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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9445 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Las pseudomonas son metabólicamente flexibles y pueden prosperar en diferentes plantas hospedantes. Sin embargo, se desconocen las adaptaciones metabólicas necesarias para la promiscuidad del huésped. Aquí, abordamos esta brecha de conocimiento empleando RNAseq y comparando las respuestas transcriptómicas de Pseudomonas donghuensis P482 a los exudados de raíces de dos plantas hospedantes: tomate y maíz. Nuestro objetivo principal fue identificar las diferencias y los puntos comunes entre estas dos respuestas. Las vías reguladas al alza solo por los exudados de tomate incluyeron la desintoxicación de óxido nítrico, la reparación de grupos de hierro y azufre, la respiración a través del citocromo bd insensible al cianuro y el catabolismo de aminoácidos y/o ácidos grasos. Los dos primeros indican la presencia de donadores de NO en los exudados de las plantas de ensayo. El maíz indujo específicamente la actividad de la bomba de eflujo tipo MexE RND y la tolerancia al cobre. Los genes asociados con la motilidad fueron inducidos por el maíz pero reprimidos por el tomate. La respuesta compartida a los exudados parecía verse afectada tanto por los compuestos que se originaban en las plantas como por los de su entorno de crecimiento: la resistencia al arsénico y la síntesis de bacterioferritina aumentaron, mientras que la asimilación de azufre, la detección de citrato férrico y/u otros transportadores de hierro, la adquisición de hemo y el transporte de aminoácidos polares estaba regulado a la baja. Nuestros resultados proporcionan instrucciones para explorar los mecanismos de adaptación del huésped en microorganismos asociados a plantas.

Las plantas nutren las comunidades microbianas en la rizosfera liberando mezclas de compuestos orgánicos a través de las raíces1. Los exudados de las raíces contienen metabolitos primarios como ácidos orgánicos, aminoácidos, azúcares y metabolitos secundarios con propiedades bioactivas o de señalización. La composición química exacta de los exudados depende de la especie de planta y del estado fisiológico de la planta, este último depende de la etapa de desarrollo, la disponibilidad de nutrientes y la presencia de factores estresantes2. Las diferencias en la composición de los exudados y el funcionamiento de la inmunidad innata de la planta dan forma a la composición y la actividad de la microbiota de la raíz3.

Las bacterias Pseudomonas pueden prosperar en varios nichos ambientales, incluidas las raíces de varias plantas hospedantes. Su ventaja competitiva implica la flexibilidad metabólica y la producción de una amplia gama de metabolitos secundarios, incluidos compuestos antimicrobianos y captadores de hierro4. Muchas cepas asociadas a plantas facilitan el crecimiento de las plantas, alivian el estrés abiótico o protegen las plantas contra patógenos5. No existen estudios exhaustivos de la amplitud filogenética de las plantas que una determinada cepa de Pseudomonas puede colonizar. Sin embargo, ciertas pseudomonas han demostrado ser efectivas como agentes de biocontrol en especies de plantas diferentes a la de su origen o en múltiples cultivos, lo que sugiere que las pseudomonas son colonizadores de plantas bastante promiscuos6.

Cada vez se reconoce más que las especies de plantas seleccionan comunidades microbianas distintivas7, con plantas hospedantes filogenéticamente más distantes que reclutan las poblaciones de microbiota más distintas8. Por lo tanto, la aparente promiscuidad de hospedadores de algunos microorganismos, como las pseudomonas, plantea interrogantes sobre los cambios metabólicos que requieren las bacterias para colonizar múltiples hospedadores o para mantener una asociación con un hospedador que sufre cambios fisiológicos. Este problema ha sido difícil de abordar con los datos existentes, ya que la mayoría de los estudios abordan solo las interacciones huésped-microbio. Además, mientras que los determinantes de la especificidad del huésped en las interacciones planta-microbio se han estudiado en profundidad para los rizobios simbióticos, ha recibido poca atención en las bacterias que forman asociaciones menos íntimas con sus huéspedes9.

Pseudomonas donghuensis P482 es una cepa de control biológico que inhibe el crecimiento de varios patógenos vegetales bacterianos y fúngicos10,11. Aislada originalmente de la rizósfera del tomate (Solanum lycopersicum L.), la bacteria también puede colonizar la rizósfera de la papa12 y, como se muestra en este estudio, las raíces del maíz, lo que la convierte en un modelo prometedor para estudiar las características adaptativas del huésped en entornos promiscuos. bacterias colonizadoras de raíces.

En este trabajo, investigamos qué vías metabólicas pueden ser parte de una respuesta adaptativa de las pseudomonas a diferentes huéspedes vegetales mediante la identificación de genes de respuestas transcriptómicas diferenciadoras ("específicas del huésped") y compartidas ("independientes del huésped") de Pseudomonas donghuensis. P482 a exudados de raíces de dos especies de plantas filogenéticamente distintas: tomate (dicotiledóneas) y maíz (monocotiledóneas).

Los métodos de este estudio están de acuerdo con las directrices y leyes institucionales, nacionales e internacionales pertinentes. Los protocolos de este estudio también cumplen con la Declaración de política de la UICN sobre investigaciones relacionadas con especies en riesgo de extinción y la Convención sobre el comercio de especies amenazadas de fauna y flora silvestres.

El ensayo de colonización de la rizosfera se realizó utilizando P482 Rif, un mutante espontáneo resistente a la rifampicina de P48212. Las plantas se cultivaron durante 18 días en suelo no estéril a partir de semillas inoculadas con P482. Los detalles experimentales se pueden encontrar en Información complementaria (SI).

Tomate (Solanum lycopersicum L.) cv. Saint Pierre (Vilmorin Garden, Polonia) y maíz (Zea mays L.) cv. Bejm (proporcionado por el Plant Breeding and Acclimatization Institute, Smolice, Polonia) se cultivaron a partir de semillas.

