Concentraciones urinarias de GHB y sus nuevos conjugados de aminoácido y carnitina luego de la administración controlada de GHB a humanos

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8983 (2023) Citar este artículo

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El gamma-hidroxibutirato (GHB) sigue siendo un fármaco de toxicología clínica/forense desafiante. Su rápida eliminación a niveles endógenos provoca principalmente esto. Especialmente en agresiones sexuales facilitadas por drogas, la recolección de muestras a menudo ocurre más tarde que la ventana de detección de GHB. Nuestro objetivo fue investigar nuevos conjugados de GHB con aminoácidos (AA), ácidos grasos y sus metabolitos de ácidos orgánicos para determinar su idoneidad como marcadores de ingestión/aplicación en la orina después de la administración controlada de GHB a humanos. Usamos LC-MS/MS para la cuantificación validada de muestras de orina humana recolectadas en dos estudios cruzados aleatorios, doble ciego, controlados con placebo (GHB 50 mg/kg, 79 participantes) aproximadamente 4.5, 8, 11 y 28 h después consumo. Encontramos diferencias significativas (placebo frente a GHB) para todos los analitos menos dos a las 4,5 h. Once horas después de la administración de GHB, GHB, GHB-AA, ácido 3,4-dihidroxibutírico y ácido glicólico aún mostraban concentraciones significativamente más altas; a las 28 h sólo GHB-glicina. Se evaluaron tres estrategias de discriminación diferentes: (a) concentración de corte de GHB-glicina (1 µg/ml), (b) proporciones de metabolitos de GHB-glicina/GHB (2,5) y (c) umbral de elevación entre dos muestras de orina ( > 5). Las sensibilidades fueron 0,1, 0,3 o 0,5, respectivamente. Solo GHB-glicina mostró una detección prolongada sobre GHB, principalmente cuando se comparó con una segunda muestra de orina emparejada por tiempo y sujeto (estrategia c).

El gamma-hidroxibutirato (GHB), un ácido graso de cadena corta, representa un analito importante en toxicología clínica y forense no solo por su consumo recreativo como droga de abuso (DOA) sino también por su uso en delitos facilitados por drogas o agresiones sexuales facilitadas por drogas (DFSA)1,2,3. Matrices como las de sangre u orina solo permiten ventanas de detección cortas para GHB de hasta 6 h y 12 h, respectivamente4. Para empeorar las cosas, el GHB también es un compuesto endógeno5,6, lo que hace que sea especialmente difícil discriminar los niveles bajos de GHB exógeno después del consumo/administración de GHB de los niveles endógenos. Por lo general, se recomiendan puntos de corte entre 6 y 10 µg/mL en la orina para diferenciar entre los niveles endógenos de GHB y la ingesta de GHB1,5,7. Aún así, se requieren biomarcadores adicionales para mejorar la detección e interpretación de GHB en intervalos más largos. El GHB-glucurónido y el GHB-sulfato se investigaron exhaustivamente. Si bien se discutió de manera controvertida, la mayoría de los estudios no encontraron ventajas en la detección de GHB-glucurónido8,9,10,11. Más recientemente, los ácidos orgánicos formados a través de la degradación del GHB o la beta-oxidación ganaron atención como biomarcadores adicionales. Las concentraciones endógenas de ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-DHB), 3,4-DHB, ácido glicólico (GA), ácido succínico (SA) y succinilcarnitina se determinaron sistemáticamente en cohortes más grandes12,13 y su utilidad general en la mejora de las ventanas de detección e interpretación de GHB14,15,16. Nuevos conjugados de GHB (Fig. 1) con carnitina, aminoácidos (glicina, glutamato, taurina, fenilalanina), pentosa, ácidos grasos, fosfolípidos y algunas características aún desconocidas (U3, U4, U16) también apuntaron hacia marcadores de GHB adicionales prometedores . Fueron descubiertos a través de perfiles metabólicos no dirigidos17,18 o enfoques basados en hipótesis19,20,21. Sin embargo, aún están pendientes los estudios sistemáticos sobre sus concentraciones urinarias. Por lo tanto, nuestro objetivo fue caracterizar cuantitativamente la excreción urinaria de GHB, GHB-carnitina, GHB-glicina, GHB-glutamato, GHB-taurina, GHB-fenilalanina, ésteres de ácidos grasos de GHB (C8–C18, C18:1) y ácidos orgánicos 2 ,4-DHB, 3,4-DHB, GA, SA, succinilcarnitina después de la administración controlada de GHB a humanos y evaluar su utilidad para la detección prolongada de la ingesta/aplicación de GHB aplicando tres estrategias de discriminación diferentes.

