Descubrimiento del análogo de andrografólido como potente ciclooxigenasa

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8147 (2023) Citar este artículo

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La ciclooxigenasa-2 (COX-2) es la enzima clave responsable de la conversión del ácido araquidónico en prostaglandinas que muestran propiedades proinflamatorias y, por lo tanto, es una proteína diana potencial para desarrollar fármacos antiinflamatorios. En este estudio, se emplearon enfoques químicos y bioinformáticos para encontrar un nuevo análogo potente de andrografolida (AGP) como inhibidor de la COX-2 que tenga mejores propiedades farmacológicas que la aspirina y el rofecoxib (controles). Se seleccionó y validó la proteína COX-2 (604AA) humana Alpha fold (AF) con secuencia completa de aminoácidos por su precisión frente a las estructuras de proteína COX-2 notificadas (ID de PDB: 5F19, 5KIR, 5F1A, 5IKQ y 1V0X) seguida de múltiples análisis de alineamiento de secuencias para establecer la conservación de secuencias. El cribado virtual sistemático de 237 análogos de AGP frente a la proteína AF-COX-2 arrojó 22 compuestos principales en función de la puntuación de energía de unión (< − 8,0 kcal/mol). Estos se filtraron a 7 análogos mediante análisis de acoplamiento molecular y se investigaron más para la predicción de ADMET, cálculos de métricas de eficiencia de ligandos, análisis mecánico cuántico, simulación MD, simulación de acoplamiento de energía potencial electrostática (EPE) y MM/GBSA. Un análisis en profundidad reveló que el análogo de AGP A3 (3-[2-[(1R,4aR,5R,6R,8aR)-6-hidroxi-5,6,8a-trimetil-2-metiliden-3,4,4a, 5,7,8-hexahidro-1H-naftalen-1-il]etiliden]-4-hidroxioxolan-2-ona) forma el complejo más estable con el AF-COX-2 mostrando el menor valor RMSD (0,37 ± 0,03 nm) , un buen número de enlaces de hidrógeno (enlace H proteína-ligando = 11, y enlace H proteína = 525), puntuación EPE mínima (−53,81 kcal/mol) y MM-GBSA más bajo antes y después de la simulación (−55,37 y − 56,25 kcal/mol, respectivamente) valor en comparación con otros análogos y controles. Por lo tanto, sugerimos que el análogo A3 AGP identificado podría desarrollarse como un prometedor fármaco antiinflamatorio de origen vegetal mediante la inhibición de la COX-2.

La ciclooxigenasa (COX o prostaglandina G/H sintasa) juega un papel vital en la generación de mediadores biológicos como las prostaglandinas (PG), el tromboxano y las prostacilinas del ácido araquidónico. La enzima COX existe en dos isoformas: (i) la isoenzima COX-1 es constitutivamente activa y está involucrada principalmente en funciones homeostáticas como la regulación de la agregación plaquetaria y la acidez gástrica; (ii) por el contrario, la forma isomérica COX-2 induce durante condiciones patológicas tales como inflamación, dolor y fiebre1,2,3. Para desarrollar fármacos antiinflamatorios y analgésicos, la COX-2 es un objetivo viable y específico y en las últimas décadas se han desarrollado varios fármacos inhibidores de la COX-24. La COX-2 comprende una longitud de secuencia de 604 aminoácidos con tres dominios principales: (i) el dominio del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (34 a 72 aminoácidos), (ii) el dominio de unión a la membrana (73 a 116 aminoácidos) y (iii) el dominio catalítico que contiene los sitios activos de COX y peroxidasa [UniProt-P35354]. Los sitios activos de la COX y la peroxidasa son espacialmente distintos pero funcionalmente vinculados5. La proximidad a Tyr371 y Ser516 son los aminoácidos catalíticos críticos para el sitio activo COX-26. El residuo de valina en la posición 509 de la COX-2 forma un bolsillo hidrofóbico (HYD) en su sitio activo y desempeña un papel clave en la inducción selectiva de la enzima y, por lo tanto, en la respuesta inflamatoria7,8.

La COX-2 cataliza la reacción en dos pasos: (i) el primer paso es la reacción COX en la que el araquidonato se convierte en PG-G2 que se produce en el canal HYD del núcleo de la proteína y (ii) el segundo paso es la reacción de la peroxidasa en la que PG-G2 se reduce a PG-H2 (un importante precursor de la prostaciclina y se expresa durante la inflamación) que se lleva a cabo en el sitio activo que contiene hemo ubicado cerca de la superficie de la proteína9. Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), especialmente los coxibs y la aspirina, reducen la inflamación al inhibir la síntesis de PG a través de la interacción covalente con el residuo de Ser-516 en el sitio activo de la COX-210,11. Aunque estos fármacos son seguros y eficaces, pueden causar toxicidad gastrointestinal, lo que ha limitado su uso en pacientes muy sensibles. El diseño de inhibidores selectivos de la COX-2, incluidos celecoxib y rofecoxib (coxibs), inhiben la COX-2 en lugar de la COX-1 para proporcionar alivio del dolor y propiedades antiinflamatorias y prevenir las molestias gástricas experimentadas con los AINE no selectivos12,13,14 . Rofecoxib es un AINE altamente selectivo debido a la ausencia de ácido carboxílico (por lo tanto, menos irritante GI) y la presencia de dos grandes ciclos aromáticos unidos a un anillo central de heterociclo15. Además de la selectividad y eficacia, el alto costo del fármaco, los posibles efectos cardiovasculares adversos y el mayor riesgo de accidente cerebrovascular isquémico, el uso de inhibidores de la COX-2 es controvertido16,17,18. Por lo tanto, existe una demanda urgente de un fármaco terapéutico contra la COX-2 con efectos secundarios mínimos o nulos, preferiblemente de origen natural19.

Se ha demostrado que los metabolitos secundarios como alcaloides, terpenoides, estilbenos, flavonoides, saponinas y ácidos grasos tienen actividad inhibidora de la COX-220. Entre estos, el andrografólido (AGP), que se obtiene de la planta Andrographis paniculata, ha demostrado ser un importante agente antiinflamatorio natural junto con varios otros beneficios farmacológicos21,22,23. Andrographolide es un inhibidor covalente electrofílico natural, derivado de la vía terpenoide y privilegiado con las características estructurales que son necesarias para unirse a múltiples dianas24,25,26. Estructuralmente, AGP contiene una arquitectura 3D compleja con una gran cantidad de carbonos con hibridación sp3, rico contenido de oxígeno, bajo contenido de nitrógeno, una estructura policíclica con cadenas laterales alifáticas y sin anillos aromáticos. Además, las propiedades químicas de la andrografolida se ven reforzadas por la fracción α-alquilideno-β-hidroxi-γ-butirolactona, que es un fragmento electrofílico específico que le permite modificar de forma irreversible y covalente la proteína diana con un residuo de aminoácido que contiene tiol25. Esto proporciona sustancialmente afinidad de unión con la proteína diana y presenta andrographolide como un inhibidor covalente eficaz26,27.

