Generación de un parásito mutador para impulsar el descubrimiento de resistomas en Plasmodium falciparum

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3059 (2023) Citar este artículo

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La evolución in vitro de la resistencia a los medicamentos es un enfoque poderoso para identificar objetivos antipalúdicos; sin embargo, los obstáculos clave para provocar la resistencia son el tamaño del inóculo del parásito y la tasa de mutación. Aquí buscamos aumentar la diversidad genética del parásito para potenciar las selecciones de resistencia mediante la edición de residuos catalíticos de la ADN polimerasa δ de Plasmodium falciparum. Los ensayos de acumulación de mutaciones revelan una elevación de ~5 a 8 veces en la tasa de mutación, con un aumento de 13 a 28 veces en las líneas bajo presión de fármacos. Tras el desafío con el inhibidor de espiroindolona PfATP4 KAE609, se obtiene un alto nivel de resistencia más rápidamente y con inóculos más bajos que los parásitos de tipo salvaje. Las selecciones también producen mutantes con resistencia a un compuesto "irresistible", MMV665794, que no logró generar resistencia con otras cepas. Validamos las mutaciones en un gen previamente no caracterizado, PF3D7_1359900, que denominamos proteína de resistencia a la quinoxalina (QRP1), como causa de la resistencia a MMV665794 y un panel de análogos de quinoxalina. El mayor repertorio genético disponible para este parásito "mutador" se puede aprovechar para impulsar el descubrimiento del resistoma de P. falciparum.

El descubrimiento de fármacos antipalúdicos ha estado buscando activamente medicamentos nuevos o mejorados para tratar y, en última instancia, eliminar la malaria. Las terapias combinadas actuales de primera línea basadas en artemisinina (ACT) para Plasmodium falciparum se han visto comprometidas por la aparición de parásitos que son menos susceptibles tanto a la artemisinina como a los medicamentos asociados en el sudeste asiático, un epicentro de la resistencia a los antipalúdicos1,2. Además, la resistencia a la artemisinina es una amenaza para la salud pública de las personas que viven en regiones endémicas de todo el mundo, como lo ejemplifican los informes recientes sobre la aparición de mutaciones kelch13 en aislamientos de Ruanda y Uganda que reducen la susceptibilidad a la artemisinina3,4. Se han descubierto muchos compuestos antipalúdicos prometedores con buena potencia y actividad en múltiples etapas mediante el cribado basado en fenotipos de células completas5. Sin embargo, este enfoque presenta dificultades para la optimización de plomo debido a la falta de conocimiento del objetivo molecular. Una comprensión más profunda del objetivo del fármaco, el modo de acción y el mecanismo de resistencia podría conducir al diseño de mejores medicamentos que puedan resistir la resistencia a los medicamentos6,7,8. Además, el conocimiento de la diana del fármaco o del gen de resistencia proporciona marcadores moleculares para la vigilancia epidemiológica genómica en el campo para monitorear la propagación y la contención de la resistencia a los medicamentos9,10.

La evolución in vitro de la resistencia a los medicamentos seguida del análisis del genoma completo se ha convertido en un enfoque clave para la identificación de objetivos de medicamentos al ayudar a definir los modos de acción, así como los mecanismos y las propensiones a la resistencia11,12,13. Una selección típica de resistencia in vitro se realiza utilizando inóculos de parásitos que van desde 105 a 109 parásitos, que se exponen a un compuesto antipalúdico en una concentración capaz de matar a todos los parásitos sensibles a los medicamentos8,14,15. Luego, los parásitos recrudescentes pueden someterse a la secuenciación del genoma completo para identificar el gen subyacente responsable del fenotipo de resistencia. El principal obstáculo para el éxito es la prolongación o, en algunos casos, la completa incapacidad para seleccionar parásitos resistentes, independientemente del régimen de selección o de la cepa. Por lo tanto, este proceso que requiere mucho tiempo y trabajo puede no identificar un objetivo molecular o un mecanismo de acción definido para los compuestos de consulta. Por ejemplo, en un conjunto de selecciones de resistencia in vitro con 48 compuestos por el Malaria Drug Accelerator Consortium (MalDA), 23 compuestos produjeron parásitos resistentes con resistencia observada después de 15 a 300 días16. Los compuestos que no logran producir parásitos resistentes después de múltiples intentos y condiciones se han denominado "irresistibles"17. Aunque puede haber múltiples razones posibles para que los compuestos sean aparentemente "irresistibles", su baja propensión a la resistencia es una cualidad atractiva desde la perspectiva del descubrimiento de fármacos antipalúdicos y, por lo tanto, sería valioso comprender su mecanismo de acción.

La capacidad de seleccionar un parásito con una mutación protectora depende, al menos en parte, del tamaño del inóculo con suficiente variación genética. Sin embargo, por razones de practicidad técnica, el inóculo máximo para las selecciones de resistencia in vitro normalmente tiene un tope de ~5 × 109 parásitos por matraz (~10 % de parasitemia con 3 % de hematocrito en un cultivo de 170 ml), órdenes de magnitud menores de lo que puede ocurrir en un ser humano infectado. Los tamaños de cultivo más grandes y los tiempos de selección prolongados también consumen más compuesto, lo que puede ser limitante. Se ha demostrado que varias cepas de laboratorio, así como aislamientos de campo recolectados del epicentro de la resistencia a los medicamentos en el oeste de Camboya, tienen un rango similar de tasas de mutación de alrededor de 10−9 a 10−10 sustituciones de base por sitio por ciclo de vida asexual18,19, 20,21.

En este trabajo, para aumentar la diversidad genética representada en un volumen de cultivo dado y potencialmente acortar la escala de tiempo experimental de selección, usamos CRISPR-Cas9 para generar un parásito Dd2 mutante de P. falciparum que tiene una actividad de corrección deficiente de la ADN polimerasa. Subunidad catalítica δ, inspirada en un enfoque similar en el parásito de la malaria de roedores Plasmodium berghei22,23. Mostramos que esta línea de P. falciparum diseñada tiene una mayor tasa de mutación, lo que reduce el inóculo y acorta el tiempo necesario para seleccionar la resistencia a KAE609, un compuesto con un objetivo conocido24. Cuando se desafió con un compuesto irresistible previamente identificado MMV665794 que había fallado anteriormente en selecciones con parásitos 3D7 y Dd2 de tipo salvaje16,25, obtenemos múltiples clones resistentes con mutaciones en un gen de función desconocida, PF3D7_1359900. La edición CRISPR-Cas9 de estas mutaciones candidatas en parásitos de tipo salvaje confiere un nivel similar de resistencia a la línea seleccionada, lo que demuestra el papel de este gen en la resistencia a los compuestos basados en quinoxalina. Nuestros resultados respaldan el potencial de este parásito "mutador" para identificar nuevos objetivos antipalúdicos y comprender los mecanismos de resistencia a los medicamentos.

Para aumentar el repertorio genético de los parásitos P. falciparum en cultivo, nuestro objetivo era generar parásitos con actividad de corrección de pruebas 3ʹ−5ʹ deteriorada a partir de la subunidad catalítica de la ADN polimerasa δ (PF3D7_1017000) para aumentar el nivel de mutaciones espontáneas basales, basado en sobre trabajos previos en levaduras y el parásito de la malaria en roedores Plasmodium berghei22,23,26. La ADN polimerasa replicativa de alta fidelidad δ es una enzima importante para la síntesis de la hebra retrasada y contiene actividad de exonucleasa 3ʹ−5ʹ que puede eliminar los nucleótidos mal incorporados durante la replicación del ADN27,28. La interrupción de dos residuos catalíticos conservados del dominio exonucleasa de la ADN polimerasa δ (Fig. 1 complementaria) conduce a una actividad de corrección de pruebas 3ʹ−5ʹ deteriorada, lo que da como resultado una fidelidad reducida en la replicación del ADN. Esto provoca un aumento en la variación de la secuencia de nucleótidos y una mayor tasa de mutación en el genoma29,30. Los dos residuos catalíticos conservados de la subunidad de corrección de pruebas 3ʹ−5ʹ de P. falciparum, D308 y E310, se reemplazaron con alanina usando CRISPR-Cas9 en el fondo de la cepa Dd2 (Fig. 1A, B).

A Los residuos D308 y E310 se reemplazaron por alanina en P. falciparum Dd2 mediante el uso del plásmido pDC2-Cas9-gRNA que contiene el sgRNA, Cas9 y la plantilla donante. Se indican los dos sitios de unión de sgRNA y las mutaciones de escudo silencioso. B Los parásitos editados con CRISPR-Cas9 se seleccionaron con WR99210 5 nM y los clones editados se aislaron mediante dilución limitante. Se seleccionaron tres parásitos mutantes clonales de ADN polimerasa δ (Dd2-Polδ) para la secuenciación del genoma completo y el ensayo de acumulación de mutaciones. C Aptitud del parásito mutante Dd2-Polδ. Los ensayos de aptitud competitivos mezclaron la línea de referencia fluorescente Dd2-GFP en una proporción de 1:1 con el clon H11 de Dd2-WT o Dd2-Polδ. El crecimiento se determinó mediante citometría de flujo cada dos días durante un total de 20 días, con la proporción de parásitos positivos para GFP en comparación con el total de glóbulos rojos infectados detectados por MitoTracker Deep Red. Se realizaron dos experimentos biológicos independientes (n = 2) con triplicados técnicos, los datos se presentan como valores medios +/−SD. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se predice que la ADN polimerasa δ de P. falciparum es esencial para la supervivencia del parásito31. Para examinar si la ablación de la función de corrección de pruebas de la ADN polimerasa δ incurrió en un costo de aptitud para el parásito, realizamos un ensayo de aptitud competitivo. Dd2-GFP, un parásito diseñado que expresa fuertemente la proteína de fluorescencia verde (GFP), se utilizó como referencia de crecimiento32. La línea Dd2-GFP de referencia se mezcló en una proporción de 1:1 con Dd2 de tipo salvaje (Dd2-WT) o con el mutante δ de la ADN polimerasa Dd2 (Dd2-Polδ), y las proporciones relativas de las dos líneas se midieron por flujo. citometría cada dos días durante 20 días (~10 generaciones). Dd2-Polδ mostró solo una aptitud ligeramente reducida en comparación con Dd2-WT en función de la rapidez con que cada línea pudo superar a la referencia Dd2-GFP de proliferación más lenta (Fig. 1C).