Estructuras químicas de conjugados de GHB recientemente identificados con aminoácidos glicina, glutamato y taurina (izquierda), carnitina, ácidos grasos o pentosa (derecha).

Las concentraciones de cada participante determinadas usando un método validado de cromatografía líquida, espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS)21 y creatinina urinaria se proporcionan en la Tabla S1. La comparación de las concentraciones calculadas entre los isótopos de 12C y 13C indicó una buena concordancia dentro del rango de calibración, pero una concordancia más pobre para el 12C en concentraciones más altas (Fig. S1 complementaria). En consecuencia, los resultados de 13C se usaron como valores aproximados para las concentraciones de GHB en muestras que excedían la calibración. La Tabla 1 proporciona un resumen (media, mediana, rango) de las concentraciones determinadas para cada condición sin/ajustada a la creatinina, respectivamente. Se encontró que las concentraciones de creatinina eran independientes del tratamiento, el género o la enfermedad, pero mostraron la variación intradiaria esperada (estudio II, 11 h, figura complementaria S2). Se detectaron conjugados de GHB-carnitina y GHB-aminoácido en las sesiones de placebo y GHB. Solo las concentraciones de GHB-taurina estaban por debajo del límite de cuantificación (LOQ) de 0,05 µg/mL en todas las muestras de placebo. Los conjugados de ácidos grasos de GHB no pudieron detectarse en ninguna condición de tratamiento. Como era de esperar, las concentraciones más altas de todos los compuestos medidos se observaron en la primera muestra de orina recolectada en la sesión de GHB. En comparación con un número limitado de casos auténticos publicados en estudios anteriores (ForTox pos 121, ForTox pos 215, n = 7 cada uno, Tabla 1), las concentraciones determinadas después de administraciones controladas (4,5 h) fueron más bajas para todos los compuestos excepto para GHB-carnitina. La correlación de Spearman entre las concentraciones no ajustadas y las ajustadas por creatinina fue alta (r > 0,8). Solo los isómeros de DHB y GHB-glucurónido (r 0.4–0.6), SA y succinilcarnitina (r 0.6–0.7) mostraron una correlación pobre (más) (Figura complementaria S3). La comparación entre muestras de 4,5 h de las cohortes I y II no reveló diferencias relevantes, excepto para GHB-carnitina, donde se midieron concentraciones significativamente más altas en la cohorte de estudio I. Las concentraciones de conjugados de aminoácidos fueron ligeramente más altas en la cohorte II. Las concentraciones fueron independientes de la edad, el sexo y el trastorno depresivo subyacente. Solo las concentraciones de SA fueron significativamente más altas en las mujeres en cualquier punto de tiempo y 2,4-DHB en pacientes depresivos a las 4.5 h (Figura complementaria S4). Descubrimos que las concentraciones endógenas de GHB y metabolitos de GHB (placebo) eran independientes del día, excepto para el glucurónido de GHB y la succinilcarnitina, que mostraron concentraciones significativamente más bajas en la tarde (Fig. 3, Fig. S5 complementaria). La correlación de Spearman de las concentraciones de metabolitos con las de GHB en la cohorte de estudio II fue alta a las 4,5 hy a las 11 hy moderada a las 28 h, como se muestra en los ejemplos representativos de la Fig. 2A. Por el contrario, la concentración inicial no influyó en las concentraciones en puntos de tiempo posteriores, como lo indica la falta de correlación entre las concentraciones de orina tempranas (4,5 h) y las de 11 h o 28 h, respectivamente (Fig. 2B).

Análisis de correlación (spearman, r) entre (A) concentración de GHB en orina (eje x) y concentraciones de GHB-glicina o 3,4-DHB a las 4,5 h (gris claro), 11 h (gris oscuro) y 28 h (negro ) después de la ingesta de GHB y (B) correlación entre las concentraciones a las 4,5 h frente a las de las 11 h (gris oscuro) y las 28 h (negro). Las líneas sólidas representan los resultados de la correlación lineal.