Las semillas de tomate se esterilizaron tratándolas con etanol al 70 % durante 1 min, seguido de 3 min en NaOCl al 3 % y 3 enjuagues en agua destilada estéril. Las semillas de maíz se esterilizaron superficialmente tratándolas dos veces con NaOCl al 3 % durante 15 min, seguido de 10 min en etanol al 70 % y enjuagando 3 veces con agua destilada estéril. Las semillas esterilizadas superficialmente se germinaron en medio de germinación (GM) (0,5 × Murashige y Skoog Medium con vitaminas Gamborg B5, 2 % de sacarosa, 0,2 % de peptona de trigo y 0,7 % de agar vegetal, pH ≈ 6,1). La ventaja de usar GM es que, gracias a la adición de peptona, permite la detección de contaminación microbiana en las semillas en germinación. El tomate se germinó en la oscuridad a 24 °C, mientras que el maíz se germinó en la luz a 22 °C. Las semillas germinadas sin signos de infección se transfirieron a recipientes con arena de grano grande (1,4–2 mm) (AQUAEL, Polonia). Las condiciones de cultivo se optimizaron para el tamaño y los requisitos nutricionales de cada especie: el maíz se cultivó en frascos de vidrio de 900 ml en ¼ de medio de Hoagland, pH 5,6–5,8 (Mezcla de sal basal n.° 2 de Hoagland, Merck), 3 plántulas por frasco, mientras que el tomate se cultivó en recipientes GA-7 Magenta (Merck), 6 plantas por recipiente, en medio de ½ Hoagland. Las plantas se cultivaron durante 13 días a 22 °C, fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Ambas especies de plantas establecieron un segundo par de hojas dentro de este período.

Las plantas cultivadas en condiciones gnotobióticas se retiraron de la arena. Las raíces se lavaron en agua durante 2 a 4 min, se transfirieron a vasos de precipitados de vidrio que contenían agua estéril de alta pureza y se incubaron durante 2 h. Algunas hojas de las pequeñas plantas de tomate tocaron la superficie del agua. Se recolectaron exudados de 174 plantas de tomate y 48 plantas de maíz para obtener suficientes exudados para cultivos bacterianos (RNAseq) y análisis químicos. Este número de plantas produjo 4,5 mg de exudado de tomate y 6,6 mg de exudado de maíz. Las muestras de cada especie se agruparon y se esterilizaron por filtración a través de una membrana de PES de baja unión de 0,22 µm (Thermo Scientific). Las muestras se congelaron a -80 °C y se liofilizaron.

El análisis no dirigido de la composición química de los exudados de la raíz se realizó mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y resonancia magnética nuclear (NMR). La cantidad relativa de 21 aminoácidos se evaluó con espectrometría de masas de monitorización de reacción seleccionada por cromatografía líquida (LC-SRM). Todos los detalles se proporcionan en Información complementaria (SI).

P482 se cultivó a 28 °C en medio 1C (sales M9, Mg2SO4 2 mM, CaCl2 0,1 mM, glucosa al 0,4 %13), con o sin (control) exudados liofilizados de tomate o maíz. El experimento se realizó en placas de 96 pocillos, incubadas con agitación orbital en un lector de microplacas EPOCH (BioTek), midiendo la DO600 cada 20 min. Se probaron tres concentraciones de exudados (0,02 mg L-1, 0,1 mg L-1, 0,2 mg L-1) para verificar su impacto en los parámetros de crecimiento de P482 (Fig. S1). La concentración más alta se aplicó más tarde para hacer crecer las células para interrogarlas con RNAseq, ya que se consideró que la concentración más alta probablemente daría como resultado cambios en la expresión génica inducidos por el exudado. El pH de los medios se midió antes de la inoculación y después del crecimiento de P482 hasta una fase estacionaria temprana utilizando tiras indicadoras de pH MQuant (Supelco).

Las bacterias se recolectaron al llegar a la fase estacionaria temprana, luego de 33 h de crecimiento en medio 1C sin suplementos y 24 y 28 h, respectivamente, para el crecimiento en medio 1C con exudados de maíz o tomate (OD600 0.35–0.48) (Fig. S1). Para cada tratamiento, se recogieron por centrifugación tres grupos de células (aprox. 109) y se fijaron con fixRNA (Eurx, Polonia). Cada grupo se trató como una réplica biológica separada en el RNAseq corriente abajo. El ARN total se aisló utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen). El ARN purificado se trató con el kit TURBO DNA-free™ (Thermo Fisher Scientific). La ausencia de contaminación por ADNg se confirmó mediante PCR en tiempo real con cebadores dirigidos a gyrB.

Se secuenciaron nueve muestras de ARN, con 3 réplicas biológicas para cada uno de los dos tratamientos de exudado y el control (medio 1 C solo). La evaluación de la integridad del ARN, el agotamiento del ARNr, la preparación de la biblioteca, la secuenciación de Illumina (mín. 5 GB por muestra), el ensamblaje del transcriptoma y el análisis de la expresión génica diferencial se subcontrataron a Baseclear (Leiden, Países Bajos). Las lecturas de secuencias de ARN filtradas se asignaron al genoma de referencia de P482 (Genbank: JHTS00000000.1)14. Las estadísticas posteriores al filtrado y la alineación están disponibles en las tablas S1 y S2, respectivamente. Se aplicó el análisis de componentes principales para verificar si las muestras replicadas forman grupos separados (Fig. S2). El análisis de expresión génica diferencial se realizó utilizando DESeq2 1.22.215. Los análisis adicionales se realizaron internamente. Los cambios en la expresión génica se filtraron por significancia biológica (cambio de 1,5 log2 veces (FC)) y estadística (p <0,05; valor de p ajustado, corrección de Benjamini-Hochberg (B-H) para controlar la tasa de descubrimiento falso (FDR)). Los genes con padj> 0.05 y aquellos a los que no se les pudo asignar el valor ajustado (NA) se excluyeron del análisis posterior. Los grupos superpuestos de genes expresados ​​diferencialmente se visualizaron con BioVenn16. Las proteínas se asignaron a grupos de grupos ortólogos (COG) utilizando el mapeador eggNOG 5.017 y a las vías metabólicas KEGG utilizando BlastKOALA18,19,20,21. El enriquecimiento dentro de las vías COG y KEGG se estableció utilizando el genoma de P482 como referencia (JHTS00000000.1), con la prueba exacta de Fisher aplicada para determinar la significación estadística (p < 0,05; valor p ajustado, corrección B-H). Las redes de genes y el enriquecimiento de grupos se analizaron mediante STRING 11.5 (mayo de 2023)22, con el genoma de P. donghuensis HYS como referencia11.

Los datos de RNAseq se validaron mediante RT-qPCR utilizando seis objetivos con diferentes patrones de expresión: BV82_3254, mexE, norC, ssuC, trpB e ytfE. La transcripción inversa y la qPCR en tiempo real se realizaron como se describió anteriormente23. Los detalles del cebador están disponibles en la Tabla S3. El tamaño de los amplicones se confirmó mediante electroforesis en gel (Fig. S3). El análisis de expresión génica se realizó con qbase + 24. Los genes de referencia aplicados, gyrB y rpoD, se eligieron en base a nuestro trabajo previo23 y se confirmó su estabilidad en el conjunto de datos analizados (promedio M = 0,543; CV = 0,181). La expresión se escaló a las muestras procedentes de P482 cultivadas en medio 1C sin exudados (sin tratar). La significación estadística de las diferencias en la expresión se evaluó usando una prueba t no pareada.