Para evaluar los cambios en la diversidad de secuencias de nucleótidos y la tasa de mutación, realizamos un ensayo de acumulación de mutaciones en combinación con la secuenciación del genoma completo (Fig. 2A), comparando Dd2-Polδ con Dd2-WT. Se cultivaron tres clones de Dd2-Polδ (E8, F11, H11) y un clon de Dd2-WT en medio completo de forma continua durante 100 días (~50 generaciones) (Fig. 2A). Los parásitos se recogieron cada 20 días y los clones se aislaron mediante dilución limitante. Se seleccionaron al azar un total de 12 clones de Dd2-WT y 37 clones de Dd2-Polδ, correspondientes a uno a tres clones por punto de tiempo, para la secuenciación del genoma completo. Los genomas de todos los parásitos se asignaron al genoma de referencia Dd2 (PlasmoDB-44_PfalciparumDd2_Genome). El genoma central de Dd2 que comprende regiones codificantes y no codificantes se empleó como referencia para llamadas de variantes de un solo nucleótido (SNV). La familia de genes del antígeno de superficie variante (var) y la región subtelomérica de todos los cromosomas se excluyeron del genoma central. Las coordenadas del genoma central de Dd2 se definen en la Tabla complementaria 1. Los SNV de novo para cada uno de los clones se determinaron por comparación con sus líneas parentales en el día 0. El número de SNV de novo en Dd2-WT fue en promedio inferior a 1 SNV por clon en la secuencia de codificación durante el período de cultivo de 100 días. En contraste, cada uno de los clones Dd2-Polδ tenía en promedio 3 a 6 SNV por clon en las regiones de codificación (exoma) (Fig. 2B, Fig. 2A, B complementaria y Tabla complementaria 2 y Datos complementarios 1). La diferencia en el número de SNV en las regiones no codificantes entre los clones Dd2-WT y Dd2-Polδ fue menos pronunciada (Fig. 2B). No obstante, cada uno de los clones Dd2-Polδ tenía una mayor cantidad de SNV de todos los tipos, en particular, variantes no sinónimas, distribuidas en los 14 cromosomas (Fig. 2C y Fig. 3A, B complementarias). Examinamos si había grupos de mutaciones (que surgieran dentro de 20 pb), identificando 12 ejemplos, sin embargo, todos estaban en regiones intergénicas ricas en AT (Tabla complementaria 3). Identificamos solo cuatro genes que contenían múltiples mutaciones sin sentido (Fig. 3C complementaria). La comparación de las sustituciones de pares de bases para los eventos de transición (Ts) y transversión (Tv) mostró una disminución moderada en la relación Ts:Tv en Dd2-Polδ y un aumento en las transiciones G:C → A:T de 2-4 veces (Fig. .4A, B).

Un ensayo de acumulación de mutaciones que compara Dd2-WT con tres clones de Dd2-Polδ. Todas las líneas se cultivaron en paralelo durante 100 días (~50 generaciones). Se tomaron muestras de parásitos para el aislamiento clonal cada 20 días y posteriormente se recolectaron para la extracción de ADN genómico. La secuenciación del genoma completo se realizó en muestras recolectadas los días 0, 20, 40, 60, 80 y 100. B Se determinó el número de SNV únicos en las regiones del exoma, no codificantes y del genoma central de las líneas Dd2-WT y Dd2-Polδ. identificado restando de los SNV encontrados el día 0. Cada punto representa un clon, donde n = el siguiente número de clones independientes (WT:12, E8:12, F11:14, H11:11). Se muestra la línea mediana y el percentil 25/75 delimitado por la caja, con bigotes que muestran mín-máx. Una prueba de rango con signo de pares emparejados de Wilcoxon de dos colas mostró diferencias estadísticamente significativas para los clones Dd2-Polδ en relación con Dd2-WT, con valores de p como se indica (a: 0,0049; b: 0,0015; c: 0,002; d: 0,002; e:0,002; f:0,0298; g:0,0005; h:0,001). C Posición genómica de las SNV, código de color por línea parásita. D Las tasas de mutación de Dd2-WT (n = 12) y Dd2-Polδ clon E8 (n = 12), F11 (n = 14) y H11 (n = 11), los datos se presentan como media + /−SD (con valores e intervalos de confianza del 95% que se muestran en la Tabla 1). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, determinamos las tasas de mutación para Dd2-WT y los tres clones E8, F11 y H11 de Dd2-Polδ en función del número medio de SNV de novo para todos los clones de cada línea por generación, por genoma o exoma (ver Métodos). Cada uno de los clones Dd2-Polδ mostró tasas de mutación más altas que Dd2-WT, variando de 2 a 3 veces en el genoma central (regiones codificantes y no codificantes) a 5 a 8 veces en las regiones codificantes (exoma) (Fig. 2D, Tabla 1 y Datos Suplementarios 2). Los clones Dd2-Polδ F11 y H11 mostraron una tasa de mutación más alta que el clon E8 (Fig. 2D y Tabla 1) y, por lo tanto, todos los experimentos posteriores se realizaron con el clon H11. Para examinar si las modestas diferencias en la tasa de mutación entre clones podrían atribuirse a mutaciones espontáneas en los genes de reparación del ADN, también analizamos si los genes que desempeñan un papel en la reparación del ADN mutaron en las líneas Dd2-Polδ durante el período de cultivo de 100 días ( Datos complementarios 1). Aunque se observaron SNV dentro o cerca de los genes de reparación del ADN en cada una de las líneas Dd2-Polδ, no se compartió ningún SNV entre todos los clones. El clon E8 de Dd2-Polδ poseía SNV en la región codificante de dos genes de reparación de ADN putativos: un cambio G435E en la polimerasa de ADN theta (PfDd2_130037000) y un cambio N420K en la proteína de reparación de ADN RHP16 (PfDd2_120056000). El clon F11 de Dd2-Polδ tenía un cambio P225L en la helicasa 3 similar a RuvB (PfDd2_130068000). El clon H11 de Dd2-Polδ no tenía SNV en la región codificante de ningún gen de reparación de ADN; sin embargo, se observó un SNV en la región no codificante en la proximidad del antígeno nuclear 2 de células en proliferación (PfDd2_120031600) (Datos complementarios 1).

Con base en la suposición de que un repertorio genético más diverso disponible para los cultivos Dd2-Polδ aumentaría la eficiencia de selección de parásitos resistentes a los medicamentos, realizamos un experimento de prueba de concepto comparando Dd2-WT con Dd2-Polδ usando un fármaco con un modo de acción bien caracterizado. KAE609 (cipargamin), actualmente en ensayos clínicos de fase II, se dirige al gen de ATPasa 4 de sodio tipo P de P. falciparum (Pfatp4, PF3D7_1211900) con SNV que se sabe que confieren resistencia24. Se realizó una selección de resistencia a fármacos in vitro con un rango de inóculos de partida fijados en 2 × 106, 2 × 107, 2 × 108 y 1 × 109 células parasitadas, cultivadas en presencia de 2,5 nM KAE609 (~5 veces IC50 de Dd2 -WT) en tres matraces independientes por inóculo.

Después de 5 días de tratamiento farmacológico, no se detectaron parásitos viables por microscopía. El recrudecimiento de Dd2-WT solo se observó con el inóculo inicial más alto de 1 × 109, con parásitos observados los días 18, 21 y 30 en los tres matraces de selección independientes. Por el contrario, la línea Dd2-Polδ devolvió parásitos el día 12 y con un inóculo inicial más bajo (Fig. 3A). Los tres frascos con 2 × 108 y 1 × 109 parásitos fueron positivos, y uno de los tres frascos con 2 × 107 parásitos también mostró parásitos recrudescentes el día 12. Ninguno de los tres frascos dio positivo para parásitos con el inóculo inicial de 2 × 106 (figura 3A).

Se cultivaron continuamente Dd2-WT (línea azul) y Dd2-Polδ (línea roja) en presencia de KAE609 2,5 nM (5 × IC50). Los inóculos de parásitos variaron de 2 × 106 a 1 × 109 células, en matraces por triplicado, y los parásitos se detectaron por microscopía durante el período de selección de 30 días. Los parásitos Dd2-Polδ se observaron el día 12 con el inóculo inicial de 2 × 107, 2 × 108 y 1 × 109, mientras que los parásitos Dd2-WT solo se detectaron con el inóculo 109, apareciendo en tres frascos los días 18, 21 y 30 , respectivamente. B Curvas de dosis-respuesta de KAE609 para líneas parentales no expuestas a la presión del fármaco y líneas seleccionadas por fármaco (R1-R3) para Dd2-WT (panel izquierdo) y Dd2-Polδ (panel derecho). Se muestra un ensayo representativo (con dos réplicas técnicas, las barras de error muestran SD), con valores de IC50 representados como media +/−SD derivados de las siguientes réplicas biológicas (Dd2-WT, n = 6; Dd2-R1, n = 3; Dd2-R2, n = 3; Dd2-R3, n = 3; DNA-Polδ, n = 6; Polδ-R1, n = 6; Polδ-R2, n = 6; Polδ-R3, n = 5). C Modelo AlphaFold de PfATP4 que muestra mutaciones de resistencia a KAE609 ubicadas en o cerca de los dominios transmembrana. Los residuos azules se originaron a partir de selecciones de Dd2-WT, los rojos de Dd2-Polδ. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Antes de la selección, las líneas parentales Dd2-WT y Dd2-Polδ tenían una IC50 similar de aproximadamente 0,3 a 0,6 nM. Las líneas seleccionadas por KAE609 del fondo Dd2-WT tenían valores IC50 en el rango de 3 a 9 nM (Fig. 3B). En comparación, las líneas seleccionadas por fármacos del fondo Dd2-Polδ fueron apreciablemente más resistentes con valores de CI50 de alrededor de 700–900 nM (Fig. 3B), tres órdenes de magnitud más altos que su línea parental.