Las concentraciones derivadas de las sesiones de placebo y GHB de la cohorte de estudio II a las 4,5, 11 y 28 h después de la ingesta se representan como diagramas de caja en la Fig. 3 y la Fig. S5 complementaria. Las concentraciones de cada participante se muestran como ejemplos representativos de GHB, GHB-glicina y GHB-carnitina, 3,4-DHB y GA (Figura complementaria S6). Se observaron diferencias significativas entre el placebo y el tratamiento con GHB para todos los analitos excepto SA y succinilcarnitina en el momento de recolección más temprano. Once horas después de la administración de GHB, GHB, GHB-aminoácidos, 3,4-DHB y GA aún tenían concentraciones significativamente más altas que el placebo. 28 h después de la ingesta, solo GHB-glicina permitió la discriminación estadística. La GHB-pentosa y la característica U4 mostraron cierto potencial para distinguir el GHB exógeno del endógeno.

Gráficos de cajas de concentraciones en orina para placebo (gris claro) y tratamiento con GHB (gris oscuro) recopiladas en el estudio II a las 4,5, 11 y 28 h después de la ingesta. La comparación estadística se realizó mediante una prueba no paramétrica de Mann-Whitney de una cola (p < 0,05): *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

Sobre la base de las concentraciones de placebo, se seleccionaron valores de corte y se probó su sensibilidad para detectar la ingesta de GHB en los diferentes puntos de tiempo posteriores a la administración. Los resultados de especificidad, sensibilidad y VPP se resumen en la Tabla 2. Utilizando los puntos de corte seleccionados, GHB-glicina funcionó mejor en comparación con GHB (sensibilidad 0,4 frente a 0,1) u otros biomarcadores (p. ej., 3,4-DHB sensibilidad 0,1) hasta al menos las 11 h. Sin embargo, después de 28 h, incluso GHB-glicina permitió la detección/discriminación de GHB de niveles endógenos en solo el 9% de los casos.

Las proporciones de metabolitos (metabolito/GHB, MR) aumentaron de 4,5 a 28 h después del tratamiento con GHB, pero no con el placebo, como se muestra de manera representativa para GHB-glicina, GHB-carnitina, 3,4-DHB y GA en la Fig. 4. El nivel más alto de GHB las concentraciones se observaron 4,5 h después de la administración de GHB y dieron lugar a una disminución significativa de las MR en comparación con el placebo. Solo los rangos intercuartílicos (IQR) de GHB-glicina excedieron los observados en condiciones de placebo. Tomar la RM IQR más alta del tratamiento con placebo (2,5) como un corte tentativo dio como resultado una sensibilidad (0,3) y una especificidad (0,9) más bajas en comparación con la estrategia a) a las 11 h. La sensibilidad (0,3) con una especificidad similar mejoró después de 28 h.

Proporciones de metabolitos (analito/concentración de GHB) para el placebo (gris claro) y el tratamiento con GHB (gris oscuro) calculadas a partir de muestras de orina en el estudio II a las 4,5, 11 y 28 h después de la ingesta. Las líneas punteadas representan el rango intercuartílico más alto y más bajo del tratamiento con placebo en todos los puntos de tiempo de recolección.

Además, evaluamos la utilidad de los niveles elevados de analitos (> 5) entre dos muestras de orina (individuales y coincidentes en el tiempo). En general, se observaron mejores sensibilidades en comparación con una aplicación de corte general (estrategia a; Tabla 2). Después de 28 h, aproximadamente el 50% o incluso el 90% de los casos positivos para GHB se clasificarían correctamente por GHB-glicina o GHB-pentosa, respectivamente. Sin embargo, se detectó una especificidad ligeramente menor para GHB-glicina porque, en algunos pares de orina, una muestra fue negativa para el biomarcador correspondiente.

La interpretación actual de las concentraciones de GHB en orina todavía necesita mejoras, y se realizaron varios estudios para encontrar nuevos biomarcadores8,9,10,11,12,15,16,17,18,19,22,23. Recientemente propusimos nuevos conjugados de GHB urinario con diferentes aminoácidos o carnitina (Fig. 1)17,18, pero faltan datos cuantitativos sobre intervalos de tiempo más largos después de la ingesta de GHB. El estudio actual es el primero en proporcionar valores cuantitativos para GHB, sus conjugados y ácidos orgánicos luego de la administración controlada de GHB a humanos.