Algunos grupos de investigación han intentado recientemente comprender los objetivos de la vía de señalización de andrographolide que están directa o indirectamente involucrados en la reacción inflamatoria28. Tran et al. (2020) informaron la actividad antiinflamatoria de andrographolide y sus pocos derivados en un modelo de lesión pulmonar aguda inducida por lipopolisacáridos y enfatizaron que las fracciones de α-alquilideno-β-hidroxi-γ-butirolactona y ent-labdano son vitales para la acción antiinflamatoria. actividad25. Dai et al. (2011) informaron que AGP ejerce su efecto antiinflamatorio mejorado al disminuir la actividad de la sintasa de óxido nítrico inducible en suero (iNOS), la producción de NO y la producción de PGE229. Recientemente, Wang et al. (2019) informaron que AGP y su derivado inhiben eficazmente la expresión de COX-2 inducida por lipopolisacáridos en macrófagos murinos30. De igual forma, otros grupos de investigación han informado que el andrografólido demuestra actividad anticancerígena al inhibir la expresión de la proteína COX-231,32. Aunque se han realizado esfuerzos para demostrar la actividad antiinflamatoria de andrographolide, los parámetros farmacocinéticos, es decir, la baja solubilidad y la baja biodisponibilidad son los factores limitantes para el desarrollo exitoso de fármacos33.

En este estudio, se lleva a cabo un análisis computacional sistemático para descubrir un nuevo análogo de andrografólido natural de origen vegetal como agente antiinflamatorio contra la enzima COX-2 que tiene mejor potencia, eficacia y selectividad que la aspirina y el rofecoxib (controles). Se emplean técnicas de mecánica molecular de quimioinformática y enfoques mecánicos cuánticos para una investigación detallada. La secuencia completa de la estructura de la proteína AF-COX-2 humana se utiliza después de la validación frente a la estructura cristalina 3D disponible. Además, se realizó un alineamiento de secuencias múltiples para la longitud de la secuencia de aminoácidos de la proteína para encontrar regiones conservadas para la actividad biológica. Se utilizan un total de 237 análogos de AGP para la detección, seguidos de estudios de acoplamiento para los análogos de éxito, predicción de parámetros de ADMET, cálculos de métricas de eficiencia de ligandos, análisis de mecánica cuántica en profundidad y estudios de puntuación de MM/GBSA. Además, la estabilidad del complejo de análogos de AGP golpeado se evaluó mediante la simulación de acoplamiento molecular y el análisis de simulación de acoplamiento de energía potencial electrostática (EPE). Los resultados del presente estudio ayudan en el desarrollo del inhibidor de la COX-2 de origen vegetal como futuros candidatos antiinflamatorios.

La estructura 3D de la proteína COX-2 cristalizada (5F19, 5KIR, 5F1A, 5IKQ y 1V0X) se recuperó de la base de datos PDB, mientras que la estructura predicha de la proteína COX-2 humana, que contiene 604 aminoácidos, se obtuvo de AlphaFold (AF ) (DNI: AF-P35354-F1)34,35,36,37. La estructura de la proteína fue validada por SAVES v6.0 (https://saves.mbi.ucla.edu/), ProSA y ProQ38,39,40,41,42. Para determinar la precisión de la estructura de la proteína humana AF-COX-2, los resultados de la validación se compararon con otras estructuras PDB de COX-2 cristalizadas disponibles, es decir, 5F19, 5KIR, 5F1A y 5IKQ, y el modelo COX-2 previsto (1V0X). Antes de cualquier análisis de interacción, la estructura de la proteína AF-COX-2 fue refinada por 3Drefine (https://3drefine.mu.hekademeia.org/)43. Posteriormente, los posibles bolsillos de unión para la proteína AF-COX-2 fueron predichos por CASTp 3.0 y visualizados por Chimera44,45.

Para verificar la presencia de los aminoácidos conservados en la proteína AF-COX-2, se realizó el alineamiento múltiple de secuencias (MSA) utilizando el programa PRALINE46. Para el mismo, se seleccionaron 10 especies diferentes de mamíferos, a saber, Homo sapiens, Rattus norvegicus, Mus musculus, Ovis aries, Bos Taurus, Oryctolagus cuniculus, Cavia porcellus, Equus caballus, Neovison vison y Gallus gallus, y se seleccionaron las secuencias de aminoácidos de sus respectivas COX- Se recuperaron 2 proteínas de Uniprot (http://www.uniprot.org/). Las secuencias de aminoácidos alineadas resultantes se colorearon según el índice de conservación (0 a 10), en el que las secuencias de aminoácidos altamente conservadas entre especies son responsables de la función biológica particular de la proteína47.

Se tomaron un total de 237 análogos de AGP de la base de datos de PubChem que consiste en el resto común de γ-lactona α, β-insaturada que es responsable de la actividad biológica al formar aductos con los residuos durante la interacción biológica25,26. Luego, los análogos fueron convertidos a un formato PDBQT autodock para proyección virtual por Open Babel48,49. Se utilizó el software PyRx (AutoDock Vina) para el cribado virtual dirigido al sitio de los análogos de AGP frente a la proteína AF-COX-250. Además, según los residuos de aminoácidos que interactúan presentes para la aspirina cocristalina y el rofecoxib en la estructura PDB 5F19 y 5KIR respectivamente, los aminoácidos His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Se eligieron Glu510, Ser516 y Leu517 como residuos del sitio activo en la proteína AF-COX-2 para configurar la cuadrícula para el cribado virtual35,36. El cuadro de la cuadrícula se estableció con el centro del espacio de búsqueda 4,76, 5,07 y − 0,12 en x, y y z, respectivamente, con una exhaustividad de 8, mientras que las dimensiones (Å) se establecieron para la cuadrícula en x, y y z con un valor de 29,54, 29,74 y 27,37 cada uno. Para preseleccionar los análogos de AGP exitosos, el valor de corte para la energía de enlace (BE) se fijó en menos de -8,00 kcal/mol.

Los análogos de AGP obtenidos del cribado virtual se sometieron a análisis de acoplamiento molecular junto con AGP, aspirina y rofecoxib como controles. Se utilizó AutoDock4.2 para el acoplamiento dirigido al sitio de estos compuestos con AF-COX-251. Dado que la estructura de la proteína AF de COX-2 es una estructura de proteína predicha, los ligandos cocristalinos, es decir, la aspirina y el rofecoxib de la estructura cristalizada existente de la proteína COX-2 5F19 y 5KIR, respectivamente, se tomaron como compuestos de referencia para el análisis de acoplamiento. Además, los aminoácidos, es decir, His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 y Leu517, se eligieron como residuos del sitio de unión en función de los residuos que interactúan con aspirina y rofecoxib en 5F19 y Estructuras 5KIR PDB. La caja de vigas para el acoplamiento se generó con un espaciado y una dimensión de 0,375 Å a lo largo de las coordenadas x, y y z con los valores de 84, 88 y 94, respectivamente. El centro de la cuadrícula se estableció en el centroide de los residuos del sitio de unión con la dimensión de 4,305, 4,394 y 1,611, respectivamente, junto con los ejes x, y y z. Además, se empleó GA (algoritmo genético) para calcular los parámetros de acoplamiento con un número de evaluaciones de energía de 25000000, un número de generaciones de 27000 y una tolerancia de RMSC (raíz cuadrada media) de 2,0 Å. Se utilizó el algoritmo genético de Lamarck para realizar la simulación de acoplamiento. AutoGrid y AutoDock se utilizaron para realizar el acoplamiento molecular y para investigar la mejor posición de unión de los ligandos en los complejos proteína-ligando. Finalmente, se seleccionaron los confórmeros del ligando con la energía de unión libre más baja para su posterior análisis. Los archivos de salida obtenidos del estudio de acoplamiento fueron visualizados y analizados por ICM-Browser y Accelrys Discovery Studio Visualizer52.

ADMETlab 2.0 se utilizó para predecir parámetros fisicoquímicos, medicinales, de absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicológicos para AGP y análogos de AGP preseleccionados junto con aspirina y rofecoxib53. También se usó para establecer la semejanza con las drogas del AGP y los análogos preseleccionados.