Para identificar los determinantes de resistencia que impulsan estos fenotipos, se examinó el conjunto de líneas seleccionadas mediante la secuenciación del genoma completo, así como la secuenciación directa de Sanger del gen pfatp4. Ambos enfoques revelaron mutaciones en pfatp4 (PF3D7_1211900) en estas líneas resistentes, lo que provocó mutaciones de proteínas en L350H y G199V en el fondo Dd2-WT del matraz 1 y el matraz 3, respectivamente, y G358S en todas las líneas del fondo Dd2-Polδ (Datos complementarios 3). Se predice que las tres mutaciones se ubicarán dentro o cerca de la región transmembrana de PfATP433 (Fig. 3C). Las mutaciones L350H y G358S se informaron previamente en un experimento de resistencia in vitro en Dd2 y 3D7 respectivamente con la dihidroisoquinolona SJ733, otro compuesto dirigido a PfATP434. L350H también se seleccionó usando KAE609 en un aislado de Camboya25. Además de PfATP4, se observaron SNV no sinónimos en otros cinco genes (datos complementarios 3), lo que ilustra que, al seleccionar con la línea Dd2-Polδ, es posible que se requieran criterios adicionales para priorizar candidatos cuando no se dispone de conocimiento previo del objetivo. De los cinco genes adicionales (PF3D7_0318500, PF3D7_0520800, PF3D7_1002200, PF3D7_1004200, PF3D7_1428400), el examen de la pantalla de mutagénesis piggyBac31 identificó dos como no esenciales, la mutación de un tercer gen estaba en una región de baja complejidad y para el cuarto la mutación también se observó en algunos clones del experimento de acumulación de mutaciones sin fármaco y, por lo tanto, es probable que se trate de una mutación de fondo.

En general, estos resultados confirmaron que la línea Dd2-Polδ puede seleccionar parásitos resistentes a los medicamentos en el objetivo molecular esperado24,25,34, con un menor número de parásitos iniciales (2 × 107 frente a 1 × 109) y en un período de selección más corto que Dd2-WT (12 días frente a 18-30 días).

Luego desafiamos la línea Dd2-Polδ con un compuesto "irresistible". La clase de compuestos "irresistibles" generalmente se refiere a compuestos que no logran producir un parásito resistente a los medicamentos durante las selecciones in vitro con cepas estándar (típicamente Dd2 o 3D7). Identificar el mecanismo de acción de estos compuestos es de gran interés debido a su baja propensión a la resistencia35. MMV665794, también conocido como TCMDC-124162 (2-N,3-N-bis[3-(trifluorometil)fenil]quinoxalina-2,3-diamina), es un antipalúdico de andamiaje de quinoxalina identificado a partir de una pantalla fenotípica de alto rendimiento36. Las selecciones iniciales de resistencia a fármacos in vitro se realizaron con este compuesto en cepas 3D7 y Dd2 de tipo salvaje utilizando diferentes enfoques, pero sin éxito (Tabla complementaria 4).

Tratamos Dd2-Polδ y Dd2-WT con 95 nM (1 × IC50) del compuesto de quinoxalina de forma intermitente. Para maximizar la posibilidad de obtener una línea resistente, utilizamos un inóculo inicial alto de 1 × 109 parásitos por matraz, por triplicado (Fig. 4A). Después de 10 a 12 días de presión, no se pudieron detectar parásitos por microscopía para ambas líneas, y la presión del fármaco se eliminó después del día 20. Dd2-WT no se recuperó durante el período de exposición de 60 días (Fig. 4A), en consonancia con los resultados anteriores. selecciones fallidas (Tabla complementaria 4). Por el contrario, los tres frascos de la línea Dd2-Polδ se recuperaron el día 21. La concentración del fármaco se aumentó luego a 2 × IC50, lo que resultó en una supresión de parásitos. En el día 40, los cultivos se cambiaron a medio completo libre de drogas y en el día 60, se detectaron nuevamente parásitos en los tres matraces. Las líneas clonales aisladas de los parásitos seleccionados por fármacos tenían un aumento de la IC50 de aproximadamente 2 a 2,5 veces en comparación con la línea parental no expuesta a la presión del fármaco (Fig. 4B). Los parásitos de dos matraces proliferaron normalmente cuando se volvieron a exponer a una presión constante del fármaco a 2 × IC50, pero los parásitos del tercer matraz no sobrevivieron.

Un esquema de selección que muestra la incapacidad de desarrollar resistencia a MMV665794 con Dd2-WT, pero el aislamiento exitoso de la resistencia con Dd2-Polδ. Panel superior: Dd2-WT expuesto a 1 × IC50 (95 nM) durante 60 días. Panel inferior: la presión de selección de Dd2-Polδ se aumentó a 2 × IC50 (190 nM), con recrudecimiento observado después de 60 días en 3 matraces independientes, pero solo 2 de 3 matraces pudieron crecer de manera estable bajo la presión del fármaco. Los parásitos recrudescentes fueron desafiados adicionalmente con 3x y 4x IC50 pero no sobrevivieron. B Curvas de dosis-respuesta de MMV665794 para líneas parentales y las dos líneas resistentes (C1-2) que pudieron sobrevivir bajo una presión de 2 × IC50. Se muestra un ensayo representativo (dos réplicas técnicas, las barras de error muestran SD), con valores IC50 representados como valores medios +/−SD derivados de las siguientes réplicas biológicas (DNA-Polδ, n = 7; Polδ-R1, n = 5; Polδ-R2, n = 5). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar si se podía obtener una resistencia de mayor nivel, los cultivos de parásitos de dos matraces recrudescentes se dividieron en dos matraces más (cada uno con 4,5 × 108 parásitos) que se presionaron más a 3 × IC50 o 4 × IC50. Los parásitos murieron a los 4 días en ambos tratamientos y posteriormente se cultivaron en medio completo libre de fármaco (Fig. 4A). Sin embargo, ningún parásito se recuperó después de 60 días, lo que indica que solo se pudo obtener una resistencia de bajo nivel contra MMV665794.

Para identificar las mutaciones de resistencia causales en las líneas seleccionadas por MMV665794 (Fig. 4), realizamos la secuenciación del genoma completo en seis clones aislados de dos selecciones independientes. El único gen mutado en común entre todas las líneas seleccionadas con quinoxalina fue PF3D7_1359900 (PfDd2_130065800), que codifica una proteína de membrana de Plasmodium conservada de función desconocida. La proteína de 2126 aminoácidos codifica cuatro dominios transmembrana predichos (Fig. 5A). Cada uno de los 6 clones contenía uno de dos SNV distintos, ya sea G1612V (cuatro clones del matraz 2) o D1863Y (dos clones del matraz 3), equivalentes a G1616V y D1864Y en Dd2, respectivamente (Fig. 5A y Datos complementarios 3). No se detectaron nuevas variantes del número de copias en los clones seleccionados por fármacos (Datos complementarios 4).

Un PfQRP1 (PF3D7_1359900) codifica una proteína de 250 kDa con cuatro dominios transmembrana previstos. Las dos mutaciones G1612V y D1863Y encontradas en dos selecciones independientes con MMV665794 están ubicadas en un dominio C-terminal que comparte conservación con las hidrolasas α/β. B Modelo de los 656 residuos C-terminal (1471–2126) de PfQRP1 que muestra la supuesta tríada catalítica de Ser-Asp-His (amarillo) y las mutaciones de resistencia G1612V y D1863Y (púrpura). C, D Valores IC50 de CRISPR-Cas9 editado QRP1. Las líneas Dd2 que codifican las mutaciones equivalentes G1612V y D1863Y mostraron una susceptibilidad significativamente reducida frente a MMV665794 y resistencia cruzada frente a MMV007224, una molécula estructuralmente relacionada que comparte el andamiaje de quinoxalina, en comparación con Dd2-WT y controles editados silenciosos. Cada punto representa una réplica biológica, con n = 6 réplicas independientes con una media ± SD mostrada, y significación estadística en relación con los controles editados en silencio determinados por la prueba U de Mann-Whitney de dos caras. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para obtener una idea de la función potencial de PF3D7_1359900, que solo tiene ortólogos evidentes dentro de Apicomplexa (Fig. 5 complementaria), examinamos un modelo estructural de la región que contiene las mutaciones de resistencia utilizando trRosetta y AlphaFold37,38. Esta región está ubicada hacia el extremo C de la proteína, corriente abajo de los 4 segmentos transmembrana predichos (Fig. 5A). La comparación de la estructura de la proteína utilizando el servidor DALI indicó una posible homología estructural con esterasas/lipasas, con una supuesta tríada catalítica Ser-Asp-His ubicada muy cerca en el modelo de proteína y altamente conservada en los ortólogos (Fig. 5B y Fig. 5 complementaria), sin embargo, se requerirán más estudios para caracterizar cualquier posible actividad de hidrolasa.

Para validar las mutaciones seleccionadas por fármacos en PF3D7_1359900, generamos líneas editadas con CRISPR-Cas9 introduciendo el equivalente Dd2 de la mutación G1612V o D1863Y. Además, se generaron líneas de parásitos de control que solo se modificaron con las mutaciones silenciosas correspondientes (G1612sil y D1863sil) y las mutaciones de escudo de gRNA comunes a todas las líneas editadas. Ambas líneas mutantes, pero no los controles silenciosos, mostraron el mismo cambio modesto en IC50 a MMV665794 observado en los parásitos seleccionados por fármacos (Fig. 5C).