Se (re)analizaron muestras de orina de dos cohortes de estudio (79 participantes). Mientras que la cohorte de estudio II consistió en un ensayo clínico reciente (almacenamiento de aproximadamente 6 meses a -80 °C), la cohorte de estudio I se almacenó durante aprox. 8 años (−80 °C) antes de la cuantificación en el estudio actual. La estabilidad a largo plazo durante la validación del método se probó durante un máximo de tres meses a -20 °C. Se observó una tendencia hacia la disminución de las concentraciones de conjugados de aminoácidos, pero solo el GHB-carnitina disminuyó significativamente21. En consecuencia, la media y el rango de conjugados de aminoácidos de GHB en las muestras de orina recolectadas 4,5 horas después de la ingesta de GHB en la cohorte I del estudio fueron ligeramente más bajos que en la cohorte II. En general, estos hallazgos demuestran una estabilidad suficiente de los conjugados de aminoácidos de GHB, al menos cuando se almacenan a -80 °C. Sorprendentemente, encontramos concentraciones significativamente más altas de GHB-carnitina en la cohorte I frente a la II (Tabla 1). Sin embargo, GHB-carnitina también ha demostrado ser inestable en muestras extraídas. La sustancia es altamente higroscópica y difícil de manipular en condiciones estándar de laboratorio. Para evitar problemas de interpretación debido al almacenamiento de muestras, enfocamos la evaluación de datos primarios en la cohorte de estudio II, dada la recolección de muestras coincidente y prolongada.

El isótopo 13C que se encuentra en la naturaleza suele ser alrededor del 1,1 % de todos los átomos de carbono y produce una señal de MS mucho más baja que la del 12C, que se ha demostrado que aumenta el rango dinámico24,25. Pudimos demostrar durante la validación del método que las concentraciones de GHB calculadas a través del isótopo 13C coincidían bien con los resultados de un método de GHB anterior21. El enfoque principal del presente estudio se centró en los nuevos metabolitos de GHB, particularmente en la diferenciación entre los niveles endógenos y la ingesta de GHB exógena. Por lo tanto, consideramos suficientes los resultados de 13C como valores aproximados para las concentraciones de GHB en muestras que exceden el rango de calibración y omitimos los pasos de dilución adicionales.

Se discute críticamente si las concentraciones urinarias cuantitativas deben ajustarse a los niveles de creatinina26. En muestras puntuales de orina, a menudo se recomienda el ajuste de creatinina para tener en cuenta el estado de dilución individual27. En toxicología clínica y forense, la creatinina urinaria generalmente se determina como un parámetro de validez28,29, pero la interpretación de las concentraciones de drogas en la orina comúnmente no considera los niveles de creatinina. Observamos una fuerte correlación entre las concentraciones ajustadas y no ajustadas de creatinina, excepto para los isómeros de DHB. En consecuencia, nos centramos en los resultados y la discusión sobre las concentraciones no ajustadas.

Detectamos conjugados de GHB en todas las condiciones y momentos de recolección, aunque no en todas las muestras de orina individuales (Tabla 1). La edad, el sexo o el trastorno depresivo no influyeron en las concentraciones. Solo los ésteres de ácidos grasos permanecieron indetectables en todas las muestras de orina, muy probablemente debido a su alta lipofilicidad y la pobre excreción renal resultante.

Para diferenciar los niveles endógenos de los residuos de la aplicación exógena, es necesario conocer los niveles endógenos y sus posibles fluctuaciones intradiarias o interdiarias. Encontramos fluctuaciones significativas solo para la succinilcarnitina, mientras que los isómeros de DHB y la glicina de GHB mostraron una tendencia leve y no significativa hacia niveles más altos a primera hora de la mañana. En general, las concentraciones de ácido orgánico de GHB en las muestras de placebo estaban en rangos similares a los publicados previamente por Kim et al.13 y, en general, ligeramente inferiores en comparación con Jarsiah et al.12. Para los nuevos conjugados de GHB, proporcionamos los primeros datos. Aun así, es necesario analizar más muestras sin la aplicación de GHB para determinar los niveles endógenos de forma fiable. Los estudios futuros también podrían apuntar a LOQ aún más bajos para GHB-fenilalanina y GHB-taurina.