Las métricas de eficiencia de unión de ligandos se calcularon en términos de constante de inhibición (Ki), eficiencia de ligandos (LE), eficiencia lipofílica de ligandos (LLE), función de escalado de eficiencia de ligandos (LE_Scale), calidad de ajuste (FQ) y eficiencia de ligandos corregidos por lipofilia (LELP) siguiendo la Ec. (1–6)54,55,56,57,58.

El paquete Spartan 20 (wavefun.com) se utilizó para calcular los descriptores de la mecánica cuántica (QM) en términos del orbital molecular ocupado más alto (HOMO), el orbital molecular desocupado más bajo (LUMO), la brecha HOMO-LUMO (HLG) y los parámetros EPE para evaluar las propiedades de los orbitales moleculares, el potencial electrostático y dilucidar varios tipos de interacciones. Todos los compuestos químicos se optimizaron para calcular las variables geométricas de equilibrio en estado gaseoso en el suelo empleando la teoría funcional de la densidad (DFT) con el potencial de intercambio de tres parámetros de Becke59. Además, se utilizó el funcional de correlación de Lee Yang Parr (LYP), que es una combinación funcional de intercambio de Becke con un conjunto de base 6-31G*, para calcular las geometrías del estado fundamental60,61,62.

La proteína AF-COX-2 nativa y sus complejos con los análogos de AGP exitosos (seleccionados de los estudios de acoplamiento), AGP, aspirina y rofecoxib se utilizaron para comenzar los estudios de simulación de MD. Se utilizó GROMACS 2019.2 para realizar la simulación MD63. Todos los parámetros topológicos para compuestos químicos se obtuvieron del servidor PRODRG64. Se utilizó el campo de fuerza GROMOS96 54a7 para realizar todos los estudios de simulación65. Además, se utilizó un modelo de agua explícito de carga puntual simple (SPC) para solvatar el sistema en un tipo de caja de dodecaedro. El sistema se neutralizó mediante la adición de contraiones para mantener el estado residual protonado a un pH fisiológico de 7,4. Posteriormente, se eliminó el impedimento estérico inicial mediante el método de energía de descenso más pronunciado durante 50.000 pasos para minimizar el sistema. A partir de entonces, se utilizaron conjuntos NVT/NPT con un integrador de salto a una temperatura de 300 K y una presión de 1,0 bar para equilibrar el sistema. La simulación MD se ejecutó durante 100 ns para cada sistema equilibrado con 5000 fotogramas. El análisis estadístico de simulación MD se realizó a través de WebGRO (https://simlab.uams.edu/) mediante el cálculo de RMSD (root-means-square-deviation), RMSF (root-means-square-fluctuation), el área promedio por residuo, área, volumen y densidad de SAS (disolvente-superficie accesible), enlaces H (número de enlaces de hidrógeno en la proteína, así como entre la proteína y el ligando) y valor Rg (radio de giro).

Para evaluar la estabilidad de los aductos de AGP, análogos de hit, aspirina y rofecoxib con la longitud de péptido seleccionada de AF-COX-2, se llevó a cabo el estudio de simulación de acoplamiento de EPE utilizando Spartan 20. Para la misma longitud de secuencia de aminoácidos de 511 a 520 de AF-COX-2 (es decir, Val511, Gly512, Ala513, Pro514, Phe515, Ser516, Leu517, Lys518, Gly519 y Leu520) se seleccionó como péptido para formar los aductos con los compuestos. Para lo mismo, primero se construyó un modelo que constaba de un péptido de 10 residuos de aminoácidos y un ligando. A esto le siguió la minimización de energía con la opción de mecánica molecular seguida de los cálculos de punto único B3LYP/6-31G*. La energía del aducto se obtuvo directamente de la salida de los cálculos. Además, para calcular los parámetros electrónicos, los datos relacionados con el conjunto básico B3LYP/6-31G* se tomaron como el número de electrones desapareados (multiplicidad) = 0, carga total = acoplamiento neutro y constante de acoplamiento = se determinó la energía empírica y de estabilización deduciendo la suma de la energía de los constituyentes individuales de la energía aducida. Luego, se calculó la EPE para cada aducto y péptido que caracterizó la distribución de electrones en la superficie de los compuestos66. Finalmente, la energía de unión de los compuestos complejos con el péptido se calculó utilizando la siguiente ecuación. (7).

Las energías libres de unión en términos de mecánica molecular del área de superficie nacida generalizada (MM/GBSA) de los análogos de AGP, AGP, aspirina y complejos de rofecoxib se calcularon mediante Fast Amber Rescoring (FAR)67. El campo de fuerza ff14SB se utilizó para las moléculas pequeñas, mientras que el Campo de fuerza ámbar generalizado2 (GAFF2) se empleó para el análisis de proteínas68. Además, se utilizó el método AM1-BCC para asignar la carga parcial en los análogos a través de un módulo de antecámara de Ámbar69,70.

En este estudio se utilizó la estructura de la proteína COX-2 secuenciada completa AF-P35354-F1, que comprende 1-604 aminoácidos, que está modelada por AlphaFold y utiliza un método de aprendizaje automático de última generación para el modelado de proteínas. Antes de realizar cualquier análisis computacional, esta estructura de proteína se validó comparando la calidad general de la proteína con las cuatro estructuras de proteína COX-2 cristalizadas existentes (PDB ID: 5F19, 5KIR, 5F1A y 5IKQ) y una estructura modelada (PDB ID: 1V0X). La Tabla complementaria S1 resume los resultados obtenidos de SAVES, ProSA y ProQ para todas las estructuras de proteínas, que utilizan ERRAT, VERIFY, PROVE, Whatcheck, Procheck, Z score y LGscore para evaluar la calidad de la proteína mediante el cálculo del factor de calidad general. , compatibilidad de un modelo 3D atómico con su secuencia de aminoácidos, volúmenes de átomos, parámetros estereoquímicos y calidad estereoquímica. La estructura de la proteína AF-COX-2 pasó con éxito VERIFY y PROVE con un factor de calidad general del 97,74 % con un 90,9 % de residuos en la razón más favorecida. Además, los valores de puntuación z y puntuación LG para la proteína AF-COX-2 fueron -8,97 y 7,639, respectivamente, lo que indica que la estructura de la proteína modelo AF-COX-2 es de buena calidad40,42. Además, se encontró que la calidad general de la estructura de la proteína AF-COX-2 era la mejor entre todas las demás estructuras en términos de calidad, compatibilidad y parámetros estereoquímicos y, por lo tanto, esta estructura de proteína 3D se utilizó para estudios adicionales.

CASTp 3.0 predijo 96 posibles bolsillos de unión para la proteína AF-COX-2 (Tabla complementaria S2). Luego, de acuerdo con los valores de forma, cavidades internas, área y volumen de los bolsillos de unión, los aminoácidos del segundo bolsillo de unión (His75, Arg106, Phe191, Val214, Val330, Ile331, Tyr334, Val335, Leu338, Tyr341, Leu345 , Lys346, Gln358, Asn361, Tyr371, Trp373, Lys454, Arg455, Met457, Arg499, Phe504, Glu510, Phe515, Ser516, Leu517, Leu520, Met521) fueron seleccionados para su consideración adicional. A continuación, se seleccionaron los residuos del sitio de unión para el estudio en función de la interacción de rofecoxib y aspirina presentes en la estructura de 5KIR y 5F19 PDB, respectivamente. Además, en la estructura 5KIR PDB se encontró que los residuos del sitio de unión para rofecoxib eran Val344, Trp387, Phe518, Tyr385, 355, Ser530, ​​Leu531, Arg120, 513, Glu524 e His90. Mientras que, en la estructura 5F19 PDB, los residuos del sitio de unión de la aspirina se reconocen como Tyr385, Ser530, ​​Leu531, Glu524, Arg120, 513 y His 90. Por lo tanto, para encontrar el compuesto más eficiente que el rofecoxib y la aspirina, hemos considerado el sitio de unión residuos de ambos compuestos. Por lo tanto, hemos seleccionado los residuos de unión comunes (Tyr385, Ser530, ​​Leu531, Arg120 y Glu524) junto con los residuos de unión únicos presentes en rofecoxib y aspirina. En consecuencia, hemos considerado los residuos His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 y Leu517 como sitios de unión en este estudio para la proteína AF-COX-2. Curiosamente, el análisis CASTp 3.0 reveló que todos los residuos del sitio de unión seleccionados también están presentes en el bolsillo de unión predicho para AF-COX-2 y también pueden ser importantes para la unión de ligandos y la inhibición de proteínas71.