P482 Rif estuvo presente en las raíces de plantas de tomate y maíz de 18 días de edad cultivadas en suelo a partir de semillas inoculadas. Según las medias aritméticas, el tamaño de la población en las raíces del tomate fue aproximadamente diez veces mayor que el de las raíces del maíz, ascendiendo a 1,54 × 107 CFU g-1 en tomate y 2,35 × 106 CFU g-1 en maíz (Fig. S4). Cuando se consideraron los valores medianos, la diferencia fue de 25 veces, con tamaños de población de 8,1 × 106 CFU g-1 y 3,1 × 105 CFU g-1 para tomate y maíz, respectivamente. A pesar de la diferencia, los tamaños de población de P482 en ambas plantas pueden considerarse altos, lo que implica que la cepa puede adaptarse para colonizar ambos huéspedes.

Se realizó un perfil de transcriptoma completo para células P482 cultivadas en presencia de exudados de raíces de tomate o maíz (0,2 mg L-1), los cuales estimularon el crecimiento de la bacteria en comparación con el medio 1C solo (Fig. S1A, B). Se detectaron 5168 genes en el transcriptoma, cubriendo el 99% del genoma completo. La confiabilidad de medir la abundancia de transcritos por RNAseq se confirmó utilizando qPCR en tiempo real de transcripción inversa (RT-qPCR) para objetivos seleccionados (Fig. S5).

Los exudados de tomate alteraron la expresión de 413 genes (7,99%) en comparación con el medio sin suplementar. Estos se denominan genes expresados ​​diferencialmente inducidos por el tomate (tiDEG). Los exudados de maíz influyeron en la expresión de 181 genes (3,51 %), más conocidos como miDEG (DEG inducidos por maíz) (Fig. 1). El hecho de que hubiera más tiDEG que miDEGS, y que tuvieran un valor log2FC medio más alto (2,27 log2FC frente a 2,14 log2FC; conjunto de datos S1), sugiere que la respuesta de P482 a los exudados de tomate fue más amplia y más pronunciada que la de los exudados del maíz. Es una pregunta abierta si esto está relacionado con el hecho de que el maíz no es el huésped original de P482. Se informó una escala de respuesta transcriptómica similar a la de P482 y tomate para P. aeruginosa PAO1 creciendo en medio CAA suplementado con exudados de remolacha (Beta vulgaris)25. En el último estudio, destinado a identificar genes nuevos y presumiblemente específicos del huésped involucrados en las interacciones planta-microbio, los autores compararon la respuesta de PAO1 a los exudados de dos variedades de remolacha, Celt y Roberta, conocidas por seleccionar diferentes comunidades microbianas. Según la variedad, el 9,30% y el 8,13% del transcriptoma de PAO1 se vio afectado por exudados.

Diagrama de Venn que representa los subconjuntos de genes en los transcriptomas activados por tomate y maíz de P. donghuensis P482 (A), y la proporción de genes regulados al alza y a la baja en cada subconjunto (B). tiDEGs (413) y miDEGs (181) mostraron una expresión significativamente diferente en respuesta a los exudados de raíces de tomate o maíz, respectivamente, en comparación con el medio sin suplementos (control). Por el contrario, los genes de la respuesta diferenciadora (GDRs, 278), un conjunto rodeado por una línea de puntos, mostraron un cambio significativo en la expresión entre los dos tratamientos con exudado. Los genes de respuesta compartida (SRG, 63) se establecieron por superposición de miDEG, tiDEG y GDR, y comprenden genes afectados por ambos tipos de exudados de manera similar. Los subconjuntos adicionales resultantes de la superposición son GDR específicos de tomate (150) y GDR específicos de maíz (34). Éstos cumplían simultáneamente dos criterios: estaban entre los GDR y, al mismo tiempo, su expresión era significativamente diferente que en el medio cuando se trataba con un solo tipo de exudado. Puntos de corte significativos para un cambio significativo en la expresión: p < 0,05 (padj; corrección B-H); log2FC > 1.5. Se puede encontrar una lista de loci en cada subconjunto en Dataset S6. En el panel B, los genes regulados al alza se muestran en magenta (a la izquierda) y los genes regulados a la baja están en azul (a la derecha). Tanto el porcentaje de genes como el recuento real de ORF se indican en los gráficos.

Nuestro objetivo en este estudio fue identificar vías metabólicas que son: (1) diferencialmente y (2) reguladas de manera similar en P482 en respuesta a los exudados de tomate y maíz. Para hacer eso, determinamos dos grupos de genes dentro del transcriptoma: genes de la respuesta diferenciadora (GDR) y genes de respuesta compartida (SRG). Los GDR (278 genes) son genes con una expresión significativamente diferente entre los dos tratamientos de exudado (Fig. 1; Conjunto de datos S2). Por el contrario, los SGR (63 genes) muestran respuestas similares a los exudados independientemente de la planta de origen. La superposición de GDR, tiDEG y miDEG determinó el grupo de SGR. Este análisis también permitió distinguir subconjuntos de GDR que denominamos GDR específicos de tomate (150 genes) y GDR específicos de maíz (34 genes) (Fig. 1; Conjunto de datos S2). Los genes en los subconjuntos de GDR específicos de plantas cumplían simultáneamente con dos criterios: mostraban una expresión diferente en los dos tratamientos de exudado (> 1,5 log2FC, padj < 0,05), lo que los convertía en GDR, pero también su expresión era significativamente diferente (> 1,5 log2FC, padj < 0,05) en comparación con el medio 1C tras el tratamiento con solo uno de los exudados. Los GDR específicos del tomate y del maíz, junto con los SGR, se analizaron en busca de genes regulados hacia arriba y hacia abajo de alto rango (Tablas S4–S6). El establecimiento de GDR específicos de plantas nos ayudó a asignar ciertos aspectos de la respuesta diferenciadora general a una de las plantas. También evitó la subnotificación de los aspectos de la respuesta diferenciadora impulsados ​​por el maíz, considerando que los exudados de tomate, con una proporción más significativa de GDR, son el impulsor dominante de los cambios generales.

Se analizó el grupo completo de 278 GDR (respuesta diferenciadora) y 63 SGR (respuesta compartida) para el enriquecimiento de KEGG y COG y la creación de redes de genes (Figs. 2, 3; Conjuntos de datos S3–S4). Los hallazgos más interesantes se presentan y discuten a continuación, mientras que algunas vías menores se describen en SI.