Para examinar si las mutaciones en PF3D7_1359900 habían surgido en el contexto de otros experimentos de evolución in vitro, examinamos la base de datos de SNV identificadas por Malaria Drug Accelerator Consortium en 262 líneas de P. falciparum seleccionadas con 37 compuestos e identificamos un solo clon con una mutación de cambio de marco en el residuo D100 de PF3D7_135990016. En particular, el clon había sido presionado con MMV007224, un compuesto con un andamiaje de quinoxalina similar al MMV665794 (Fig. 5D). La presencia de una mutación de cambio de marco cerca del comienzo de la proteína (Fig. 6A complementaria), más la mutagénesis en la pantalla del genoma completo de piggyBac31 indica que este gen no es esencial durante la etapa de sangre asexual.

Probamos si los parásitos editados con CRISPR que portan las mutaciones de resistencia a MMV665794 podrían conferir resistencia cruzada a su análogo, MMV007224. Tanto las líneas mutantes G1612V como D1863Y mostraron una resistencia de bajo nivel similar a MMV007224 como se observó con MMV665794 (Fig. 5D). Del mismo modo, la línea seleccionada por MMV007224 que lleva la mutación de cambio de marco en PF3D7_1359900 mostró una resistencia de bajo grado equivalente a MMV665794, pero no a los compuestos no relacionados KAE609 y cloroquina (Fig. 6B complementaria).

Estos hallazgos sugieren que la proteína codificada por PF3D7_1359900, que hemos designado como proteína 1 de resistencia a la quinoxalina (PfQRP1), puede conferir resistencia general a los compuestos similares a la quinoxalina. Para explorar si las mutaciones en PfQRP1 median la resistencia más ampliamente contra los compuestos con un andamio similar a la quinoxalina, sintetizamos seis análogos de MMV665794 (material complementario) y obtenemos comercialmente cinco análogos adicionales, evaluando este panel contra el parásito editado con CRISPR QRP1-D1863Y. Todos menos un análogo de quinoxalina mostraron un bajo nivel de resistencia en la línea mutante QRP1 significativamente diferente de los controles, en contraste con BQR695 y KDU69139, los antipalúdicos dirigidos a la fosfatidilinositol 4-quinasa se esperaba que tuvieran un modo de acción no relacionado con los compuestos de quinoxalina (Fig. 7). Nuestros datos sugieren que PfQRP1 es una proteína previamente no caracterizada que confiere resistencia de bajo grado a los compuestos basados en quinoxalina.

La capacidad aumentada de la línea Dd2-Polδ para generar resistencia tanto a KAE609 como a MMV665794 fue consistente con un aumento en la diversidad genética disponible para la selección. Determinamos la tasa de mutación de Dd2-Polδ bajo la presión del fármaco, comparando parásitos seleccionados con KAE609, MMV665794 y dos selecciones de resistencia adicionales con los compuestos irresistibles no relacionados Salinopostin A y KM15HA40,41. Los SNV de novo de las líneas seleccionadas con fármacos se determinaron en comparación con las líneas parentales utilizadas en el lote correspondiente de experimentos de selección (Fig. 6A y Fig. 8 complementaria). El cambio de la tasa de mutación en estas líneas se comparó con Dd2-WT sin presión, lo que refleja los factores combinados de una corrección defectuosa de la ADN polimerasa δ y la presión del fármaco. Dd2-Polδ bajo la presión del fármaco mostró una mayor tasa de mutación en las regiones codificantes de 13 a 28 veces, y ~ 3 a 6 veces en el genoma en relación con Dd2 de tipo salvaje sin presión de drogas (Fig. 6B y Tabla 1). En comparación con Dd2-Polδ no tratada con fármacos, estos cambios se traducen en un aumento de ~1,5 a 3,5 veces en las regiones codificantes y esencialmente sin cambios (~0,8 a 1,9 veces) en todo el genoma. La relación Ts:Tv de Dd2-Polδ bajo la presión del fármaco varió y no mostró una tendencia discernible (Fig. 9 complementaria).

A El número de SNV en Dd2-Polδ seleccionados con diferentes compuestos antipalúdicos. Estas selecciones, excepto KAE609, no produjeron parásitos resistentes con Dd2-WT. Tenga en cuenta el mayor número de SNV en las selecciones de KAE609 con Dd2-Polδ en comparación con Dd2-WT (consulte la Tabla complementaria 6). Cada punto representa un clon secuenciado, con el número de clones independientes entre paréntesis: Dd2-WT + KAE609 (2); Dd2-Polδ+KAE609 (3); Dd2-Polδ+MMV665794 (6); Dd2-Polδ+SalA (6); Dd2-Polδ+KM15HA (2). Las barras azul y naranja representan el exoma y el núcleo del genoma, respectivamente, y se muestran las medias ± DE. B Las tasas de mutación de Dd2-WT y Dd2-Polδ bajo la presión del fármaco. Cada punto representa un clon secuenciado, con el número de clones independientes bajo el fármaco como se indica para (A) anterior, y como sigue: Dd2-WT-fármaco (12); Dd2-Polδ-fármaco (11). Los datos se presentan como media +/−SD (consulte la Tabla 1 para conocer los valores y los intervalos de confianza del 95 %). Los datos del clon H11 de Dd2-WT y Dd2-Polδ no tratados con fármacos (ver Fig. 2D) se incluyen para comparación. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La tasa de mutación de Dd2-WT bajo la presión del fármaco también aumentó ~ 3 veces en las regiones de codificación en relación con Dd2-WT sin presión del fármaco. Sin embargo, esto se mantuvo relativamente sin cambios en todo el genoma (Tabla 1), de acuerdo con informes anteriores18.

En conjunto, nuestros datos indican que la línea Dd2-Polδ tiene una mayor tasa de mutación que proporciona un mayor potencial de selección de parásitos resistentes a los medicamentos, incluso con compuestos previamente irresistibles, mientras que es lo suficientemente baja como para mantener la integridad del genoma y la solidez del parásito.

Proponemos que el parásito P. falciparum mutador Dd2-Polδ es una herramienta nueva y poderosa para identificar objetivos y mecanismos de resistencia de los antipalúdicos. La lectura de prueba defectuosa que resulta de la modificación diseñada de la ADN polimerasa δ da como resultado una mayor tasa de mutación espontánea. Al expandir el espacio de secuencias genéticas en parásitos cultivados, revelamos una capacidad mejorada para producir líneas tolerantes a fármacos bajo regímenes de evolución in vitro de resistencia. Observamos que para las selecciones con un fármaco con un modo de acción conocido, KAE60924, obtuvimos parásitos resistentes con un inóculo 10-100 veces menor y en una ventana de selección más corta utilizando la línea Dd2-Polδ. En el caso de un compuesto irresistible, la quinoxalina MMV665794, la línea Dd2-Polδ produjo parásitos moderadamente resistentes donde las selecciones anteriores habían fallado. Una consideración potencial que surge de la elevada tasa de mutación es la presencia de más mutaciones genéticas no relacionadas que ocurren durante la selección de resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, será importante secuenciar al menos dos clones de más de una selección independiente, junto con la validación de la edición del genoma, para identificar las mutaciones causales.

El uso de un ensayo de acumulación de mutaciones combinado con la secuenciación del genoma completo nos permitió determinar una tasa de mutación basada en los datos del genoma completo, que no depende de los loci indicadores representativos42. Seguimos parásitos de tipo salvaje y Dd2-Polδ durante 100 días para derivar una tasa de mutación. Para los parásitos Dd2-Polδ, esta tasa fue aproximadamente 3 veces mayor que Dd2-WT en todo el genoma, y hasta 8 veces cuando se comparan los cambios en el exoma, con la advertencia de que la tasa de mutación para el exoma de tipo salvaje puede ser subrepresentados como 7 de 13 clones Dd2 parentales no adquirieron SNV durante el período de tiempo del experimento. Por lo tanto, Dd2-Polδ requiere una cantidad menor de parásitos para que se produzca una mutación en su genoma haploide que Dd2-WT (parásitos 5.08E7 frente a 1.63E8; Datos complementarios 2).

En presencia de compuestos antipalúdicos, la tasa de mutación a través del exoma fue de 1,5 a 3,5 veces mayor en la línea Dd2-Polδ en relación con la línea no tratada. Aunque una explicación puede ser el estrés mutagénico potencial de los tratamientos en sí mismos, la tasa de mutación en todo el genoma aumentó solo modestamente (0,8 a 1,9 veces) en comparación con las líneas no tratadas con fármacos, de acuerdo con un estudio anterior que encontró menos de Aumento de 3 veces la tasa de mutación bajo la selección de atovacuona18. Este aumento aparente dentro del exoma puede reflejar la selección positiva de mutaciones funcionales que afectan la capacidad de sobrevivir a la presión del fármaco o de mantener la aptitud al apoyar las mutaciones de resistencia primaria. Alternativamente, los clones que acumulan un mayor número de mutaciones transeúntes pueden seleccionarse en ausencia de la presión del fármaco, pero superarían a los clones con una menor carga de mutaciones si poseen una resistencia fortuita al SNV.

El fenotipo mutador leve de Dd2-Polδ puede ser ventajoso en dos aspectos, al no crear demasiadas mutaciones bajo selección para permitir la identificación de las probables mutaciones causales y al mantener la aptitud a pesar de la posible generación de mutaciones perjudiciales. En comparación con Dd2-WT, la línea Dd2-Polδ mostró solo una pérdida menor de aptitud y no observamos la reversión de las mutaciones modificadas D308A/E310A en la ADN polimerasa después de un cultivo a largo plazo. Por el contrario, el mutante equivalente de la ADN polimerasa δ en P. berghei mostró una reducción significativa en la aptitud y se observó la presencia de una mutación antimutadora en la ADN polimerasa δ22,23. La mayor tasa de mutación del mutante δ de la ADN polimerasa de P. berghei, aproximadamente 90 veces mayor que la del tipo salvaje, y potencialmente las condiciones de crecimiento más estrictas in vivo pueden explicar el mayor impacto en la aptitud del parásito en el parásito de la malaria de roedores. No se encontraron mutaciones de estos dos residuos en la ADN polimerasa δ en los aislados clínicos existentes en la base de datos Pf6K43.