Después del tratamiento con GHB, encontramos las concentraciones más altas en el momento de muestreo más temprano. Para los ácidos orgánicos, nuestros resultados de esta cohorte más grande se alinean con los hallazgos previos de Kueting et al. después de la ingesta de GHB en cinco pacientes narcolépticos (22–34 mg/kg de peso corporal)16. Sin embargo, en comparación con un número limitado de casos auténticos (Tabla 1, ForTox pos 121), las concentraciones determinadas después de administraciones controladas (4,5 h) fueron más bajas para todos los compuestos excepto para GHB-carnitina. Jarsiah et al. determinaron concentraciones similares para los isómeros de DHB y GA en casos forenses de GHB (Tabla 1, ForTox pos 215). Las posibles explicaciones incluyen una recolección de orina más temprana o dosis más altas de GHB consumidas/administradas. En los casos forenses, la mayoría de las veces se desconoce el tiempo de muestreo en relación con la ingesta de drogas y las dosis ingeridas. El almacenamiento de muestras y la estabilidad de los analitos también pueden ser críticos. Recientes experimentos de estabilidad a largo plazo durante tres meses indicaron aumentos significativos en los niveles de 2,4 y 3,4-DHB en los casos positivos para GHB, pero no en los negativos para GHB. Sin embargo, este efecto no se mostró para los conjugados de GA o GHB21.

Las concentraciones de metabolitos de GHB, con la excepción de GHB-carnitina, SA y succinilcarnitina, mostraron una alta correlación con las de GHB, particularmente en las concentraciones más altas obtenidas mediante aplicación exógena. Observamos una correlación más débil en puntos de tiempo posteriores (28 h), donde las concentraciones tienen una alta probabilidad de ser de origen endógeno, especialmente para los ácidos orgánicos (Fig. 2). Para el 3,4-DHB, las pendientes entre las correlaciones de origen exógeno y endógeno parecen diferir. Las concentraciones de ácido orgánico o conjugado varias horas después de la ingesta de GHB no dependían de la concentración inicial de GHB. Sin embargo, desafortunadamente, solo estaban disponibles tres puntos de tiempo que no permitían el cálculo de las tasas de eliminación y la cinética subyacente. En segundo lugar, la primera muestra de orina se recogió a las 4,5 h, lo que no refleja necesariamente la concentración máxima alcanzada en orina.

Por lo tanto, según los datos controlados disponibles, no se puede excluir por completo que dosis más altas de GHB (no) darán como resultado concentraciones más altas de conjugados de GHB, lo que también puede estar asociado con una detectabilidad más prolongada.

Las concentraciones medias de GHB estaban por debajo de los límites de GHB recomendados de 10 o 6 µg/mL ya 11 h después de la ingesta, lo que está en línea con las ventanas de detección conocidas de GHB4. Sin embargo, las concentraciones aún eran significativamente más altas desde el punto de vista estadístico que después del placebo. La búsqueda exploratoria inicial de biomarcadores17,18 despertó la esperanza de que los conjugados de aminoácidos de GHB no se produzcan de forma endógena, lo que los convierte en candidatos ideales como marcadores exógenos de GHB. Sin embargo, los métodos de detección analíticos más sensibles del presente estudio también revelaron bajos niveles endógenos de estos conjugados. La GHB-pentosa fue el único analito apenas presente en las muestras de orina de placebo (< 10 %), pero aún detectable después de 28 h (Figura complementaria S6). Desafortunadamente, no hay material de referencia disponible y sin la validación y cuantificación del método para este parámetro, las conclusiones siguen siendo limitadas. Lo mismo se aplica al compuesto aún desconocido U4. Al estar claramente relacionado con la administración de GHB, la elucidación de la estructura es esencial para estudios posteriores17.

Basándonos en la concentración endógena más alta por analito detectada en muestras de orina del tratamiento con placebo (igual al 100 % de especificidad), hemos elegido valores de corte para los metabolitos de GHB y los hemos probado en cuanto a su sensibilidad para detectar la ingesta de GHB en diferentes momentos. Además, si las concentraciones en las muestras auténticas (Tabla 1) superaban las de las cohortes del estudio controlado, se evaluaba un segundo punto de corte más alto, igual o muy similar a una publicación anterior15. GHB-glicina (límite tentativo de 1 µg/mL) se destaca como el biomarcador más prometedor que puede prolongar la ventana de detección de GHB a aproximadamente 28 h, pero aún no con la sensibilidad deseada idealmente cercana a uno. Kueting et al. describieron concentraciones elevadas de 2,4-DHB, 3,4-DHB y GA ajustadas en función de la creatinina urinaria después de la ingesta de GHB durante un máximo de 22 h en comparación con una concentración endógena inicial del mismo paciente antes de la ingesta de GHB16. Estos hallazgos no pudieron confirmarse en nuestro conjunto de datos. Solo el 3,4-DHB permitió la identificación correcta de la ingesta de GHB durante aproximadamente 11 h, pero aún con baja sensibilidad (14%). Curiosamente, las mismas muestras de orina (H19, H20, H21, P21 y P25) tenían concentraciones más altas de GHB, GHB-glicina, GHB-pentosa y 3,4-DHB en comparación con los otros participantes, especialmente a las 11 h y, a veces, después de 28 h (Fig. S6 complementaria). Hasta el momento, este hallazgo no podía explicarse, pero se demostró que era independiente de la edad, el sexo, la comedicación o la creatinina urinaria.