Las vías KEGG y las categorías COG se enriquecieron significativamente dentro de las respuestas transcriptómicas compartidas (A, B) y diferenciadas (C, D) de P482 a los exudados de raíces de tomate y maíz. Para genes individuales dentro de las vías: el rojo y el azul indican regulación al alza y regulación a la baja de la expresión génica, respectivamente; la columna de la izquierda muestra cambios en la expresión (log2FC) al agregar exudado de tomate (letra T), y la columna de la derecha al agregar exudado de maíz (letra M). Categorías KEGG: a—metabolismo de carbohidratos, b—procesamiento de información ambiental, c—metabolismo de aminoácidos. Los genes que se muestran en negrita se enumeran dentro de las rutas KEGG y los COG enriquecidos. Los genes subrayados se superponen entre categorías dentro de las vías KEGG.

Redes de genes para los 63 genes de los genes compartidos (A) y 278 de la respuesta transcriptómica diferenciadora (B) de P482 a los exudados de raíces de plantas. El análisis se realizó utilizando STRING con el genoma de P. donghuensis HYS como referencia, y la imagen se curó manualmente. Cada nodo representa un gen de P482 con un nombre asignado con eggNOG. Los nodos rellenos marcan genes que pertenecen a grupos enriquecidos identificados por STRING (mapa: vía KEGG, CL: grupo, GO: ontología de genes, PF, IPR: dominios de proteínas). Los bordes de la red indican confianza. Interacción basada en todas las fuentes disponibles para la versión 11.5 (mayo de 2023). Puntuación de interacción mínima 0,4 (media). Los nodos desconectados se deshabilitaron, a excepción de los genes que se descubrió que formaban parte de grupos enriquecidos. Cada gen se puede emparejar con una designación de locus utilizando Dataset S5. La lista completa de STRING interacciones y los grupos enriquecidos se proporciona en Dataset S4.

Los GDR representaron el 5,38% del transcriptoma, con una proporción aproximadamente igual de regulados a la baja y regulados al alza. En comparación, los SGR representaron el 1,22% del transcriptoma, la mayoría de ellos regulados a la baja (76%) (Fig. 1). Por lo tanto, el conjunto de genes afectados de manera diferente por dos huéspedes en P482 fue de aprox. 4,5 veces mayor que el conjunto de genes de la respuesta compartida. Lo mismo se observó para PAO1 en dos variedades de remolacha25. En el caso de distintas plantas hospedantes, como el tomate y el maíz, es tentador atribuir este efecto a las diferencias generales relacionadas con las especies en la composición de los exudados. Sin embargo, el hecho de que se observara una tendencia similar para dos variedades de una sola especie de planta, la remolacha, sugiere que cambios relativamente menores en la composición de los compuestos derivados de plantas pueden tener un impacto revolucionario. De acuerdo con esta suposición, se ha demostrado que compuestos como los benzoxazinoides y las cumarinas ejercen por sí solos un efecto profundo en la composición de la microbiota asociada a las raíces26,27.

Ambos tratamientos de exudado causaron la regulación a la baja de los genes P482 dentro de las vías superpuestas para el 'metabolismo del azufre' y los 'transportadores ABC' (Fig. 2a, Tabla 1). Esto incluía genes que codifican los componentes CysW y CysA de la permeasa de sulfato-tiosulfato (SulT). El sulfato y el tiosulfato representan fuentes inorgánicas de azufre utilizadas por las bacterias28. En ausencia de sulfato inorgánico o cisteína, las bacterias pueden usar alcanosulfonatos, incluida la taurina, como fuentes alternativas de azufre28. En P482, ambos exudados regularon a la baja la expresión de tauBC y ssuBC, implicados en la importación de taurina y otros alcanosulfonatos. Se observó una influencia similar para ssuD y tauD, involucradas en la liberación de azufre de esos compuestos29. Además, STRING permitió la identificación de otro gen regulado a la baja posiblemente involucrado en la adquisición de azufre en P482, el sfnR (Fig. 3a). En Pseudomonas putida DS1, se encontró que sfnR era necesario para obtener azufre a partir de sulfuro de dimetilo (DMS)30.

Los resultados muestran que ambos tipos de exudados disminuyen la expresión de múltiples genes relacionados con la adquisición de azufre. También se observó regulación a la baja de los genes ssu, o de los genes ssu y tau, en 6 de 8 Pseudomonas spp. cepas expuestas a los exudados de raíces del pasto Brachypodium distachyon31. Se cultivaron plantas de maíz y tomate para los experimentos P482 y B. distachyon para los experimentos con otras pseudomonas en medio de Hoagland que contenía sulfatos (MgSO4, ZnSO4, CuSO4). Esto podría influir potencialmente en la disponibilidad de azufre en los exudados de las raíces de las plantas cocultivadas. Por otro lado, en ambos estudios se detectó cisteína y metionina en los exudados, que pueden ser una fuente de azufre orgánico para la bacteria Pseudomonas.

La respuesta común de P482 a los exudados incluyó la regulación positiva de arsC y arsH (Tabla 1). Ambos genes están relacionados con el metabolismo del arsénico, un metaloide altamente tóxico. El arsénico es omnipresente en el medio ambiente, incluido el suelo; por lo tanto, las bacterias han desarrollado diferentes mecanismos para procesarlo32. ArsC es una arseniato reductasa que transforma el arseniato pentavalente (As(V)) en arsenito trivalente (As(III)) antes de la salida de As(III) de cell33. El segundo gen sobrerregulado en P482, arsH, confiere resistencia de ciertos microorganismos a organoarsenicales como las formas trivalentes del herbicida metilarsenato monosódico y el aromático fenilarsenito arsénico33.

Se considera que la mayoría de las especies de arsénico metilado en el ambiente son de origen microbiano. Se informó que algunos microorganismos utilizan arsenicales metilados como armas contra sus competidores microbianos34. Las plantas, a diferencia de los microbios, no metilan los arsenicales35. En cambio, absorben arsenicales inorgánicos del suelo en forma de arseniato, probablemente a través de los transportadores de fosfato debido a la similitud de esas moléculas, y lo extruyen de regreso al suelo a través de las raíces una vez que se reduce a arsenito trivalente36. Nuestra hipótesis es que la expresión regulada al alza de arsC y arsH en P482 podría haber sido provocada por arseniato y organoarsenicales transferidos a las raíces desde el sustrato arenoso utilizado para el cultivo de tomate y maíz.