La proteína AF-COX-2 tiene una estructura 3D modelada sin ligando cocristalizado, por lo tanto, la predicción del residuo del sitio de unión en la estructura de la proteína refinada se llevó a cabo comparándolo con el sitio activo de la estructura PDB cristalizada existente de COX-2 presentes en la base de datos PDB. Para lo mismo, se seleccionaron estructuras 5F19 y 5KIR PDB de COX-2 que tienen aspirina y rofecoxib como ligandos co-cristalinos, respectivamente. Con base en los sitios de unión de ambos ligandos cocristalinos en la estructura de la proteína, se seleccionaron los aminoácidos His75, Arg106, Val330, Tyr334, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 y Leu517 como los sitios activos para estudios de interacción de unión. Para verificar estos residuos como el sitio activo prominente, se realizó una alineación de secuencia múltiple utilizando la proteína COX-2 de 10 especies de mamíferos diferentes, lo que demostró que, excepto Arg499, todos los aminoácidos seleccionados están completamente conservados (Figura complementaria S1 y Tabla S3). ). Esto también significa la importancia de estos aminoácidos en varias funciones biológicas y como un objetivo potencial para el desarrollo de fármacos47.

Un conjunto de 237 análogos de andrografolida que consta de la fracción común de γ-lactona α,β-insaturada, que es importante para la actividad biológica, se analizó frente a la proteína AF-COX-2 validada de secuencia completa para descubrir un potente compuesto antiinflamatorio de origen vegetal25 ,26. El examen virtual dirigido al sitio se utilizó para descubrir los análogos de AGP exitosos mediante un enfoque computacional. Calcula la energía de unión para todos los análogos sujetos por los resultados de la interacción proteína-ligando. Posteriormente, se seleccionaron los complejos de análogos energéticamente más favorables para su posterior análisis. Los resultados del análisis de cribado virtual revelaron que la energía de unión más baja fue − 8,80 kcal/mol para PubChem ID: 132210370, mientras que la energía de unión más alta fue − 5,90 kcal/mol para PubChem ID: 59876522 (Tabla complementaria S4). A partir de entonces, en función del valor de corte de la energía de unión (-8,00 kcal/mol), se seleccionaron 22 análogos de AGP de 237 para su posterior análisis. Por lo tanto, estos 22 análogos de AGP se sometieron a estudios de acoplamiento molecular para descubrir el potente inhibidor de COX-2 junto con AGP y fármacos de control (aspirina y rofecoxib).

Se encontró que los valores de energía de enlace obtenidos del análisis de acoplamiento molecular estaban en el rango de −9,35 kcal/mol (ID de PubChem: 132210508) a −3,2 kcal/mol (ID de PubChem: 132217538) (Tabla complementaria S5). Por el contrario, aspirina, rofecoxib y AGP mostraron valores de energía de unión de -5,61 kcal/mol, -8,17 kcal/mol y -7,95 kcal/mol, respectivamente. De los 22 análogos de AGP, se seleccionaron 7 análogos exitosos, denominados A1–A7, para un análisis más detallado en función del valor de corte de la energía de unión inferior a -8,00 kcal/mol. En términos de energía de unión, los siete análogos exitosos mostraron un valor menor en comparación con la aspirina y la AGP, mientras que cinco análogos (A1–A5) exhibieron un valor menor que el rofecoxib (Tabla 1), lo que indica su potencial para la inhibición de la proteína COX-2.

Se examinó el patrón de unión de AGP y sus siete análogos seleccionados con respecto a los inhibidores de la proteína COX-2 existentes, es decir, aspirina y rofecoxib (controles), para comparar la interacción de unión molecular y el análisis de posición de unión (Tabla 2). Este análisis revela que los aminoácidos Val335, Leu338, Ser339, Phe504, Val509 y Ala513 son comunes en las interacciones de todos los compuestos sujetos con la proteína AF-COX-2. Además, los aminoácidos Trp373, Gly512 y Ser516 son compartidos por aspirina, AGP y análogos A1-A7, mientras que los residuos Leu78, Val102, Arg106, Tyr341, Leu345, Leu517 están ocupados por rofecoxib, AGP y A1-A7. Además, entre todos los aminoácidos que interactúan, los residuos Arg106, Tyr371, Arg499, Met508, Val509, Glu510, Ala513 y Ser516 estuvieron involucrados en la interacción del enlace H, mientras que Leu78, Val102, Arg106, Val335, Leu338, Tyr341, Leu345, Phe504 Los residuos Met508, Val509, Ala513, Leu517 participaron en la interacción HYD. AGP y los análogos de hit A1-A5 mostraron 3, 3, 4, 1, 3 y 4 enlaces H, respectivamente, mientras que no se formaron enlaces H en el caso del análogo A6 y A7. Curiosamente, es evidente a partir del patrón de unión que AGP y los análogos A1-A7 comparten los residuos de aminoácidos que interactúan tanto en el sitio de unión de la aspirina como del rofecoxib de la proteína AF-COX-2 (Figs. 1 y 2), lo que indica su potencial como COX- Inhibidor de la proteína 2 con interacción de unión mejorada. Además, la orientación de unión de AGP y los análogos de éxito muestran que el resto de oxalona está orientado hacia el sitio de unión de aspirina, mientras que el resto de naftaleno/naftol está posicionado hacia el sitio de unión de rofecoxib (Fig. S2 complementaria).

Superposición de aspirina, rofecoxib, AGP y análogos de AGP hit en el sitio de unión de AF-COX-2. Todos los compuestos químicos se representan como modelo de bola y palo, la proteína como representación de cinta y los aminoácidos que interactúan como código de una sola letra. Código de color: gris claro = proteína AF-COX-2, superficie punteada azul = bolsa de unión a aspirina, superficie punteada roja = bolsa de unión a rofecoxib, azul = aspirina, rojo = rofecoxib, amarillo = AGP, verde = A1, naranja = A2, magenta = A3, rosa intenso = A4, gris pizarra oscuro = A5, cian = A6 y ciruela = A7. Esta figura se traza utilizando ICM-Browser52.

Interacciones de unión 2D de aspirina (a), rofecoxib (b), AGP (c) y análogos de AGP (A1–A7) (d–j) con el sitio de unión de la proteína AF-COX-2. Todos los compuestos químicos se representan como modelo de bola y palo; los aminoácidos con su número se representan como un círculo con un código de tres letras y una línea discontinua muestra el sitio de interacción de los compuestos químicos con los aminoácidos. Código de color: verde = enlaces H, rosa = interacciones HYD.