Las mutaciones antimutadoras en las ADN polimerasas actúan para aumentar la fidelidad y pueden tener costos de aptitud inherentes (Herr et al., 2011). No observamos mutaciones antimutadoras conocidas en la ADN polimerasa δ en ninguno de los clones secuenciados de P. falciparum Dd2-Polδ, tal vez un reflejo de la presión selectiva limitada impuesta por la elevación moderada en la tasa de mutación. No obstante, los tres clones de Dd2-Polδ poseían SNV en o cerca de genes que desempeñan funciones en la replicación y reparación del ADN, aunque se desconoce si estas mutaciones confieren efectos funcionales. El SNV no codificante cercano al antígeno nuclear de proliferación celular 2 (PCNA2) en el clon H11 (Datos complementarios 1) puede potencialmente modular la expresión génica de pcna2, una de las dos proteínas PCNA en P. falciparum, para facilitar la alta procesividad de la ADN polimerasa δ44, 45,46. Además, el clon E8 de Dd2-Polδ, que mostró una tasa de mutación más baja que los otros dos clones (F11 y H11), tiene un SNV no sinónimo (G435E) en la ADN polimerasa putativa theta (PF3D7_1331100) Gly435, equivalente a Gly226 en ADN polimerasa θ humana que se encuentra en la región de la caja helicasa DEAD/DEAH. La ADN polimerasa θ posee una actividad de ADN polimerasa y helicasa de baja fidelidad, y desempeña un papel en la reparación del ADN, como la reparación de roturas de doble cadena a través de la unión canónica de extremos no homólogos, la unión de extremos mediada por microhomología y la recombinación homóloga. La polimerasa θ tiene un impacto en la estabilidad del genoma y en la reparación de roturas formadas por estructuras cuádruples G446,47.

La capacidad de la línea Dd2-Polδ para generar parásitos resistentes se evaluó utilizando dos compuestos, KAE609 (cipagarmin) y MMV665794. KAE609, actualmente en ensayos clínicos de fase II, se dirige a la ATPasa de tipo P PfATP4 que es responsable del transporte de Na+ a través de la membrana plasmática del parásito (Rottmann et al., 2010; Spillman et al., 2013). Las tres mutaciones obtenidas de nuestras selecciones se encontraban en la región transmembrana predicha de PfATP4, en consonancia con la mayoría de las mutaciones observadas anteriormente (Rottmann 2010; Jimenez-Diaz et al., 2014; Viadya et al., 2015; Lee y Fidock, 2016). En particular, las selecciones con la línea Dd2-Polδ produjeron un mutante G358S que se observó recientemente en la mayoría de los tratamientos fallidos durante un ensayo de fase II de KAE609 (Schmitt et al., 2021), lo que indica que la evolución in vitro con esta línea puede producir resultados con relevancia clínica. Esta mutación de resistencia de alto nivel también se observó previamente en selecciones con un compuesto de dihidroisoquinolona (+)-SJ733 (Jimenez-Diaz et al., 2014), así como en selecciones paralelas de KAE609 con nuestra línea Dd2-Polδ por otro grupo48. Qui et al. generó una línea editada con CRISPR con G358S SNV, lo que demuestra que esta mutación es suficiente para impulsar un gran cambio en IC50 y mostró que protege la actividad Na+-ATPasa de PfATP4 de la inhibición por KAE609, pero a costa de reducir la afinidad de la proteína a Na+48. A pesar de este efecto funcional sobre PfATP4, los parásitos mutantes no tienen un alto costo de aptitud física48. Esto puede explicar en parte por qué solo observamos el mutante G358S en selecciones con la línea Dd2-Polδ, ya que puede superar a los mutantes de crecimiento más lento o menos resistentes en el cultivo a granel.

Además de obtener una resistencia más fácil con un menor número de parásitos, el principal potencial de la línea Dd2-Polδ es acceder a un nuevo espacio de secuencias para compuestos previamente irresistibles. Desafiamos la línea Dd2-Polδ con MMV665794, un compuesto irresistible con un andamiaje químico de quinoxalina y un grupo funcional similar a la flutamida16,49. Nuestras selecciones con Dd2-Polδ produjeron un parásito moderadamente resistente después de aproximadamente 60 días, mientras que las selecciones con líneas 3D7 o Dd2 de tipo salvaje fallaron (Tabla complementaria 4)16.

La secuenciación del genoma completo de clones resistentes a MMV665794 reveló mutaciones en PF3D7_1359900 en los seis clones seleccionados de dos matraces de selección independientes. Se predice que el gen no es esencial según un solo sitio de inserción piggyBac de aproximadamente 0,8 kb en el gen31 de 7 kb, así como nuestra observación de un mutante de cambio de marco cerca del comienzo del gen. La edición CRISPR-Cas9 de las mutaciones G1612V y D1863Y confirmó su papel en el fenotipo de resistencia. Además, estos parásitos mostraron resistencia cruzada a varios compuestos similares a la quinoxalina estructuralmente relacionados. Se predice que la proteína codificada por PF3D7_1359900, que hemos denominado proteína 1 de resistencia a la quinoxalina (PfQRP1), contiene 4 dominios transmembrana hacia el extremo N-terminal y un dominio hacia el extremo C-terminal dentro del cual se ubican las mutaciones de resistencia que comparte la conservación con hidrolasas convencionales. La naturaleza no esencial de PfQRP1 sugiere que este no es el objetivo de los compuestos de quinoxalina sino un mecanismo de resistencia. Aunque no sabemos si las mutaciones G1612V y D1863Y confieren pérdida de función, la presencia de la mutación de cambio de marco en la línea seleccionada por MMV007224 es sugestiva. No se sabe si QRP1 actúa directamente sobre los compuestos de quinoxalina, de manera similar a la esterasa PfPARE que convierte un profármaco en una forma activa50 o tiene un efecto indirecto. No obstante, el nivel de resistencia provocado es modesto con solo una pérdida doble de potencia. Por lo tanto, la dificultad para obtener resistencia a MMV665794, junto con el cambio limitado en la potencia, sugiere que los compuestos de esta clase química pueden ser candidatos antipalúdicos prometedores para una mayor exploración. De manera más general, a medida que se exploran más compuestos anteriormente "irresistibles" utilizando la línea Dd2-Polδ, será interesante determinar si este enfoque produce con mayor frecuencia mutaciones en genes de resistencia en lugar de objetivos directos. La naturaleza de los compuestos "irresistibles" puede significar que la mutación del objetivo directo da como resultado un parásito no viable, o que el compuesto puede atacar múltiples objetivos o objetivos del origen del huésped. Estas posibilidades pueden conducir a mutaciones de resistencia como el resultado más probable.

La evolución de la resistencia in vitro, junto con el análisis del genoma completo, ha demostrado ser una técnica de gran éxito para comprender el mecanismo de acción de nuevos compuestos, así como para identificar marcadores de resistencia a fármacos en el campo13,51. Una limitación de este enfoque ha sido la relativa dificultad de provocar resistencia a algunas clases de productos químicos. Al aumentar la complejidad genética de los cultivos in vitro, la línea de parásitos Dd2-Polδ desarrollada aquí tiene el potencial de reducir el inóculo del parásito, acelerar el tiempo de selección y permitir la exploración de compuestos previamente irresistibles.

Se empleó la cepa P. falciparum Dd2 para todas las manipulaciones genéticas usando CRISPR-Cas9. Para generar la línea "mutadora", los residuos de aminoácidos catalíticos conservados D308 y E310 de la subunidad catalítica δ de la ADN polimerasa (PF3D7_1017000) se mutaron a alanina. Se clonaron secuencialmente dos ARN de guía única (ARNsg) diferentes y una plantilla de reparación del donante (longitud de 699 pb, con homología flanqueante de 363 pb/289 pb) que albergaban las mutaciones dobles D308A/E310A con mutaciones de escudo adicionales para evitar la unión del complejo sgARN-Cas9. un solo plásmido que contiene SpCas9 y el marcador seleccionable hdhfr (ver Fig. 1A)52. Para introducir las mutaciones de resistencia putativas G1612V y D1863Y en PF3D7_1359900, se construyeron dos sgRNA y una plantilla de reparación del donante para cada mutación como se indicó anteriormente. Para G1612V se generó una plantilla donante de 746 pb (443 pb/235 pb de homología flanqueante), y para D1863Y se generó una plantilla donante de 671 pb (252 pb/307 pb de homología flanqueante). Los ARN guía se sintetizaron como oligocebadores (IDT). Las plantillas de reparación de donantes y las plantillas de donantes de control que codifican solo mutaciones silenciosas en los sitios objetivo fueron sintetizadas por GeneArt (Thermo Fisher Scientific). Los 5' y 3' de las plantillas de ADN del donante estaban flanqueados por una secuencia adicional de 20–21 pb con homología con el plásmido pDC2-Cas9-gRNA de destino para la inserción en los sitios AatII y EcoRI usando NEBuilder HiFi DNA Assembly52. Las construcciones de plásmido se verificaron mediante secuenciación de Sanger. Los cebadores de secuenciación de sgRNA y Sanger se muestran en la Tabla complementaria 5.