Una de las categorías del COG enriquecidas dentro de la respuesta compartida fue 'Transporte y metabolismo de iones inorgánicos/Mecanismo de transducción de señales'. Esta categoría de doble función estuvo representada por siete genes similares a fecR (Tabla 1). Las proteínas FecR son sensores transmembrana involucrados en la transducción de señales. En Escherichia coli, FecR coopera con el factor sigma FecI y la proteína receptora FecA para dirigir la expresión del operón fecABCDE implicado en la captación de citrato férrico37. Sin embargo, las especies bacterianas pueden albergar muchos genes similares a fecR. En el genoma de P. aeruginosa, hay catorce genes similares a fecR ubicados junto a los factores sigma de privación de hierro que pueden inducirse potencialmente en presencia de diferentes transportadores de hierro afines38. Además de usar sideróforos hechos por ellos mismos, las pseudomonas pueden usar los producidos por otras bacterias o plantas, transfiriendo el costo energético de su producción a otros organismos39, un fenómeno conocido como 'piratería de sideróforos'40.

Otras fuentes de hierro que pueden utilizar las pseudomonas son las moléculas hemo liberadas de las hemoproteínas41. Entre los SGR de P482, el gen que muestra la regulación a la baja más significativa codifica una proteína de la familia A que se une a hemo (− 6.8 log2FC) (Tabla S6). Otros genes implicados en la captación y el metabolismo del grupo hemo también estaban regulados a la baja. Estos incluyeron: hasR, hemO, hmuU y hmuV, y hasD (Tabla 1).

Para abordar aún más cómo la adición de exudados de raíces influyó en la disponibilidad de hierro para P482 en nuestros experimentos, investigamos los niveles de expresión de 3 genes: BV82_1009, una sintasa de tipo NRPS involucrada en la síntesis del potente sideróforo pioverdina; BV82_1008, (pvdS), un factor sigma implicado en la regulación de la síntesis de pioverdina, y BV82_4709 implicado en la síntesis de 7-hidroxitropolona, ​​un compuesto con propiedades antimicrobianas y captadoras de hierro más características de P. donghuensis11. Los exudados de raíces no afectaron la expresión de ninguno de estos genes (Conjunto de datos S5). La expresión de pioverdina tampoco aumentó en ninguna de las ocho cepas de Pseudomonas cultivadas en exudados de raíces de B. distachyon31. En el último estudio, la regulación positiva de otros genes relacionados con la adquisición de hierro se observó solo en la mitad de estas cepas. Estos incluyeron: transportadores de dicitrato de hierro (cepas SBW25 y 30–84), biosíntesis de sideróforos ornicorrugatina (SBW25) y pioquelina (cepa Pf-5), enzimas degradantes de hemo (2–79, 30–84) y genes asociados a TonB (2-79 y Pf-5). En otro estudio, la expresión de genes relacionados con la adquisición de hemo y la síntesis de pioverdina en P. protegens CHA0 fue relativamente baja en respuesta al trigo en comparación con lo observado durante la infección de insectos42.

En contraste con la regulación a la baja de los genes para la adquisición de hierro, los exudados de las raíces tanto del tomate como del maíz aumentaron significativamente la expresión del gen bfr de la bacterioferritina involucrado en la homeostasis del hierro intracelular. Bfr funciona en el almacenamiento de hierro que, cuando está presente en exceso en forma libre, puede causar estrés oxidativo en las células a través de la generación de especies reactivas de oxígeno43. Se demostró que la bacterioferritina y las proteínas que interactúan con Bfr son esenciales para la resistencia al estrés y la virulencia en patógenos de plantas y animales44,45. También desempeñan un papel en los simbiontes de las plantas que nodulan las raíces46.

La regulación positiva de Bfr en P482 es otra premisa indirecta de que los exudados de la raíz por sí solos no limitan el hierro para P482 y al menos algunas otras pseudomonas. Sin embargo, es muy probable que P482 necesite emplear sus mecanismos de captación de hierro en presencia de competidores microbianos.

Tras la exposición de P482 a ambos exudados, observamos una mayor expresión de tagQ, pppA y crp. En P. aeruginosa, tagQ y pppA están involucrados en la cascada regulatoria que controla la activación del sistema de secreción tipo VI (T6SS), siendo pppA considerado un regulador negativo de T6SS47. El tercer gen, crp, codifica una proteína similar al receptor de AMP cíclico. Los informes sobre el papel de Crp en la regulación de T6SS son escasos y se refieren a Vibrio cholerae, donde se sugirió que Crp era un regulador positivo de T6SS48. En general, nuestros resultados sugieren que la presencia de exudados de raíces tiene algún impacto en T6SS en P482 cultivados en monocultivos. Sin embargo, la dirección de este impacto requiere más estudios. También podemos suponer que la expresión de genes relacionados con T6SS sería diferente en presencia de (micro)organismos competidores. El T6SS permite que las bacterias inyecten proteínas en otras células procariotas o eucariotas y es mejor conocido por su papel en la competencia interbacteriana49.

El P482 tratado con tomate mostró los síntomas del estrés causado por el óxido nítrico (también conocido como estrés nitrosativo). El óxido nítrico es una molécula de libre difusión que ejerce efectos tóxicos sobre las células. Para contrarrestar el estrés nitrosativo, las bacterias han desarrollado varias vías para convertir el NO en moléculas no dañinas como N2O, NO3− o amoníaco50. Uno de los dos genes con la regulación positiva más sustancial en P482 fue el hmp (BV82_4743) que codifica la flavohemoglobina (Hmp). La expresión de este gen aumentó mucho (6,13 log2FC) en P482 cultivado en exudados de tomate pero no en maíz. En condiciones aeróbicas, Hmp cataliza la reacción de NO con oxígeno para producir nitrato (NO3−)51. Se observó un patrón similar de cambios en la expresión génica en norD, norC y norB que codifican óxido nítrico reductasa (NOR). Esta enzima integrada en la membrana cataliza la reducción del óxido nítrico (NO) a óxido nitroso (N2O)52. Hmp y NOR son componentes bien documentados del mecanismo de desintoxicación de NO en bacterias.