Las propiedades fisicoquímicas, de absorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicológicas de AGP y análogos A1-A7 se predijeron y compararon con aspirina y rofecoxib para evaluar su similitud con los fármacos (Tabla 3). Propiedades fisicoquímicas como el peso molecular (MW), el número de aceptores de enlaces H (nHA), el número de donantes de enlaces H (nHD), el área de superficie polar topológica (TPSA) y el logaritmo del coeficiente de distribución de n-octanol/agua (logP) para todos los compuestos seleccionados. Además, se analizaron para todos los compuestos las propiedades químicas medicinales, es decir, la puntuación de similitud del producto natural (NPscore), la regla de Lipinski y la regla de Pfizer. Excepto el rofecoxib y el análogo A5, todos los compuestos cumplieron los criterios de propiedades fisicoquímicas y de química médica para candidatos similares a fármacos. Además, las propiedades de absorción como la permeabilidad de Caco-2 (las líneas celulares de adenocarcinoma de colon humano), la actividad inhibidora de Pgp (inhibidor de la glicoproteína P), la absorción intestinal humana (rango de HIA 0–0.3) y el F30% (la proteína oral humana biodisponibilidad 30%) también se calcularon para todos los compuestos. Excepto el rofecoxib y el análogo A6, todos los compuestos cumplieron los criterios para ser utilizados como fármacos activos por vía oral. Además, se predijeron las propiedades de distribución, por ejemplo, la unión a proteínas plasmáticas (PPB), el volumen de distribución (VD), la penetración de la barrera hematoencefálica (BBB) ​​y la fracción no unida en plasma (Fu) para todas las moléculas estudiadas. Se encontró que las propiedades de distribución de los análogos AGP y A1-A7 estaban en el rango aceptable para un candidato similar a un fármaco. Además, el análisis acumulativo de las propiedades del metabolismo y la excreción también favoreció a la AGP y al análogo A1-A7 como posibles candidatos a fármacos. Además, la evaluación de las propiedades toxicológicas también predijo la naturaleza no tóxica de los análogos de AGP A1-A7.

La calidad de unión al ligando de los seleccionados se calculó en base a la masa molecular y la lipofilicidad con el contexto de la proteína diana particular. Por lo general, un valor de Ki bajo se refiere a una potencia alta y debe estar en el rango micromolar para que una molécula se califique como un compuesto exitoso o líder55. La eficiencia del ligando (valor umbral = 0,3 kcal/mol/HA) da una idea de qué tan bien se une un compuesto para su tamaño con la proteína56. La eficiencia lipofílica del ligando (valor umbral = 3) se utiliza para medir la afinidad de una molécula hacia la lipofilia, que es el factor principal para la promiscuidad de los compuestos LLE selectivos y optimizados54,56,57. LE_Scale es una función de escalado independiente del tamaño de la eficiencia del ligando y se obtiene ajustando una función exponencial a los valores máximos de eficiencia del ligando observados para un átomo pesado (HA) determinado. La calidad de ajuste (valor de umbral = 0,8), también denominada eficiencia de ligando escalada, incluye la eficiencia y el tamaño del ligando en una sola métrica y resulta al dividir el LE observado con LE_scale55,56,58. Por último, se calculó LELP (rango aceptable = -10 a + 10) que presenta una métrica que indica el precio de la eficiencia del ligando pagado en lipofilicidad54,55. Además, la energía de enlace (BE) obtenida de los estudios de acoplamiento (Tabla 1), HA y LogP adquiridos de la predicción de propiedades fisicoquímicas (Tabla 3) se tomaron para el cálculo de todas las métricas de LE. Se puede observar en la Tabla 4 que, excepto A5 y controles (aspirina y rofecoxib), todos los análogos examinados muestran los respectivos valores de métricas de eficiencia de ligando que superan los umbrales mínimos y se denominan análogos de HIT. Además, en términos de constante de inhibición, los análogos A1–A5 mostraron un valor de Ki menor que los controles (aspirina Ki = 75.604 µM y rofecoxib Ki = 0.995 µM) y AGP (Ki = 1.440 µM) indicando su mayor afinidad de unión hacia la inhibición de proteína COX-2 que los controles y AGP.

Los orbitales moleculares fronterizos (FMO) como HOMO, LUMO y HLG se calcularon para anticipar las propiedades electrónicas de AGP, análogos de hit, aspirina y rofecoxib contra AF-COX-2. En el caso de los análogos de AGP y A1-A7, los orbitales HOMO y LUMO se ubican en el resto naftaleno/naftol y oxalona, ​​respectivamente, mientras que, en el caso de la aspirina, los orbitales HOMO y LUMO se ubican en la parte de ácido benzoico de la estructura. Por el contrario, los orbitales HOMO se limitan a la fracción fenilfurano mientras que los orbitales LUMO se ubican en la fracción metilsulfonilfenilfurano de rofecoxib (Fig. 3). La HLG entre dos estados energéticos, HOMO y LUMO, explica la reactividad química de las moléculas donde el valor más bajo de HLG infiere mayor reactividad química y actividad biológica, y menor estabilidad del compuesto al facilitar el flujo de electrones72. También juega un papel importante en la estabilización del complejo proteína-ligando73. Se encontró que los valores de HLG estaban en el rango de 4,24 a 5,63 eV para todos los compuestos investigados con el orden de A6 (5,63 eV) > A7 (5,51 eV) = A5 (5,51 eV) > aspirina (5,43 eV) > AGP ( 5,26 eV) > A4 (5,21 eV) > A2 (5,15 eV) > A3 (5,05 eV) > A1 (5,03 eV) > rofecoxib (4,24 eV). Según el valor HLG, tanto A1 como A3 muestran la mayor reactividad química, mientras que A6 es el menos reactivo y el más estable.

Ilustración de los orbitales moleculares HOMO y LUMO de aspirina (a), rofecoxib (b), AGP (c) y los análogos de hit de AGP {A1–A7} (d–j) con su HLG (HOMO–LUMO-GAP). La estructura superior muestra LUMO mientras que la estructura inferior muestra orbitales HOMO. Código de color: rojo = potencial más negativo; azul = potencial más positivo.

El mapa EPE se utiliza para predecir los sitios activos de las interacciones intermoleculares como una distribución espacial de densidad de electrones sobre los compuestos químicos74,75. La Figura 4 muestra el mapa EPE de aspirina, rofecoxib, AGP y A1–A7 en el que la región de color azul representa el potencial más positivo que es responsable de la interacción nucleofílica mientras que el color rojo indica el potencial más negativo que es el sitio de la interacción electrofílica. . Es evidente a partir del análisis del mapa EPE que los grupos acetiloxi y carboxilo en la aspirina, los grupos metilsulfonilo y furano en rofecoxib, y los grupos oxalona e hidroxilo de la fracción naftaleno en AGP y los análogos de hit están en el potencial negativo (región roja) y, por lo tanto, estos son los sitio prominente para las interacciones electrófilas. Por el contrario, el potencial positivo (región azul), que es un sitio potencial para las interacciones nucleofílicas, se encuentra alrededor del hidrógeno del grupo carboxilo en la aspirina, el grupo fenilo del rofecoxib y el naftaleno o fracción naftol en los análogos AGP y A1-A7. Se encontró que los EPE positivos (kcal/mol) eran del orden de rofecoxib (36,24) < aspirina (59,54) < A7 (61,75) < A3 (62,15) < A4 (64,90) < AGP (65,08) < A1 (65,50) < A2 (65,79) < A6 (67,07) < A5 (68,07). La tendencia negativa de EPE (kcal/mol) fue diferente y siguió el orden de A7 (−48,98) > AGP (48,97) > A3 (48,31) > A6 (-47,84) > A4 (−46,65) > A2 (−46,53) > A1(−45,97) > A5 (−43,98) > rofecoxib (−43,51) > aspirina (−41,70) (fig. 4). Como el valor negativo de EPE favorece la formación de enlaces H más fuertes76,77, la AGP y sus análogos de hit A1-A7 mostraron un mejor potencial hacia una interacción más fuerte de enlaces H en comparación con la aspirina y el rofecoxib.