Los parásitos se cultivaron en medio completo RPMI 1640 (Gibco) que constaba de Albumax II al 0,5 % (Gibco), HEPES 25 mM (grado de cultivo), GlutaMAX 1x (Gibco), gentamicina 25 μg/mL (Gibco) y suministro de rojo humano O+. glóbulos rojos (GR) obtenidos de donantes sanos anónimos del Servicio Nacional de Sanidad Sangre y Trasplante (NHSBT) o Cruz Roja (Madrid, España). El uso de glóbulos rojos se realizó de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, con la aprobación del Comité de ética de investigación de NHS Cambridgeshire y el Comité de gestión de datos y materiales humanos del Instituto Wellcome Sanger para los experimentos realizados en el Reino Unido. Los glóbulos rojos se obtuvieron de forma ética y su uso en investigación estuvo de acuerdo con los términos de los consentimientos informados bajo un protocolo aprobado por el IRB/EC para experimentos realizados en España. Los parásitos se mantuvieron de forma rutinaria con una parasitemia del 0,5% al 3% con un hematocrito del 3% y se cultivaron bajo gas de malaria (1% O2, 3% CO2 y 96% N2). Se obtuvo una etapa de anillo síncrono mediante tratamiento con sorbitol al 5% en el ciclo previo a la electroporación. En el siguiente ciclo, la etapa de anillo (0-16 h) con 10% de parasitemia se recolectó para electroporación. El plásmido pDC2-Cas9-gRNA-donante se transfectó en la línea P. falciparum Dd2 usando un Gene Pulser Xcell (BioRad). Se mezclaron plásmidos que contenían sgRNA1 o sgRNA2 (50 µg) o una mezcla de ambos plásmidos (100 µg) con 150 µl de concentrado de glóbulos rojos infectados y parasitados y citomix completo (KCl 120 mM, CaCl2 0,2 mM, EGTA 2 mM, 10 MgCl2 mM, HEPES 25 mM, K2HPO4 5 mM, KH2PO4 5 mM; pH 7,6) para hacer un volumen total de 420 μl52. Los transfectantes se seleccionaron en medio completo que contenía WR99210 5 nM (Jacobus Pharmaceuticals) durante 8 días. Posteriormente se mantuvo el cultivo en medio completo libre de drogas hasta que reaparecieron los parásitos. Se realizó una dilución limitante para aislar parásitos editados por genes clonales (Fig. 1B). Los transfectantes de cultivos a granel y clonales se genotipificaron mediante PCR específica de alelo y secuenciación de Sanger. Los cebadores se muestran en la Tabla complementaria 5.

El ensayo de acumulación de mutaciones se realizó con Dd2-WT y tres clones de Dd2-Polδ. Se cultivaron parásitos en estadio mixto con una parasitemia del 1 al 5 % en 10 ml de forma continua durante 100 días. Los parásitos se extrajeron de los cultivos continuos los días 0, 20, 40, 60, 80 y 100 para el aislamiento clonal mediante dilución limitante en placas de 96 pocillos. Se propagaron de uno a tres clones de parásitos de cada punto de tiempo para la extracción de ADN genómico mediante DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen) para la secuenciación del genoma completo en un Hiseq X (Illumina).

El ensayo se realizó mezclando los parásitos de prueba y de control en una proporción de 1:1 con 1% de parasitemia cada uno. Dd2-GFP, una línea Dd2 que expresa la proteína fluorescente verde del promotor32 ER hsp70, se utilizó como parásito de referencia que compitió contra Dd2-WT o Dd2-Polδ en una placa de 6 pocillos. El hematocrito de los cultivos de la consulta y de la competencia se determinó utilizando el Cellometer Auto 1000 (Nexcelom Bioscience). La parasitemia se determinó mediante la tinción de parásitos con MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen) y el recuento con un citómetro de flujo CytoFlex S (Beckman Coulter) con el software CytExpert v2.4 y se analizó posteriormente con FlowJo v10, con recuentos y estadio del parásito confirmados mediante examen microscópico siguiendo Giemsa tinción (VWR Chemicals). Los glóbulos rojos no infectados se usaron como señal de fondo para activar el citómetro de flujo. La aptitud competitiva se determinó midiendo la parasitemia total mediante la tinción MitoTracker Deep Red y la proporción de parásitos de control positivos para GFP en el citómetro de flujo cada dos días durante 20 días (alrededor de 10 generaciones). Las muestras se prepararon en una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Costar) tomando 4 μL de cultivo en 200 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (Gibco) que contenía 100 nM de Mitotracker Deep Red FM. La placa se incubó a 37 °C durante 15 min y se sometió a análisis en el citómetro de flujo. Las puertas se configuraron para los canales FITC (ganancia 5 o 10) y APC (ganancia 3 o 5) para señales GFP y Mitotracker Deep Red FM, respectivamente. En la figura complementaria 10 se muestra una estrategia de activación representativa. Se realizaron dos experimentos biológicos independientes con tres réplicas técnicas.

Se utilizaron dos compuestos para la evolución in vitro de la resistencia, KAE609 (cipargamin) y MMV665794, un compuesto antipalúdico identificado en el Tres Cantos Antimalarial Set e incluido en el Medicines for Malaria Venture Malaria Box36,49. Para determinar el inóculo mínimo para la resistencia (MIR) para KAE609, se probaron tres matraces independientes que contenían cultivos en etapa anular de Dd2-WT y Dd2-Polδ clon H11 en un rango de inóculos que van desde 2 × 106, 2 × 107, 2 × 108 , y 1 × 109 parásitos. Cada matraz se cultivó continuamente en medio completo que contenía 2,5 nM (~ 5 × IC50) de KAE609. Esta concentración fue capaz de matar parásitos a un nivel indetectable por microscopía de frotis delgados teñidos con Giemsa (mínimo de 30 campos de 100 glóbulos rojos). La muerte del parásito y el recrudecimiento después del tratamiento farmacológico se controló mediante la tinción de Giemsa de frotis finos, con examen microscópico cada uno o dos días. Las selecciones con MMV665794 se realizaron con Dd2-WT y Dd2-Polδ con exposición intermitente al fármaco en tres matraces independientes (ilustrados en la Fig. 4A). Los parásitos en un inóculo inicial de 1 × 109 se expusieron continuamente a 95 nM de MMV665794 (1 × IC50) durante 20 días. Luego, Dd2-WT se mantuvo en medio completo libre de drogas hasta el día 60. Los parásitos Dd2-Polδ que reaparecieron después de la selección se expusieron posteriormente a un incremento del doble de MMV665794 a 190 nM hasta el día 40. Se eliminó la presión de la droga hasta que los parásitos se eliminaron. detectado, y la concentración se aumentó posteriormente a 3 × IC50 y 4 × IC50 con un inóculo de 4,5 × 108 parásitos. Para todas las líneas seleccionadas, los clones de parásitos se aislaron mediante dilución limitante y se propagaron durante 18 a 25 días. Los parásitos antes de la presión del fármaco y los parásitos supervivientes después de la presión del fármaco se recolectaron para la extracción de ADN genómico y la secuenciación del genoma completo.

Los ensayos de susceptibilidad a fármacos se realizaron en placas de 96 pocillos usando parásitos en etapa de anillo sincronizado preparados usando sorbitol al 5%. Los parásitos en etapa de anillo en el ciclo siguiente se diluyeron al 1 % de parasitemia con 2 % de hematocrito (concentración final en la placa de ensayo) para realizar el ensayo de concentración inhibidora del crecimiento medio máximo (IC50). El intervalo de concentración se preparó mediante una dilución en serie doble del compuesto en medio completo. Los parásitos no tratados o tratados con artesunato 5 μM y solo glóbulos rojos (2% de hematocrito) se incluyeron en la placa de ensayo como controles. El crecimiento del parásito se determinó después de 72 h de incubación del fármaco mediante el uso de tampón de lisis 2x que contenía 2 × SYBR Green I (Molecular Probes)53 y la medición en un FluorStar Omega v5.11. El análisis de IC50 se realizó con GraphPad Prism v8/v9 y la significación estadística se determinó mediante pruebas U de Mann-Whitney bilaterales. Todos los ensayos se realizaron en tres a seis experimentos biológicos independientes con dos réplicas técnicas cada uno.

Las muestras de parásitos se lisaron en saponina al 0,1 %, se lavaron con PBS 1x y se extrajo el ADN genómico (ADNg) utilizando el kit QIAamp DNA Blood Midi (Qiagen). La concentración de gDNA se cuantificó con el kit de ensayo Qubit dsDNA BR y se midió con un fluorómetro Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific) antes de la secuenciación. Las muestras se cortaron en fragmentos de alrededor de 450 pb y la biblioteca se construyó con el kit de biblioteca de ADN NEBNext UltraII (NEB), seguido de qPCR para la agrupación de muestras y la normalización para la plataforma de secuenciación Illumina. La secuenciación de extremos pareados (2 × 150 pb) y la secuenciación del genoma completo sin PCR se realizaron en un HiSeq X (Illumina)54. Las muestras seleccionadas por resistencia a Salinopostin A y KMHA15 se secuenciaron en una plataforma de secuenciación Illumina MiSeq o NextSeq 550, respectivamente, para obtener lecturas de extremos emparejados de 300 o 150 pb con una profundidad de cobertura promedio de 30x.