La administración de GHB da como resultado concentraciones de GHB en orina varias veces más altas en comparación con los niveles endógenos. En consecuencia, calcular las MR de los metabolitos de GHB sobre las concentraciones de GHB producirá inicialmente MR extremadamente bajas en comparación con el placebo, aumentando o excediendo las proporciones endógenas con el tiempo (Fig. 4). Si los metabolitos de GHB se eliminan más lentamente que el GHB, las MR correspondientes en puntos de tiempo posteriores deberían exceder las de los casos sin ingesta de GHB. De todos los MR evaluados, solo GHB-glicina siguió la tendencia esperada, mientras que los valores medianos aún se encontraban dentro de los límites del placebo. La selección de la RM IQR más alta del tratamiento con placebo como límite tentativo dio como resultado una sensibilidad ligeramente superior, pero todavía demasiado baja, para la detección correcta de la ingesta de GHB en muestras de orina de 28 h en comparación con el límite de una sola concentración.

Como tercer enfoque de discriminación, probamos una determinación de la proporción entre dos muestras de orina del mismo individuo, lo que representa el nivel endógeno de un individuo. Usamos muestras de placebo emparejadas en el tiempo para una evaluación preliminar para evitar la variación del analito dentro del día. El método analítico no fue lo suficientemente sensible para obtener valores cuantitativos en todas las muestras de placebo para conjugados de GHB. Por lo tanto, la formación de la relación basada en las concentraciones calculadas no fue posible en suficientes casos. En su lugar, utilizamos relaciones de área de pico (analito/estándar interno (IS)), con la ventaja adicional de que no se necesita material de referencia. Dichos estándares fueron parcialmente sintetizados internamente y aún no están disponibles comercialmente30. Las diferencias de abundancia en las muestras de orina de placebo (4,5 h frente a 28 h) se utilizaron como una cohorte sin GHB exógeno y mostraron elevaciones máximas de 5 (excepto GHB, GHB-glutamato, GHB-fenilalanina, SA). Por lo tanto, se seleccionó cinco como un umbral de elevación potencial. A los compuestos no detectables en muestras individuales se les asignó una proporción ficticia de área de pico/IS de 0,00001 (factor mínimo 100 más bajo que los valores de muestra genuinos más bajos) para evitar la división por cero errores. Este enfoque produjo una sensibilidad mucho mayor, también 28 h después de la ingesta de GHB. Se observaron valores de especificidad más bajos causados por pares de orina (placebo) donde los analitos eran indetectables en una de las muestras. Bajo estas circunstancias, niveles ya muy bajos en las primeras muestras de orina conducirían a una elevación teóricamente infinita. Tomando GHB-glicina como ejemplo, la eliminación de los seis pares con GHB-glicina indetectable en una de las muestras aumentó nuevamente la especificidad de 0,85 a 1. Nuestros datos preliminares sugieren que la comparación con una segunda muestra de orina podría ser la mejor estrategia para mejorar la detección de GHB . Aún así, se necesitan más datos, que confirmen los umbrales de elevación propuestos y evalúen los resultados de muestras de casos de rutina duplicados. Por lo tanto, recomendamos recolectar muestras de orina 24 h (tiempo coincidente) después de la muestra inicial.

Nuestro estudio tuvo algunas limitaciones ya que las muestras analizadas de nuevo procedían de estudios que inicialmente no estaban diseñados para nuestra pregunta de investigación. Además, se administró una dosis terapéutica (narcolepsia) de GHB, mientras que en los casos de DFSA se utilizan comúnmente dosis más altas. Solo estaban disponibles tres puntos de tiempo de recolección de hasta 28 h, lo que no permitió un análisis farmacocinético adecuado (p. ej., tasa de eliminación).