El NO que actúa sobre una célula bacteriana puede tener su origen en el medio ambiente o ser generado por las propias células. El NO es un intermediario conocido en una reducción gradual de nitrato, a través de nitrito, a óxido de nitrógeno53. Este proceso, llamado desnitrificación, puede ser realizado por algunas bacterias Pseudomonas bajo disponibilidad limitada de oxígeno para superar la escasez de oxígeno como aceptor terminal de electrones en la respiración54. La formación de NO a partir de nitrito en el segundo paso de la desnitrificación requiere la actividad de NirS, una nitrito reductasa periplásmica del citocromo cd1 que transporta los cofactores hemo c y hemo d155. P. donghuensis P482 posee un homólogo de nirS (BV82_3250) y homólogos de muchos otros genes del grupo nir (nirCFLGHNBDJM). En P482 tratado con exudados de tomate, la regulación positiva de los genes desintoxicantes de NO no estuvo acompañada por la inducción de genes nir. Por lo tanto, la causa subyacente de la activación de las vías de desintoxicación de NO en P482 no es un cambio de desnitrificación, sino más bien hacer frente a la toxicidad del NO exógeno presente en los exudados de tomate.

Los efectos nocivos del NO resultan predominantemente de la inactivación de proteínas que contienen grupos de hierro-azufre (Fe-S)56,57. Los clústeres de Fe-S son cofactores proteicos redox activos presentes en casi todos los organismos y necesarios para muchos procesos bioquímicos fundamentales58. En P482 tratado con tomate, observamos una importante regulación al alza de yftE (6,36 log2FC), conocida por su función en el metabolismo/reparación de grupos de Fe-S. Los homólogos de ytfE están presentes en numerosas bacterias59, y el gen se regula positivamente de forma constante tras la exposición bacteriana a NO60. Se demostró que la proteína YftE contribuye a la supervivencia de Yersinia pseudotuberculosis en el bazo después del estrés nitrosativo y contribuye a la virulencia de este patógeno humano57. Otro gen, cuya expresión fue significativamente inducida por exudados de tomate, es el nnrS (BV82_3241). NnrS es una proteína transmembrana que contiene hemo y cobre que contribuye a la tolerancia al estrés por NO en Vibrio cholerae al aliviar el estrés causado por la formación de complejos de hierro-NO61. Cabe destacar que yftE y nnrS forman un solo grupo de genes (BV82_3238 a BV82_3246) con los genes que codifican NOR y dos reguladores: norR y dnr. La tensión en los grupos de Fe-S causada en P482 por los exudados de tomate se confirma aún más por la regulación al alza de los genes iscR, iscS, iscU, iscA, hscB, hscA y fdx (Fig. 3b) que codifican proteínas relacionadas con la biogénesis del grupo de azufre62.

Los huéspedes eucarióticos pueden producir óxido nítrico como parte de la defensa durante la infección63. Las plantas utilizan el NO como molécula señalizadora en respuesta al estrés biótico y abiótico ya una amplia gama de procesos fisiológicos, como la germinación, el desarrollo, la floración y la senescencia64. Dado que el NO es altamente reactivo, se almacena en S-nitrosotioles (SNO), que actúan como reservorios de NO in vivo64. El NO juega un papel en la respuesta de las plantas a los patógenos microbianos, pero también es crucial para establecer interacciones simbióticas entre los rizobios y las leguminosas65. Se sugirió que el NO podría ser una molécula de señalización esencial en la comunicación entre plantas y microbios64. En el caso de P482, es importante señalar que la aparente presencia de factores que causan estrés nitrosativo en los exudados de tomate no influyó negativamente en la tasa de crecimiento de P482 in vitro (Fig. S1). Esto implica que P482 está bien adaptado para hacer frente a las condiciones encontradas.

Las pseudomonas poseen una cadena respiratoria ramificada. Se sabe que cinco oxidasas terminales diferentes operan en P. aeruginosa, lo que permite que la bacteria explote una cadena de transporte de electrones que mejor se adapte a las circunstancias dadas54. En P482, en respuesta a exudados de tomate pero no de maíz, observamos una regulación a la baja de los genes ccoN, ccoO, ccoQ y ccoP que codifican las subunidades de una citocromo c oxidasa de tipo cbb3. Esta oxidasa tiene una alta afinidad por el oxígeno y es vital para la supervivencia celular en condiciones microaeróbicas66. Contrariamente a los genes cco, cioA y cioB que codifican oxidasa insensible al cianuro (CIO) del citocromo bd estaban regulados al alza. Los microorganismos que pueden cambiar a la vía CIO pueden soportar altas concentraciones de cianuro de hidrógeno, que bloquea la respiración a través de las citocromo c oxidasas67. La cepa P482 es capaz de producir cianuro de hidrógeno68. Sin embargo, en P482 expuesto a exudados de tomate, los genes hcnA y hcnB que codifican la cianuro de hidrógeno sintasa estaban regulados a la baja, lo que implica que la expresión regulada al alza del citocromo bd insensible al cianuro en esta cepa no ocurre para contrarrestar la toxicidad de los altos niveles de cianuro de hidrógeno de producción propia. .

Aunque los genes cio se asociaron inicialmente con la resistencia bacteriana al cianuro de hidrógeno, otros factores pueden afectar su expresión. El citocromo bd insensible al cianuro juega un papel durante la limitación de cobre en condiciones aeróbicas69 y confiere tolerancia bacteriana al estrés oxidativo y nitrosativo70. Además, cioA participó en la evasión de las defensas del huésped por parte de Pseudomonas sp. WCS365 durante la interacción con Arabidopsis thaliana71.

Presumimos que un cambio hacia el citocromo bd (CIO) en P482 tratado con exudados de tomate se debe a la presencia de inhibidores del complejo citocromo bc1 y/u óxido nítrico. Se requiere el complejo de citocromo bc1 para pasar los electrones a las oxidasas de citocromo c como cbb3, pero no a CIO, que recibe electrones directamente de la ubiquinona54,72. El efecto bactericida de los inhibidores de bc1 se mejoró enormemente con la adición simultánea de donadores de NO en Mycobacterium tuberculosis, un efecto que las bacterias intentaron contrarrestar cambiando a la vía del citocromo bd73. La citocromo bd oxidasa es más resistente a la inhibición del NO debido a la rápida tasa de disociación del NO de su sitio activo.

El metabolismo intermediario en P482 fue afectado predominantemente por los exudados de tomate. Tres vías KEGG superpuestas se enriquecieron dentro de la respuesta diferenciadora: 'Metabolismo de piruvato', 'Metabolismo de propanoato' y 'Degradación de valina, leucina e isoleucina'. Esos comparten genes con COG enriquecidos relacionados con la 'producción y conversión de energía' (Fig. 2c, d).

