis de datos se realizó procesando los datos sin procesar en el software Progenesis QI (Waters, Milford, MA, EE. UU.). El software permite el análisis de visualización de datos, la creación de mapas 2D y el análisis de cromatogramas y espectros. El programa proporciona alineación automática de señales, picos de picos, deconvolución y normalización54,55. Se consideraron los siguientes aductos: [M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+H2O+H]+, [M−H2O+H] +, [M+2H]2+, [M+2Na]2+, [M+2Na−H]+, [2M+H]+, [2M+Na]+, [M+H+Na]2+ en PI, y [M−H]−, [M+H2O−H]−, [M−H2O−H]−, [M+HCOO]−, [2M−H]−, [M+Na−2H] −, [M+K−2H]− en NI.

Los datos se filtraron estableciendo una variabilidad intragrupo máxima del 10 %, un valor de análisis de poder > 0,8 y un cambio mínimo de 3 veces en comparación con el método en blanco.

Se realizó PCA para explorar el conjunto de datos y obtener las características capaces de diferenciar muestras pertenecientes a Duke Alessandro Farnese y Maria D'Aviz. La identificación de los compuestos se realizó comparando los espectros con los almacenados en diferentes bibliotecas en línea de ChemSpider, a saber, HMDB, FooDB, E. coli Metabolome Database, Yeast Metabolome Database, LipidMAPS, NPAtlas y KEGG Database, utilizando una tolerancia de error de masa de 5 ppm para iones precursores y 10 ppm para iones de fragmentos.

Las abreviaturas de glicerofosfolípido LIPID MAPS® (PC, PE, etc.) se utilizan aquí para referirse a los analitos identificados.

Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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El costo del software Progenesis QI utilizado para esta investigación experimental fue financiado por el Ministerio de Universidades e Investigación (Decreto Ministerial n.º 737 del 25/06/2021) y cofinanciado por la Universidad de Parma a través del "Programa de Actualización de Instrumentación Científica 2022". Este trabajo se ha beneficiado del equipo y el marco de la Iniciativa COMP-HUB, financiada por el programa 'Departamentos de Excelencia' del Ministerio italiano de Educación, Universidad e Investigación (MIUR, 2018–2022).

Departamento de Química, Ciencias de la Vida y Sostenibilidad Ambiental, Universidad de Parma, Parco Area Delle Scienze 17/A, 43124, Parma, Italia

Nicolo' Riboni, Federica Bianchi, Monica Mattarozzi y Maria Careri

Departamento de Medicina y Cirugía, Centro Universitario de Odontología, Universidad de Parma, Via Gramsci 14, 43126, Parma, Italia

Marianna Peracchia y Marco Meleti

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Conceptualización: FB, NR, M.Ma.; Investigación: NR, FB, M.Ma., MP, M.Me.; Metodología: NR, FB, M.Ma., MC; Redacción—borrador original: NR, FB; Redacción—revisión y edición: NR, FB, M.Ma., MP, M.Me., MC

Correspondencia a Nicolo' Riboni o Federica Bianchi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Riboni, N., Bianchi, F., Mattarozzi, M. et al. Espectrometría de masas de alta resolución con cromatografía líquida de rendimiento ultraalto para el análisis metabolómico del cálculo dental de Duke Alessandro Farnese y Maria D'Aviz. Informe científico 13, 8967 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36177-2

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Recibido: 18 diciembre 2022

Aceptado: 30 de mayo de 2023

Publicado: 02 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36177-2

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