Mapas de energía potencial electrostática de aspirina (a), rofecoxib (b), AGP (c) y análogos de hit AGP {A1–A7} (d–j). El código de color para los mapas de contornos EPE muestra el valor más negativo en rojo hasta el valor más positivo en color azul; El orden de potencial es: azul (mayor + ve) > verde > amarillo > naranja > rojo (mayor -ve).

Estructuralmente, todos los análogos de AGP seleccionados comparten el andamiaje químico principal que consta de dos grupos cíclicos (es decir, naftaleno/naftol y oxalona) unidos con un resto de etiledina. Los compuestos que contienen grupos bicíclicos manifiestan una miríada de actividades biológicas78. Estos grupos bicíclicos que contienen fármacos interactúan predominantemente con proteínas a través de residuos hidrofóbicos y aromáticos. Además, también se ha demostrado que los compuestos bicíclicos interactúan con los grupos polares como el hidroxilo y las amidas del aminoácido79. En este estudio, entre los análogos de AGP examinados, hay dos estereoisómeros A1 (6S)/A3 (6R) y A2 (6S)/A4 (6R), mientras que los análogos A5, A6 y A7 son distintos entre sí. En comparación con AGP, los análogos A1 a A5 difieren estructuralmente en las posiciones 5 y 6 del resto de naftaleno, mientras que el resto del andamiaje químico es el mismo. En lugar de naftaleno, los análogos A6 y A7 poseían un resto naftol y tenían un grupo diferente en la tercera posición del anillo naftol. Además, el análisis de interacción molecular reveló que entre los análogos seleccionados, los compuestos que contenían un resto de naftaleno mostraron más afinidad en comparación con el naftol hacia la proteína COX-2 en términos de energía de unión, enlaces H e interacciones HYD (Tabla 1 y 2). Es evidente a partir de la Fig. 2 y la Tabla 2 del análisis de interacción molecular que el resto oxolano está implicado principalmente en la interacción del enlace H mientras que el resto naftaleno/naftol se ocupa principalmente de las interacciones HYD. Esto fue confirmado además por el análisis del descriptor de mecánica cuántica. Estructuralmente, en comparación con AGP, el análogo A1-A4 tiene un grupo -OH menos en la quinta posición en el resto de naftaleno, lo que aumenta la duración de la acción de estos análogos, lo que ha sido probado por la predicción de ADMET (Tabla 3). Esto aumenta aún más la interacción HYD de este tipo de análogos con la proteína COX-2 y también aumenta la afinidad con el receptor80. Por lo tanto, según la relación anterior entre las características de la estructura química y los resultados obtenidos del acoplamiento molecular y el análisis DFT, concluimos que los análogos de AGP seleccionados compartían una actividad antiinflamatoria mejorada en comparación con AGP y los fármacos de referencia (aspirina y rofecoxib).

Se llevó a cabo un análisis de simulación MD para AGP y complejos de análogos de éxito con proteína AF-COX-2 junto con controles apropiados {proteína AF-COX-2 sola (control neutral) y su complejo con aspirina y rofecoxib (control positivo)}. El análisis de trayectoria de simulación MD de AGP y el complejo de análogos de hit se comparó con la proteína AF-COX-2 nativa, la aspirina y el complejo rofecoxib en términos de RMSD, RMSF, área residual, Rg, área SAS, volumen SAS, densidad SAS, proteína enlaces H y enlaces H del complejo proteína-ligando.

El RMSD mide la conformación de la proteína calculando la distancia promedio entre los átomos de la columna vertebral de una proteína durante la simulación y evaluando la estabilidad estructural. Se encontró que los valores promedio de RMSD para AGP y análogos de hit eran más bajos que el control neutral (proteína nativa). En comparación con los controles positivos, se observó que el valor promedio de RMSD era menor en los análogos A2, A3 y A4. El valor de RMSD de menor valor se observó para el análogo A3, lo que indica su capacidad para formar un aducto estable con la proteína AF-COX-2 (Fig. 5a y Tabla complementaria S6). La RMSF se calcula para la movilidad residual de cada complejo proteína-ligando, así como para la proteína nativa. No se encontraron diferencias notables entre los perfiles de fluctuación residual de todos los complejos (Fig. 5b). Esto se puede atribuir a la formación de enlaces H ya las interacciones de van der Waal entre los residuos de aminoácidos y los ligandos. Como se muestra en la Fig. 5b, las regiones del sitio de unión activo tienen fluctuaciones más bajas que indican su estabilidad en la proteína AF-COX-2. Además, se observó que el RMSF promedio era más bajo en los complejos A1, A3, A6 y A7 que en el control neutral y el control positivo (Tabla complementaria S6). La RMSF individual para los residuos de aminoácidos que interactúan en cada sistema complejo de simulación se calculó y comparó con el valor de RMSF promedio respectivo para el sistema de simulación. Además, a partir de la Tabla complementaria S6, se encontró que el rango promedio de RMSF para todos los sistemas de simulación estudiados era de 0,16 ± 0,10 a 0,21 ± 0,18 nm. Además, es evidente que, excepto Arg106, Ser339 y Phe 504, el resto de los aminoácidos que interactúan exhibieron un valor de RMSF inferior a 0,21 nm (que es el valor de RMSF promedio más alto entre todo el sistema de simulación) (Tabla complementaria S7). Esto significa que los residuos de unión que interactúan son bastante estables durante la simulación MD. Además, el valor promedio más bajo de RMSF para los análogos A1, A2, A3, A6 y A7 que la proteína demuestra que los análogos son capaces de formar interacciones estables con la proteína durante la simulación MD. Este estudio de RMSF sugirió la capacidad de estos cuatro análogos de AGP para la formación de una interacción estable con la proteína AF-COX-2 durante el período de simulación.

Representación pictórica de los resultados del análisis de simulación MD en términos de RMSD (a), RMSF (b), área SAS para cada residuo (c) y Rg (d) de la proteína AF-COX-2 nativa y su complejo con ligandos sujetos.

El área SAS para cada residuo durante la simulación también se calculó para calcular el área de cada residuo que es accesible para el solvente (Fig. 5c)81. Se encontró que el valor de SAS por residuo estaba en el rango de 0 a 2,49 nm2. Es evidente que algunos residuos de la proteína AF-COX-2 no son accesibles para solventes como Asn181 en rofecoxib y complejo A2, y Lys237 en complejo A7. Además, entre todos los análogos y compuestos de control estudiados, se encontró que el valor promedio del área de SAS por residuo era el más alto para A3. Además, se encontró que el valor máximo del área de SAS por residuo (nm2) era del orden de A4 (2,49) > A5 (2,44) > A3 (2,27) > A6 (2,22) > Rofecoxib (2,21) > A7 (2,19) > A2 (2.18) > A1 (2.11) > AGP (2.06) > aspirina (2.06) > proteína (2.05) lo que significa que los análogos A3–A6 tienen mejor accesibilidad para el solvente que los otros complejos, así como la proteína nativa (Suplementario Tabla S8).

El análisis de Rg se llevó a cabo para calcular el nivel de compacidad en términos de plegamiento y despliegue de proteínas de la estructura de la proteína AF-COX-2 en presencia y ausencia de los ligandos. Se encontró que el valor promedio de Rg para los análogos A3 y A6 era equivalente al valor de Rg de la proteína nativa (control neutral) pero menor que el control positivo. Esto sugiere una formación de complejo proteína-ligando más estable y compacta en comparación con otros análogos y controles positivos (Fig. 5d y Tabla complementaria S8) 82.