Los exudados de tomate aumentaron la expresión de lpdV, bkdB, bkdA2 y pdhA (Tabla 1). Los productos proteicos de estos genes son los componentes del complejo alfa-ceto deshidrogenasa de cadena ramificada, uno de los tres complejos multienzimáticos que metabolizan piruvato, 2-oxoglutarato y 2-oxoácidos de cadena ramificada. La función general de estos complejos es la conversión de alfa-cetoácidos en acil-CoA y CO2. Los alfa-cetoácidos a menudo surgen por desaminación oxidativa de aminoácidos y, recíprocamente, son los precursores para sintetizarlos74. La 2-oxoisovalerato deshidrogenasa codificada por bkdA2 y pdhA es una enzima que participa en la degradación de los aminoácidos de cadena ramificada (BCAA): valina, leucina e isoleucina75. En P482, observamos una regulación positiva simultánea de mmsA y mmsB. En P. aeruginosa, el operón mmsAB está implicado en el metabolismo de la valina, y la alteración de estos genes provocó un crecimiento prolongado de la cepa en el medio de valina/isoleucina76. En algunas bacterias, la disponibilidad de BCAA parece tener funciones reguladoras y juega un papel en procesos como la proliferación durante la infección y la evasión de las defensas del huésped78. A diferencia de lo que observamos para P482 en presencia de exudados de tomate, tanto S. typhimurium como E. fredii aumentaron la síntesis de BCAA, y no su catabolismo, cuando se expusieron a los exudados de lechuga y maíz intercalado, respectivamente79,80.

Aparte de BCAA, el catabolismo de otros tres aminoácidos parece ser inducido en P482 tras el tratamiento con exudado de tomate. Esto incluía fenilalanina (genes phhA, phhB y phhC), glicina (gcvH y gcvP) y metionina (aceE/mdeB, mdeA) (Tabla 1).

Otros cambios metabólicos en P482 asociados con un mayor catabolismo de aminoácidos y/o ácidos grasos incluyen la regulación al alza de las acil-CoA deshidrogenasas MmgC e Ivd, que catalizan la deshidrogenación α, β de los ésteres de acil-CoA81, y la regulación al alza de la isocitrato liasa que codifica aceA, este último implica la activación de la derivación de glioxilato (GS). Muchas bacterias activan GS cuando el acetil-CoA, derivado del catabolismo de aminoácidos o ácidos grasos, es la principal fuente de carbono y energía disponible para la célula82. El ciclo clásico del ácido tricarboxílico (TCA) no puede asimilar el carbono y reciclar el citrato cuando el acetil-CoA es la única fuente de carbono disponible debido a la pérdida de CO2 y la incapacidad de reciclar el oxaloacetato. El GS pasa por alto los pasos de producción de dióxido de carbono del TCA y desvía parte del flujo de carbono al isocitrato. Aparte de su papel esencial en el metabolismo del acetato y los ácidos grasos, la derivación de glioxilato puede desempeñar un papel aún poco explorado en la patogénesis y la defensa contra el estrés. La expresión de aceA en P. aeruginosa aumentó bajo estrés oxidativo inducido por H2O2 y bajo condiciones limitantes de hierro y está relacionada con la homeostasis del hierro intercelular72. Esta vía metabólica también es central para el crecimiento y la virulencia de P. aeruginosa durante la infección cuando la bacteria muestra preferencia por el catabolismo de los ácidos grasos83. Además, se demostró que la derivación del TCA y el cambio hacia la utilización de aminoácidos aumentan la resistencia a los antibióticos en P. aeruginosa84. Curiosamente, la GS se activó en el patógeno humano Salmonella cuando se cultivó con exudados de lechuga79.

Aquí, analizamos el contenido de exudado inicial (descripción detallada en SI). El análisis LC-SRM del contenido relativo de aminoácidos en los exudados de maíz y tomate mostró que la valina y la leucina de BCAA fueron aproximadamente 4 veces más abundantes en los exudados de maíz que en los de tomate, el contenido de isoleucina fue igual en ambas muestras (Tabla S7) . La cantidad de fenilalanina y triptófano fue 4,5 y 2,3 veces mayor en maíz que en tomate, respectivamente. La abundancia de metionina en los dos exudados no difirió. Por lo tanto, no es el caso que los aminoácidos, cuyo catabolismo está regulado al alza en P482 tratado con exudados de tomate, sean más abundantes en este tratamiento. En nuestra configuración experimental, se evaluó la influencia de la suplementación con exudado en P482 en un medio mínimo que contenía glucosa. Esto convirtió a la glucosa en la fuente de carbono más abundante en tratamientos y control. Se aplicó un enfoque similar en el estudio sobre la influencia de los exudados de B. distachyon en diferentes Pseudomonas spp.31. Es posible que P482, en cultivos con exudados de tomate, agotara la glucosa más rápido que en las muestras suplementadas con maíz. Por lo tanto, en el momento de la cosecha, las células tratadas con tomate ya usarían aminoácidos para apoyar su crecimiento. El análisis no dirigido usando 1H-NMR reveló que la glucosa, aunque muy abundante en los exudados de maíz (9947 ng mg−1), no estaba presente en los exudados de tomate (Tabla S8, Figs. S6, S7). Sin embargo, sigue siendo cuestionable si la cantidad de glucosa añadida con los exudados sería suficiente para tener tal impacto en la disponibilidad total de glucosa en medio 1C.

Proponemos que un cambio al catabolismo de aminoácidos en P482 tratado con tomate tiene como objetivo aumentar la resistencia de las células a los factores estresantes de manera similar a como se informó para P. aeruginosa en modelos de infección humana83,84. La presencia de NO, que daña los grupos de Fe-S en los centros activos de algunas enzimas, puede comprometer ciertas rutas metabólicas. En tal caso, el cambio observado en el metabolismo intermediario de P482 no estaría impulsado por una preferencia por fuentes de carbono específicas y su disponibilidad en los exudados, sino más bien por la elección de rutas metabólicas menos sensibles al estresor particular. Los factores estresantes derivados de las plantas pueden ser específicos de la especie o estar relacionados con el estado fisiológico de una planta determinada. La precisión de esta hipótesis requiere más estudios.

En presencia de exudados de tomate, la expresión de genes que codifican triptófano sintasa, trpA y trpB se reguló significativamente, lo que implica una síntesis reducida de triptófano por parte de P482. El triptófano es un aminoácido aromático proteinogénico que también puede ser un precursor de moléculas de señalización como la hormona vegetal ácido indol-3-acético (IAA), la quinurenina y la señal de quinolona de Pseudomonas (PQS)85. Por el contrario, observamos una regulación positiva significativa de metE (4.73 log2FC). MetE es un 5-metiltetrahidropteroiltriglutamato, una homocisteína S-metiltransferasa que cataliza la transferencia de un grupo metilo del 5-metiltetrahidrofolato a la homocisteína, lo que da como resultado la formación de metionina. Los genes relacionados con la síntesis de metionina aumentaron en E. coli después del tratamiento con S-nitrosoglutatión en condiciones que imitaban el estrés nitrosativo. En el último estudio, los mutantes de E. coli interrumpidos en la ruta de síntesis de metionina exhibieron una menor tolerancia a la S-nitrosoglutatión y que la adición de metionina exógena podría anular este efecto86. Esto sugiere que la metionina también podría desempeñar un papel al contrarrestar el estrés nitrosativo en P482.