Las secuencias del genoma de los clones Dd2-Polδ se analizaron siguiendo el flujo de trabajo de mejores prácticas de GATK455. Las lecturas de secuenciación de extremos emparejados de cada clon de parásito se alinearon con P. falciparum 3D7 (PlasmoDB-44_Pfalciparum3D7) y la secuencia de referencia Dd2 (PlasmoDB-44_PfalciparumDd2) usando bwa mem (bwa/0.7.17 = pl5.22.0_2). Los duplicados de PCR fueron eliminados por GATK MarkDuplicates (picard/2.22.2-−0) (Tabla complementaria 6). La llamada de variantes fue realizada por GATK HaplotypeCaller (gatk/4.1.4.1). Los SNV tenían que pasar los criterios de filtrado (ReadPosRankSum ≥ −8.0, MQRankSum ≥ −12.5, QD ≥ 20.0, SOR ≥ 3.0, FS ≤ 60.0, MQ ≥ 40.0, GQ ≥ 50.0, DP ≥ 5.0). Se excluyeron las variantes que tenían llamadas heterocigotas o estaban ubicadas fuera del genoma central (las coordenadas del genoma central Dd2 se muestran en la Tabla complementaria 1). La anotación de variantes genéticas y la predicción del efecto funcional se determinaron utilizando snpEff (v4.3t)56. Los sitios de inicio de la transcripción se mapearon de acuerdo con el reciente conjunto de datos refinados57

El número de SNV de novo que se produjeron durante el ensayo de acumulación de mutaciones se identificó mediante el uso del genoma de Dd2-WT y Dd2-Polδ recolectado el día 0 para la sustracción en cada línea de parásitos. Para la condición de presión de drogas, los SNV de novo se identificaron utilizando el genoma de la línea parental que no estuvo expuesta a la presión de drogas para la sustracción. El cambio significativo de los números de SNV en Dd2-WT y Dd2-Polδ en la condición sin fármaco se determinó mediante pruebas de rango con signo de pares coincidentes de Wilcoxon de dos caras (GraphPad Prism v8/v9).

Las CNV fueron detectadas por el flujo de trabajo GATK 458 adaptado para P. falciparum59. Brevemente, se recogieron recuentos de lectura en las regiones codificantes de genes del genoma central de P. falciparum60 y se calcularon las proporciones de copia log2 sin ruido frente a un panel de normales construido a partir de muestras Dd2 no seleccionadas con fármacos. Las CNV se retuvieron si al menos 4 genes secuenciales mostraban una proporción de copias log2 sin ruido mayor o igual a 0,5 (aumento del número de copias) o menor o igual a -0,5 (disminución del número de copias).

La tasa de mutación (µ) de cada línea de parásitos se determinó mediante el número medio de variantes de un solo nucleótido (S) de novo de todos los clones (C) que ocurrieron durante el cultivo continuo de parásitos y que diferían de la línea de parásitos el día 0. La duración de los ciclos de vida eritrocíticos (L) y el tamaño del genoma (G) se calcularon como se muestra a continuación20,21. Se calculó un único ciclo de etapa de sangre asexual para Dd2 a las 44,1 h20. Los tamaños del genoma central de Dd2 y la región de codificación se establecieron en 20,789,542 pb y 11,553,554 pb, respectivamente (Datos complementarios 2). Se utilizó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk para examinar los conjuntos de datos de SNV en busca de una distribución normal. Se utilizó una prueba t de muestra para examinar las muestras medias y los intervalos de confianza del 95 % (Datos complementarios 2). Todas las pruebas se ejecutaron mediante programación R (v4.1.3) y los datos se recopilaron en Microsoft Excel (v16).

AlphaFold37 modeló las estructuras proteicas de PfATP4 (PF3D7_1211900) y PfQRP1 (PF3D7_1359900) y las comparaciones se realizaron con el servidor DALI61. Las estructuras se visualizaron utilizando el sistema de gráficos moleculares PYMOL.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos subyacentes a este artículo están disponibles en el material complementario y en los archivos de datos de origen. Todos los datos de secuencia asociados están disponibles en el archivo de lectura de secuencias de NCBI con el código de acceso ERP110649 (BioProject: PRJEB28444). Nombres de biblioteca DN581642P:A7, D7, E7 y DN573783H:A5-12, B5-B12, C5-C12, D5-D8, D10-D12, E5-E12, F5-F12, G6-G7, G9-G12, H4- H12. Los genomas de referencia para Dd2 y 3D7 y los datos de anotación de genes están disponibles en PlasmoDB (Dd2 en https://plasmodb.org/common/downloads/release-44/PfalciparumDd2/; 3D7 en https://plasmodb.org/common/downloads/ release-44/Pfalciparum3D7/). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Dondorp, AM et al. Resistencia a la artemisinina en la malaria por Plasmodium falciparum. N. ingl. J.Med. 361, 455–467 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amato, R. et al. Marcadores genéticos asociados con la falla de la dihidroartemisinina-piperaquina en la malaria por Plasmodium falciparum en Camboya: un estudio de asociación genotipo-fenotipo. Lanceta Infectada. Dis. 17, 164–173 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Uwimana, A. et al. Asociación de genotipos de Plasmodium falciparum kelch13 R561H con eliminación retardada del parásito en Ruanda: un estudio de eficacia terapéutica abierto, de un solo brazo y multicéntrico. Lanceta Infectada. Dis. 21, 1120–1128 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Balikagala, B. et al. Evidencia de malaria resistente a la artemisinina en África. N. ingl. J.Med. 385, 1163–1171 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tse, EG, Korsik, M. & Todd, MH El pasado, presente y futuro de los medicamentos contra la malaria. Malar. J. 18, 93 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Yuthavong, Y. et al. La dihidrofolato reductasa de la malaria como paradigma para el desarrollo de fármacos contra un objetivo comprometido con la resistencia. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 109, 16823–16828 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, E. et al. Definición de los determinantes de la especificidad de los inhibidores del proteasoma de Plasmodium. Mermelada. química Soc. 140, 11424–11437 (2018).

Artículo MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duffey, M. et al. Evaluación de los riesgos de la resistencia de Plasmodium falciparum para seleccionar antipalúdicos de última generación. Tendencias Parasitol. 37, 709–721 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumpornsin, K., Kochakarn, T. & Chookajorn, T. El resistoma y el reconocimiento genómico en la era de la eliminación de la malaria. Dis. Modelo Mec. 12, dmm040717 (2019).

Artículo PubMed Central Google Académico

Neafsey, DE, Taylor, AR & MacInnis, BL Avances y oportunidades en la genómica de la población de malaria. Nat. Rev. Genet 22, 502–517 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cowell, AN et al. Mapeo del genoma farmacológico del parásito de la malaria mediante el uso de evolución in vitro y quimiogenómica. Ciencia 359, 191–199 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ding, XC, Ubben, D. & Wells, TN Un marco para evaluar el riesgo de resistencia a los antipalúdicos en desarrollo. Malar. J. 11, 292 (2012).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Luth, MR, Gupta, P., Ottilie, S. & Winzeler, EA Uso de la evolución in vitro y el análisis del genoma completo para descubrir objetivos de próxima generación para el descubrimiento de fármacos antipalúdicos. ACS Infectar. Dis. 4, 301–314 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ng, CL & Fidock, DA Plasmodium falciparum selecciones de resistencia a fármacos in vitro y edición de genes. Métodos Mol. Biol. 2013, 123–140 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nzila, A. & Mwai, L. Selección in vitro de líneas de parásitos resistentes a los medicamentos de Plasmodium falciparum. J. Antimicrobiano. Quimioterapia. 65, 390–398 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Corey, VC et al. Un amplio análisis del desarrollo de resistencia en el parásito de la malaria. Nat. común 7, 11901 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, T. et al. MalDA, acelerando el descubrimiento de fármacos contra la malaria. Tendencias Parasitol. 37, 493–507 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bopp, SE y col. La evolución mitótica de Plasmodium falciparum muestra un genoma central estable pero recombinación en familias de antígenos. PLoS Genet 9, e1003293 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McDew-White, M. et al. Modo y tempo del cambio de longitud de microsatélites en un experimento de acumulación de mutaciones del parásito de la malaria. Genoma Biol. Evol. 11, 1971-1985 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Claessens, A. et al. Generación de diversidad antigénica en Plasmodium falciparum por reordenamiento estructurado de genes Var durante la mitosis. PLoS Genet 10, e1004812 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Hamilton, WL et al. Sesgo de mutación extremo y alto contenido de AT en Plasmodium falciparum. Ácidos nucleicos Res 45, 1889–1901 (2017).