El número de enlaces H en la proteína, así como entre la proteína y el ligando, juega un papel importante en la estabilidad de los complejos, por lo tanto, se realizó un análisis de enlaces H para AF-COX-2 nativa y sus complejos con AGP, análogos de hit, aspirina. y rofecoxib. Es evidente a partir de la Fig. 6a que el complejo análogo A3 exhibió un número máximo de enlaces H en la proteína, mientras que los complejos AGP y A3 exhibieron el número máximo de enlaces H proteína-ligando en comparación con otros análogos y positivos (Fig. 6b ). Esto sugiere una unión más fuerte y más eficiente del análogo A3 con la proteína AF-COX-2, lo que concuerda bien con los resultados obtenidos del análisis RMSD y RMSF (Tabla complementaria S6).

Ilustración gráfica de estudios de simulación MD de la proteína COX-2 nativa y sus complejos con aspirina, rofecoxib, AGP y análogos de hit AGP. ( a ) Número de enlaces H en la proteína, ( b ) número de enlaces H entre la proteína y el ligando, ( c ) área SAS, ( d ) volumen SAS y ( e ) densidad SAS.

SASA, el área de una superficie compleja que es accesible a un solvente de agua, se usa para predecir el nivel de variaciones conformacionales que ocurren a través de la interacción entre proteínas y ligandos. La figura 6c muestra el gráfico SASA para todos los análogos de éxito, AGP, neutral y control positivo. Se encontró que el valor promedio de SASA para todos los análogos de AGP afectados junto con AGP era mayor que el del control neutral (proteína nativa SASA = 273,57 nm2). Mientras que, en comparación con el control positivo (complejo de rofecoxib y aspirina SASA = 273,13 y 279,12 nm2, respectivamente), AGP, A2, A3, A4 y A5 mostraron mayores valores de SASA (es decir, > 279,12 nm2) (Tabla complementaria S9). Entre todos los análogos exitosos y AGP, A3 exhibió el valor SASA más alto = 284,59 nm2. En conclusión, el análogo A3 forma un complejo relativamente estable con la proteína AF-COX-2 después de la interacción. Además, el volumen de superficie accesible al solvente (Vsas), el volumen encerrado por el centro de una sonda de solvente que gira alrededor de la proteína, también se calculó para todos los ligandos estudiados, lo que significa la estabilidad del sistema complejo83. Por lo general, mide el efecto de las fuerzas ejercidas por los solventes sobre las superficies de las proteínas, seguido de las interacciones proteína-solvente. Además, Vsas es una alternativa para refinar el término SASA, con el fin de incluir la influencia del efecto de los solventes en el interior de la proteína y también definir la interacción entre la proteína y el solvente84. Es una aplicación precisa y rápida para examinar volúmenes geométricos de las proteínas. Además, puede usarse para calcular el volumen que cambia debido a la interacción del complejo proteína-ligando con el solvente85. Vsas junto con SASA proporciona una mejor aquiescencia de las fuerzas solventes no polares implícitas y explícitas sobre la proteína y su efecto sobre el plegamiento de la proteína86. Como se muestra en la Fig. 6d y la Tabla complementaria S9, el complejo análogo AGP, A3, A4 y A5 mostró un mayor valor de Vsas en comparación con todos los controles, mientras que el valor más alto se observó para el complejo análogo A3 (119.24 nm\s3\n ). Estos resultados indican que el análogo A3 forma el complejo más estable con la proteína AF-COX-2 en comparación con todos los demás análogos y controles. Además, se determinó la densidad de SAS, que es inversamente proporcional a SASA, para calcular la densidad de vecindad de los aminoácidos HYD enterrados dentro del núcleo de la proteína que conduce al plegamiento de la proteína87. La densidad de vecindario calcula las cantidades moleculares y atómicas precisas con coordenadas para el área de superficie de proteína accesible para solvente. No solo mide el efecto hidrofóbico de la densidad de aminoácidos, sino que también captura el efecto electrostático del solvente sobre el plegamiento y la estabilidad de la proteína88. Como se demuestra en la Fig. 6e y la Tabla complementaria S9, el análogo A3 poseía el menor valor de densidad SAS, lo que indica un mejor plegamiento de proteínas en comparación con otros análogos exitosos y todos los controles después de la interacción con la proteína AF-COX-2. Los tres análisis de superficie accesible por solvente (área, volumen y densidad) juntos brindan más énfasis en el análisis de simulación MD relacionado con la estabilidad compleja de los análogos en términos de plegamiento de proteínas y revelaron más estabilidad del análogo A3 que los otros compuestos estudiados, incluido el de referencia. moléculas. En general, a partir del análisis de simulación MD, se puede inferir que el análogo A3 exhibe una mejor estabilidad proteica que los otros análogos exitosos, AGP, proteína nativa, aspirina y rofecoxib.

Además, las interacciones moleculares de los análogos de éxito también se analizaron después de la simulación MD (Figura complementaria S3 y Tabla S10). Curiosamente, excepto A7, se observó que el sitio de unión para todos los análogos exitosos era consistente antes y después de la simulación. Además, se encontró que los residuos de aminoácidos Val102, Arg106, Val335, Leu338, Ser339, Tyr341, Leu345, Phe504, Val509, Ala513 y Ser516 son residuos importantes antes y después de la simulación, ya que son consistentes antes y después de la simulación. Además, un análisis comparativo antes y después de la simulación MD en la proteína aspirina reveló que después de la simulación se forman dos interacciones hidrofóbicas (Val509, Ala513) y dos enlaces H (Arg106 y Arg499), que eran tres y uno respectivamente antes de la simulación. En el caso de rofecoxib, solo se observaron tres interacciones hidrofóbicas (Leu338, Tyr371 y Trp373) después de la simulación, mientras que antes de la simulación se observaron un enlace H (residuo) y seis interacciones hidrofóbicas (residuo). A continuación, el complejo de proteína AGP exhibió seis interacciones hidrofóbicas sin enlace H después de la simulación, mientras que se observaron tres enlaces H con seis interacciones hidrofóbicas antes de la simulación. Luego, el complejo proteico análogo A1 mostró dos enlaces H con siete interacciones hidrofóbicas después de la simulación, mientras que se encontraron tres enlaces H con cinco interacciones hidrofóbicas antes de la simulación. El complejo proteico análogo A2 reveló nueve interacciones hidrofóbicas sin enlaces H después de la simulación, mientras que antes de la simulación se observaron cuatro enlaces H con seis interacciones hidrofóbicas. El complejo proteico análogo A3 mostró un enlace H con ocho interacciones hidrofóbicas después de la simulación, mientras que se observaron siete interacciones hidrofóbicas junto con un enlace H antes de la simulación. El complejo proteico A4 exhibió un enlace H y siete interacciones hidrofóbicas después de la simulación, mientras que se observaron tres enlaces H con seis interacciones hidrofóbicas antes de la simulación. El complejo proteico A5 reveló 2 enlaces H y siete interacciones hidrofóbicas después de la simulación, mientras que 4 enlaces H con cinco interacciones hidrofóbicas antes de la simulación. El complejo de proteínas A6 mostró un enlace H con cuatro interacciones hidrofóbicas después de la simulación, mientras que solo se observaron interacciones hidrofóbicas antes de la simulación. Por último, el complejo de proteínas A7 reveló un enlace H con tres interacciones hidrofóbicas y solo las interacciones hidrofóbicas estaban involucradas principalmente antes de la simulación (Tabla complementaria S10). En general, a partir del análisis comparativo, se observó que los análogos exitosos, excepto A7, permanecen cerca del sitio de unión identificado por el análisis de acoplamiento molecular, lo que indica la estabilidad de unión eficiente del complejo de análogos exitosos con AF-COX-2. Además, los complejos analógicos A1, A3 y A5 mantuvieron sus consistencias antes y después de la simulación.