Proporcionamos los primeros datos completos sobre varios biomarcadores de GHB después de la administración controlada de GHB. Los conjugados de GHB-AA y el ácido 3,4-dihidroxibutírico demostraron ser adecuados como marcadores de detección de GHB adicionales. En consecuencia, el análisis actual de GHB debe extenderse de GHB solo a varios otros biomarcadores. Sin embargo, solo GHB-glicina mostró una detección prolongada sobre GHB. Las mejores sensibilidades se obtuvieron cuando una muestra de orina se comparó con una segunda vez y muestras de orina emparejadas por sujetos (estrategia c). Aún así, la recolección de una segunda muestra de orina de las víctimas de DFSA puede ser crítica, y (más) muestras de rutina deben analizarse con este enfoque antes de la evaluación final.

Utilizamos muestras de orina de dos estudios cruzados aleatorios, equilibrados, doble ciego y controlados con placebo realizados en Zúrich, Suiza. Inicialmente, se diseñaron para caracterizar los efectos del GHB que promueven el sueño en participantes sanos (estudio I) y los efectos de mejora de la memoria en participantes sanos y pacientes con trastornos depresivos mayores (estudio II). La aprobación fue concedida por el Comité de Ética Cantonal de Zúrich y Swissmedic. Los estudios se registraron en ClinicalTrials.gov (NCT02342366 y NCT04082806, respectivamente) y todos los protocolos y métodos del estudio cumplieron con las directrices pertinentes y la declaración de Helsinki. Se administró GHB (50 mg/kg de peso corporal de Xyrem®) o placebo disueltos en 2 dL de jugo de naranja. Entre sesiones (placebo y GHB) se mantuvo una fase de lavado de siete días. Todos los participantes fueron instruidos sobre los riesgos potenciales y dieron su consentimiento informado por escrito, de acuerdo con la declaración de Helsinki.

El diseño del estudio se describe en detalle en otra parte31. Brevemente, en el estudio principal (n = 20 hombres sanos, edad media 25,8 ± 2,5, S01–S20), se recolectaron muestras de orina temprano en la mañana a las 7:00 a. m. (4,5 h) después de la administración de GHB/placebo a las 2:30 a. m. la noche experimental. En un estudio piloto inicial, el GHB/placebo se administró de la misma manera, pero a las 11 de la noche de la noche experimental. La orina de la mañana (n = 20, SP01–SP20) se recolectó a las 7:00 am (8 h). Todas las muestras se almacenaron a -80 °C durante aproximadamente ocho años y se sometieron a un máximo de dos ciclos de congelación y descongelación. Estas muestras de orina ya se utilizaron para investigaciones anteriores de metabolomas no dirigidos17,18.

La cohorte de estudio II se obtuvo de un estudio clínico reciente de administración de fármacos en voluntarios sanos (H, n = 21, 6 hombres, 15 mujeres, edad media 27 ± 6,6) y pacientes con trastorno depresivo mayor (P, n = 19, 6 hombres , 13 mujeres, edad media 27 ± 6,9). Las muestras de orina recolectadas de la noche experimental temprano en la mañana (4,5 h ± 1 h), en la tarde (11 h ± 1 h) y a la mañana siguiente (28 h ± 1 h), se incluyeron en los experimentos actuales de cuantificación de GHB. . Las muestras se almacenaron a -80 °C durante aproximadamente 6 meses hasta el análisis y se sometieron a un máximo de dos ciclos de congelación y descongelación. Los detalles adicionales del estudio que aborden los objetivos originales del estudio se publicarán en otro lugar.

Los productos químicos y disolventes utilizados y una descripción detallada del método LC-MS/MS validado se proporcionan en la referencia21. Muestras de orina auténticas (100 µl) se enriquecieron con 10 µl de solución IS (GHB-d6 5 µg/ml; butirilcarnitina-d3 5 µg/ml). Todas las muestras se diluyeron con 500 µL de acetonitrilo, se centrifugaron (14 000 rpm, 15 min) y el sobrenadante se transfirió a viales de automuestreador. El análisis se realizó en un sistema LC Shimadzu LC-40Dx3 (Shimadzu, Duisburg/Alemania) acoplado a un MS de cuadrupolo con trampa de iones lineal Sciex 5500 QTtrap (Sciex, Darmstadt/Alemania) controlado por el software Analyst (versión 1.7.2). Brevemente, la separación cromatográfica se realizó en una columna SeQuant ZIC-HILIC (Merck, Darmstadt/Alemania) siguiendo el gradiente de elución. El caudal fue de 0,35 ml/min. El MS se operó en modo avanzado de monitoreo de reacciones múltiples programadas utilizando de una a tres transiciones por analito, incluidos los isótopos 13C para GHB y GHB-carnitina. Los calibradores se prepararon en orina sintética.