CAS PubMed Google Académico

Honma, H. et al. Tendencia a la mutación del mutador Plasmodium berghei con ADN polimerasa delta deficiente en corrección de pruebas. ciencia Rep. 6, 36971 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Honma, H. et al. Generación de parásitos de la malaria en roedores con una alta tasa de mutación mediante la destrucción de la actividad correctora de la ADN polimerasa delta. ADN Res. 21, 439–446 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rottmann, M. et al. Espiroindolonas, una clase de compuestos potentes para el tratamiento de la malaria. Ciencia 329, 1175–1180 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, AH & Fidock, DA Evidencia de un fenotipo mutador leve en parásitos de la malaria plasmodium falciparum de Camboya. PLoS One 11, e0154166 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Simon, M., Giot, L. y Faye, G. La actividad de exonucleasa de 3' a 5' ubicada en la subunidad delta de la ADN polimerasa de Saccharomyces cerevisiae es necesaria para una replicación precisa. EMBO J. 10, 2165–2170 (1991).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Swan, MK, Johnson, RE, Prakash, L., Prakash, S. y Aggarwal, AK Bases estructurales de la síntesis de ADN de alta fidelidad por delta de polimerasa de ADN de levadura. Nat. Estructura. mol. Biol. 16, 979–986 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Byrnes, JJ, Downey, KM, Black, VL & So, AG Una nueva ADN polimerasa de mamífero con actividad de exonucleasa de 3' a 5': ADN polimerasa delta. Bioquímica 15, 2817–2823 (1976).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bebenek, A. & Ziuzia-Graczyk, I. Fidelidad de la replicación del ADN: una cuestión de revisión. actual Genet 64, 985–996 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kunkel, TA Puntos de vista en evolución sobre la (in)fidelidad de la replicación del ADN. Harb de primavera fría. Síntoma cuant. Biol. 74, 91–101 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, M. et al. Descubriendo los genes esenciales del parásito de la malaria humana Plasmodium falciparum por mutagénesis de saturación. Ciencia 360, eaap7847 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Baragana, B. et al. Un nuevo agente antipalúdico de múltiples etapas que inhibe la síntesis de proteínas. Naturaleza 522, 315–320 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spillman, NJ & Kirk, K. El catión ATPasa PfATP4 del parásito de la malaria y su papel en el mecanismo de acción de un nuevo arsenal de fármacos antipalúdicos. Int J. Parasitol. Drogas Resistencia a las drogas 5, 149–162 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Jiménez-Díaz, MB et al. (+)-SJ733, un candidato clínico para la malaria que actúa a través de ATP4 para inducir la eliminación rápida de Plasmodium mediada por el huésped. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 111, E5455–E5462 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Okombo, J., Kanai, M., Deni, I. & Fidock, DA Enfoques genómicos y genéticos para estudiar la resistencia a los medicamentos antipalúdicos y la biología del plasmodio. Tendencias Parasitol. 37, 476–492 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gamo, FJ et al. Miles de puntos de partida químicos para la identificación de plomo antipalúdico. Naturaleza 465, 305–310 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Predicción de estructura de proteínas de alta precisión con AlphaFold. Naturaleza 596, 583–589 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, J. et al. Predicción mejorada de la estructura de la proteína utilizando orientaciones predichas entre residuos. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 117, 1496–1503 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meister, S. et al. Imágenes de las etapas hepáticas de Plasmodium para impulsar el descubrimiento de fármacos antipalúdicos de próxima generación. Ciencia 334, 1372–1377 (2011).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, E. et al. El producto natural antipalúdico salinipostina A identifica las hidrolasas de serina alfa/beta esenciales involucradas en el metabolismo de los lípidos en los parásitos P. falciparum. Química celular. Biol. 27, 143–157 e145 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knaab, TC et al. 3-hidroxi-propanamidinas, una nueva clase de antipalúdicos activos por vía oral contra Plasmodium falciparum. J. Med Chem. 64, 3035–3047 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katju, V. & Bergthorsson, U. Viejo comercio, nuevos trucos: información sobre el proceso de mutación espontánea a partir de la asociación de experimentos clásicos de acumulación de mutaciones con enfoques genómicos de alto rendimiento. Genoma Biol. Evol. 11, 136–165 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Malaria Gen et al. Un conjunto de datos abierto de la variación del genoma de Plasmodium falciparum en 7000 muestras de todo el mundo. Bienvenido Open Res. 6, 42 (2021).

Artículo PubMed Central Google Académico

Cai, J. et al. Reconstitución del factor C de replicación humano a partir de sus cinco subunidades en células de insecto infectadas con baculovirus. proc. Academia Nacional. ciencia USA 93, 12896–12901 (1996).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uhlmann, F. et al. Reconstitución in vitro del factor C de replicación humano a partir de sus cinco subunidades. proc. Academia Nacional. ciencia USA 93, 6521–6526 (1996).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alguacil, O. et al. La subunidad 1 del factor de replicación C de Plasmodium falciparum está involucrada en la respuesta al estrés genotóxico. Microbiol celular. 23, e13277 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Beagan, K. & McVey, M. Vinculación de la estructura y función theta de la ADN polimerasa en la salud y la enfermedad. Mol celular. Ciencias de la vida 73, 603–615 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Qiu, D. et al. Una mutación G358S en la bomba de Na(+) PfATP4 de Plasmodium falciparum confiere resistencia clínicamente relevante a la cipargamina. Nat. común 13, 5746 (2022).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Voorhis, WC et al. Descubrimiento de fármacos de código abierto con la colección de compuestos de la caja de la malaria para enfermedades desatendidas y más. Patog de PLoS. 12, e1005763 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Istvan, ES et al. La mutación de esterasa es un mecanismo de resistencia a los compuestos antipalúdicos. Nat. común 8, 14240 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ariey, F. et al. Un marcador molecular de la malaria por Plasmodium falciparum resistente a la artemisinina. Naturaleza 505, 50–55 (2014).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Adjalley, S. & Lee, MCS CRISPR/Cas9 edición del genoma de Plasmodium falciparum. Métodos Mol. Biol. 2470, 221–239 (2022).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Smilkstein, M., Sriwilaijaroen, N., Kelly, JX, Wilairat, P. y Riscoe, M. Técnica simple y económica basada en fluorescencia para la detección de fármacos antipalúdicos de alto rendimiento. Antimicrobiano Agentes Quimiotera. 48, 1803–1806 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kozarewa, I. et al. La preparación de la biblioteca de secuenciación de Illumina sin amplificación facilita el mapeo y el ensamblaje mejorados de genomas sesgados (G+C). Nat. Métodos 6, 291–295 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DePristo, MA et al. Un marco para el descubrimiento de variaciones y el genotipado utilizando datos de secuenciación de ADN de última generación. Nat. Genet 43, 491–498 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cingolani, P. et al. Un programa para anotar y predecir los efectos de polimorfismos de un solo nucleótido, SnpEff: SNP en el genoma de la cepa w1118 de Drosophila melanogaster; iso-2; iso-3. Volar. (Austin) 6, 80–92 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Chappell, L. et al. Refinar el transcriptoma del parásito de la malaria humana Plasmodium falciparum usando RNA-seq sin amplificación. BMC Genomics 21, 395 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McKenna, A. et al. El kit de herramientas de análisis del genoma: un marco mapreduce para analizar datos de secuenciación de ADN de próxima generación. Genoma Res. 20, 1297–1303 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Veranos, RL et al. Chemogenomics identifica a la acetil-coenzima A sintetasa como un objetivo para el tratamiento y la prevención de la malaria. Química celular. Biol. 29, 191–201 e198 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Millas, A. et al. Indels, la variación estructural y la recombinación impulsan la diversidad genómica en Plasmodium falciparum. Genoma Res. 26, 1288–1299 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holm, L., Kaariainen, S., Rosenstrom, P. & Schenkel, A. Búsqueda de bases de datos de estructuras de proteínas con DaliLite v.3. Bioinformática 24, 2780–2781 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Nos gustaría agradecer a los miembros actuales y anteriores del laboratorio de Lee por sus comentarios constructivos. Agradecemos a Liz Huckle y al personal de Sanger Scientific Operations por su apoyo con la secuenciación. Agradecemos a Kotanan N. por la obra de arte. Nos gustaría agradecer la financiación de la Fundación Bill y Melinda Gates a MCSL, DAF, GSK y EAW (OPP1054480) y a DAF (INV-033538), la financiación del premio Wellcome Institutional Translational Partnership (ITPA) y la Universidad Mahidol a TK y TC, y financiamiento de Wellcome [206194/Z/17/Z] para MCSL y el Wellcome Sanger Institute.

Instituto Wellcome Sanger, campus Wellcome Genome, Hinxton, Reino Unido

Krittikorn Kümpornsin, Johanna Hoshizaki, Mukul Rawat, Richard D. Pearson y Marcus CS Lee

Calibr, División del Instituto de Investigación Scripps, La Jolla, CA, EE. UU.

Krittikorn Kümpornsin

Laboratorio de Medicina de Infecciones Moleculares de Suecia y Departamento de Biología Molecular, Universidad de Umeå, Umeå, Suecia

Theerarat Kochakarn y Thanat Chookajorn

Departamento de Microbiología e Inmunología, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Thomas Yeo, John Okombo, Kyra A. Schindler, Sachel Mok y David A. Fidock

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina, Universidad de California, San Diego, La Jolla, CA, EE. UU.

Madeline R. Luth y Elizabeth A. Winzeler

Centro de Terapéutica de la Malaria y Resistencia a los Antimicrobianos, División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Sachel Mok, Anne-Catrin Uhlemann y David A. Fidock

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina, Centro Médico Irving de la Universidad de Columbia, Nueva York, NY, EE. UU.

Parque Heekuk y Anne-Catrin Uhlemann

TCG Lifesciences Private Limited, Complejo de Electrónica Salt-Lake, Kolkata, India

Gouranga P. Jana y Bikash C. Maity

Medicines for Malaria Venture, Centro Internacional Cointrin, Ginebra, Suiza

Benoit Laleu, Elodie Chenu y James Duffy

Global Health Medicines I+D, GlaxoSmithKline, Tres Cantos, Madrid, España

Sonia Moliner Cubel, Virginia Franco, María G. Gomez-Lorenzo & Francisco Javier Gamo

Unidad de Genómica y Medicina Evolutiva, Centro de Excelencia en Investigación de Malaria, Facultad de Medicina Tropical, Universidad Mahidol, Bangkok, Tailandia

Thanat Chookajörn

Química biológica y descubrimiento de fármacos, Centro Wellcome para la investigación de antiinfecciosos, Universidad de Dundee, Dundee, Reino Unido

marcus cs lee

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KK y MCSL concibieron el estudio. KK generó las líneas de parásitos Dd2-Polδ y realizó los experimentos de acumulación de mutaciones. KK y MR realizaron transfecciones de parásitos. KK, KAS, SMC, VF y MGG realizaron los experimentos de selección de fármacos in vitro. Los ensayos de sensibilidad a fármacos y resistencia cruzada fueron realizados por KK, JO, MR, KAS y MCSLHP, y ACU contribuyó a la generación de datos de secuenciación del genoma completo. GPJ, BCM, BL, EC y JD contribuyeron a la síntesis de compuestos. Los datos de secuenciación del genoma completo fueron analizados por KK, TK, TY, MRL, JH, RP y SMKK, FJG, EAW, DAF, TC y MCSL conceptualizaron y planificaron los experimentos y supervisaron el estudio. Todos los autores contribuyeron a escribir el documento.

Correspondencia a Marcus CS Lee.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Shiroh Iwanaga, Toshihiro Mita y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Kümpornsin, K., Kochakarn, T., Yeo, T. et al. Generación de un parásito mutador para impulsar el descubrimiento de resistomas en Plasmodium falciparum. Nat Comun 14, 3059 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38774-1

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Recibido: 23 agosto 2022

Aceptado: 12 de mayo de 2023

Publicado: 27 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38774-1

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