Los mapas EPE describen la distribución de electrones en la superficie molecular, la energía HOMO y LUMO de las moléculas. En este estudio, hemos calculado el EPE, HOMO y LUMO de la secuencia seleccionada de proteína AF-COX-2 y su aducto con AGP, análogos de hit AGP, proteína nativa, aspirina y rofecoxib. Luego, se calculó la energía de unión del aducto, donde el valor más negativo de la energía de unión indica mayor estabilidad del complejo proteína-ligando89. Para este estudio, se seleccionaron como ligandos aspirina, rofecoxib, AGP y análogos de AGP A1–A7, mientras que las secuencias de proteínas de 511 a 520 aminoácidos de AF-COX-2, es decir, Val511, Gly512, Ala513, Pro514, Phe515, Ser516 , Leu517, Lys518, Gly519, Leu520 fueron seleccionados como un péptido para el estudio de simulación de acoplamiento mediante el cálculo de EPE35. Posteriormente, se encontró que los valores de energía de unión calculados de los aductos estaban en el rango de -53,81 kcal/mol (A3) a -34,53 kcal/mol (aspirina) (Tabla 5). Además, todos los AGP y los siete análogos exhibieron una energía de unión menor que el rofecoxib y la aspirina, mientras que el valor de energía de unión más bajo se observó para A3, lo que sugiere el complejo proteína-ligando más estable.

La energía libre de unión de los análogos de AGP exitosos que interactúan, AGP, aspirina y rofecoxib a la proteína AF-COX-2 se calculó mediante el método MM/GBSA para el análisis de simulación antes y después. Los resultados revelaron que existe una sutil diferencia entre la puntuación MM/GBSA antes y después del análisis de simulación (Fig. 7). Además, se puede observar en la Fig. 7 que entre todos los compuestos investigados, el análogo A3 mostró la energía libre de unión más negativa (antes de la simulación = − 55,37 kcal/mol y después de la simulación = − 56,25 kcal/mol) en términos de MM /GBSA indicando su fuerte interacción con la proteína AF-COX-2. Se encontró que la puntuación MM/GBSA estaba en orden decreciente de afinidad de unión A3 > A1 > A5 > Rofecoxib > A2 > A4 > A6 > A7 > AGP > aspirina. Además, se observó que todos los análogos de AGP afectados junto con AGP exhibieron un valor de energía libre más negativo en comparación con la aspirina, mientras que los análogos A3, A1 y A5 mostraron una mejor afinidad de unión que Rofecoxib, aspirina, AGP y otros análogos. . Además, se observó que el complejo del análogo A3, A1 y A5 con la proteína era más estable después del análisis de simulación y también implica que el análogo A3 mostró una mejor unión a la proteína COX-2 en comparación con los compuestos de referencia y otros análogos estudiados. Los resultados de MM/GBSA también corroboraron los hallazgos del acoplamiento, la simulación MD y el análisis DFT, y establecen que el análogo A3 sería un compuesto prometedor para inhibir la actividad de AF-COX-2 y puede usarse como un antiinflamatorio natural prometedor. droga.

La puntuación de energía MM/GBSA de rofecoxib (1), aspirina (2), AGP (3) y análogos seleccionados A1–A7 (4–10, respectivamente) antes y después de la simulación MD.

En general, nuestros resultados revelan que el análogo de andrografólido A3 es la molécula de fármaco natural de origen vegetal más potente y eficaz contra la proteína COX-2. La eficacia de este análogo se comparó con otros compuestos naturales y compuestos sintéticos para la inhibición de la COX-2. Se encontró que la energía de enlace para A3 del análisis de acoplamiento era − 8,56 kcal/mol, que es mejor que los derivados del aceite de coco virgen (rango BE para los derivados: − 5,65 kcal/mol a − 7,58 kcal/mol), alliin (− 4,90 kcal /mol), pinoresinolm (− 8,38 kcal/mol) y siringaresinol (− 8,23 kcal/mol)90,91,92,93. Además, la simulación MD y el análisis de simulación de acoplamiento EPE se llevaron a cabo para la estabilidad compleja de A3. Además, los resultados detallados del análisis comparativo con los compuestos de referencia respaldan que el análogo A3 identificado sería un candidato similar a un fármaco eficaz contra la proteína COX-2. Hasta donde sabemos, hasta la fecha, no se ha explorado la actividad antiinflamatoria del análogo de andrografólido A3 mediante la inhibición de la COX-2. Por lo tanto, el presente trabajo proporciona una base para el desarrollo del análogo de andrografólido A3 como un posible candidato similar a un fármaco antiinflamatorio que actúa a través de la inhibición de la COX-2. Aunque hemos empleado una miríada de herramientas quimioinformáticas para la identificación y validación del análogo A3 como posible inhibidor de la COX-2, se requiere una mayor autenticación experimental por parte de la comunidad científica para acelerar el proceso de desarrollo del fármaco.

En el presente estudio, se identificó un prometedor compuesto antiinflamatorio de origen vegetal contra la COX-2 empleando un enfoque computacional combinado que incluye estudios de simulación de acoplamiento molecular y cuántico. Se usó una estructura de proteína AF-COX-2 humana secuenciada completa validada para la alineación de secuencias múltiples para descubrir los residuos del sitio activo para la actividad antiinflamatoria. La detección virtual de 237 análogos de AGP frente a la proteína AF-COX-2, seguida de estudios de acoplamiento interactivos, evaluó 7 análogos de AGP exitosos que mostraron su candidatura similar a la de un fármaco también a partir del análisis de predicción de ADMET. Además, las métricas de eficacia del ligando, los descriptores DFT, es decir, HOMO, LUMO, HLG y EPE establecieron su buena reactividad química. Además, la simulación MD, la simulación de acoplamiento EPE y el estudio MM/GBSA revelaron que el análogo A3 (3-[2-[(1R,4aR,5R,6R,8aR)-6-hidroxi-5,6,8a-trimetil- 2-metiliden-3,4,4a,5,7,8-hexahidro-1H-naftalen-1-il]etiliden]-4-hidroxioxolan-2-ona) forma el complejo más estable con AF-COX-2 y sería un prometedor agente antiinflamatorio natural. En un futuro cercano, se requieren validaciones experimentales adicionales para corroborar estos hallazgos.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo y sus archivos de información complementaria. Los datos sin procesar o conjuntos de datos adicionales generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Los autores agradecen a la dirección del Vellore Institute of Technology, Vellore por facilitar las instalaciones para llevar a cabo este trabajo.

Escuela de Biociencias y Tecnología, Instituto de Tecnología de Vellore, Vellore, Tamil Nadu, 632014, India

Priyanka Jain y C. Sudandiradoss

Centro de Nanobiotecnología, Instituto de Tecnología de Vellore, Vellore, Tamil Nadu, 632014, India

Jitendra Satija

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PJ: Conceptualización y diseño del estudio. Análisis computacional, y redacción del primer borrador. Dr. CSD: Conceptualización, supervisión, curación de datos, revisión y edición. JS: Conceptualización, revisión y edición. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a C. Sudandiradoss.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Jain, P., Satija, J. y Sudandiradoss, C. Descubrimiento del análogo de andrografólido como un potente inhibidor de la ciclooxigenasa-2 a través de la simulación MD de consenso, la simulación de energía potencial electrostática y las métricas de eficiencia del ligando. Informe científico 13, 8147 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35192-7

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Recibido: 10 noviembre 2022

Aceptado: 14 de mayo de 2023

Publicado: 19 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35192-7

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