La creatinina se determinó mediante la reacción de Jaffe en un dispositivo Indiko Plus (Thermo Scientific, Braunschweig/Alemania).

Se utilizó el software MultiQuant (3.0.3, Sciex) para la integración y cuantificación de picos. El análisis estadístico se realizó en GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, San Diego/CA/EE.UU.). Las comparaciones de grupo (placebo versus GHB; diferentes puntos de tiempo posteriores a la ingesta) se realizaron en las cohortes de estudio I y II mediante la prueba de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis de una cola seguida de la prueba de correcciones múltiples de Dunn (p < 0.05). La influencia del sexo y la enfermedad se evaluó mediante ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Sidak. Probamos la correlación, incluida la edad, con el análisis de correlación de Spearman.

Se evaluaron diferentes estrategias por su capacidad para discriminar entre el tratamiento con GHB y los niveles endógenos en la cohorte de estudio II: (a) concentraciones límite de los nuevos metabolitos de GHB, (b) proporciones metabólicas (MR, concentración de metabolitos/concentración de GHB) y ( c) cocientes de área de pico elevados (analito/IS) entre dos muestras de orina. Las muestras de orina después del tratamiento con GHB se tomaron como orina 1 y las muestras de placebo emparejadas en el tiempo como orina 2. Se formó un conjunto de datos sin GHB exógeno a través de las mejores muestras de placebo emparejadas en el tiempo a las 4,5 h (orina 1) o 28 h (orina 2) . Para evaluar la calidad de las estrategias, el número de verdaderos positivos (TP), falsos positivos (FP), verdaderos negativos (TN), falsos negativos (FN), sensibilidad resultante (TP/(TP + FN), especificidad (TN/ TN + FP), y se calculó el valor predictivo positivo (VPP = VP/(VP + FP)).

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores desean agradecer a su colega Maja Keller por su apoyo y discusión y expresar su gratitud a Emma Louise Kessler, MD, por su generoso legado que donó al Instituto de Medicina Forense de la Universidad de Zúrich, Suiza, con fines de investigación. El Estudio II fue apoyado financieramente por una subvención de proyecto de la Fundación Nacional Suiza (SNF Nr. 175780) otorgada a ES.

Departamento de Farmacología y Toxicología Forense, Instituto de Medicina Forense de Zúrich, Universidad de Zúrich, Winterthurerstrasse 190/52, 8057, Zúrich, Suiza

Andrea E. Steuer, Dario A. Dornbierer y Thomas Kraemer

Departamento de Psiquiatría, Psicoterapia y Psicosomática, Hospital Universitario Psiquiátrico de Zúrich, Universidad de Zúrich, 8032, Zúrich, Suiza

Francesco Bavato, Laura K Schnider, Dario A Dornbierer, Oliver G Bosch, Boris B Quednow y Erich Seifritz

Centro de Neurociencia de Zúrich, Universidad de Zúrich e Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zúrich, 8057, Zúrich, Suiza

Boris B. Quednow y Erich Seifritz

Instituto de Ciencias Farmacéuticas, Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zúrich, 8093, Zúrich, Suiza

cristian steuer

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FB, LKS, DAD, OGB, BBQ y ES conceptualizaron el estudio clínico y la recolección de muestras; AES y TK diseñaron la configuración analítica y la evaluación; AES realizó el análisis y la evaluación de los datos; AES redactó el manuscrito; TK, FB y BBQ revisaron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito y aprobaron la versión final.

Correspondencia a Andrea E. Steuer.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Steuer, AE, Bavato, F., Schnider, LK et al. Concentraciones urinarias de GHB y sus nuevos conjugados de aminoácido y carnitina luego de la administración controlada de GHB a humanos. Informe científico 13, 8983 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36213-1

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Recibido: 17 enero 2023

Aceptado: 31 de mayo de 2023

Publicado: 02 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36213-1

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