Además, la síntesis de metionina fue esencial para establecer la simbiosis entre el fijador de nitrógeno Sinorhizobium meliloti y su planta huésped, Medicago sativa87. Al contrario de lo que observamos en P482 en presencia de exudados de raíz de tomate, la síntesis de metionina disminuyó en PAO1 en respuesta a exudados de remolacha25 y en S. typhimurium en respuesta a exudados de lechuga79. Esto sugiere que el papel de la síntesis de metionina en bacterias asociadas a plantas depende del sistema planta-microbio estudiado.

En el contexto de cómo se ven afectados la síntesis y el catabolismo de aminoácidos en P482 tratado con tomate, vale la pena mencionar que estos también pueden tener causas menos sencillas. En P. fluorescens, la fenilalanina 4-hidroxilasa (PAH) participa no solo en el catabolismo de la fenilalanina sino también en la biosíntesis de la melatonina antioxidante a partir del triptófano88,89. También se demostró que el triptófano, la metionina, la tirosina y la fenilalanina, los conocidos precursores de los metabolitos secundarios de las plantas, pueden contribuir a aumentar la resistencia de las plantas90. Se puede especular que el P482, al degradar la fenilalanina, reducir la síntesis de triptófano y equilibrar los niveles de metionina, puede intentar contrarrestar e influir en lo que "interpreta" como la respuesta inmunitaria de la planta.

Los exudados de maíz causaron la regulación positiva de tres subunidades de proteína de fusión de membrana (MFP) de exportadores de RND: mexE, BV82_1337 y BV82_1618. La expresión de mexE estaba especialmente regulada (4,12 log2FC). RND significa superfamilia de bombas de expulsión por división de nodulación y resistencia. Las bombas de eflujo de la superfamilia RND y las proteínas Omp forman complejos proteicos que permiten a las bacterias gramnegativas exportar fármacos nocivos directamente fuera de la célula y no, como en el caso de otros sistemas de eflujo, al espacio periplasmático. Esto hace que las bombas de eflujo RND sean determinantes importantes de la resistencia a múltiples fármacos91. En P. aeruginosa, varios operones de salida confieren resistencia intrínseca de la bacteria a los antibióticos, y el operón mexEF-oprN que contiene mexE confiere resistencia a las quinolonas, el cloranfenicol y la trimetoprima92. Sin embargo, es probable que la resistencia a los antibióticos sintéticos sea solo un efecto secundario de la resistencia a los metabolitos secundarios naturales. Se demostró que la expresión de smeDEF se desencadena por flavonoides producidos por plantas, y que la inactivación de la bomba por eliminación de smeE perjudicó la capacidad de Stenotrophomona maltophilia para colonizar las raíces de la planta de colza93. Por lo tanto, es plausible que la sobreexpresión de mexE en P482 en respuesta a los exudados de maíz esté involucrada en contrarrestar la presencia de metabolitos secundarios específicos de esta planta huésped. En consonancia con el efecto específico del huésped, solo se indujeron en particular, y no todos los transportadores RND, en presencia de maíz. La regulación al alza de czcA y mdtA, que también codifican bombas de eflujo RND, fue impulsada por el tomate (Tabla 1). Se sabe que el maíz y otras gramíneas (Poaceae) producen y secretan benzoxazinoides biocidas, compuestos con un papel establecido en la configuración del microbioma de la planta27,94. Parece que vale la pena investigar si los transportadores RND juegan un papel en la tolerancia de algunas bacterias a los benzoxazinoides.

Ambos exudados aumentaron la expresión de copA y copZ en P482. Sin embargo, la inducción de esos genes fue mucho mayor en respuesta al maíz (Cuadro 1). CopA es una ATPasa transmembrana responsable de la salida de iones Cu+ entregados por la chaperona citoplasmática CopZ. Ambas proteínas son elementos de sistemas de tolerancia a Cu+ bien caracterizados95. El cobre es un oligoelemento esencial para todos los organismos; sin embargo, es tóxico en exceso96. El cobre en forma de CuSO4 es un ingrediente del medio de cultivo de plantas de Hoagland, utilizado en este estudio para cultivar tomate y maíz. Por lo tanto, el hecho de que la respuesta de tolerancia al cobre sea mucho más robusta en los exudados de maíz que en los de tomate debe ser causado por factores dependientes del huésped que afectan la disponibilidad o la toxicidad del cobre. Mavrodi y colaboradores31 mostraron una regulación positiva considerable de uno o más genes cop relacionados con la tolerancia al cobre en 5 de 8 pseudomonas investigadas tratadas con exudados de B. distachyon. Tanto el maíz como B. distachyon son pastos monocotiledóneas y ambos se cultivaron en Hoagland's para los respectivos experimentos.

En P482, los exudados de maíz causaron una regulación positiva de BV82_2809 que codifica FimV, una proteína involucrada en el ensamblaje de pili tipo IV. Los pili tipo IV están involucrados en la adherencia, ciertos tipos de movimiento (deslizamiento social en Myxococcus xanthus y espasmos en especies de Pseudomonas y Neisseria) y formación de biopelículas, invasión tisular guiada y otros eventos relacionados con la patogenia97. Los pili tipo IV son esenciales para la colonización del arroz endófito por el endófito fijador de N2 Azoarcus sp. cepa BH7298. Curiosamente, pilK, involucrada en la motilidad de espasmos, se reguló a la baja en P. aeruginosa en respuesta a los exudados de remolacha25, lo que sugiere que los exudados de remolacha tienen un efecto de sintonización descendente en la formación de pelos en P. aeruginosa, a diferencia del efecto estimulante de los compuestos de maíz en P. aeruginosa. P. donghuensis.

Los exudados de maíz causaron una expresión regulada al alza de fliS en P482, lo que sugiere una mayor síntesis de flagelos relacionados con la natación. Los flagelos son esenciales para que algunas cepas de Pseudomonas colonicen a sus huéspedes de manera eficiente. P. fluorescens F113 con un gen fliS alterado no era móvil y no podía competir con la cepa de tipo salvaje (WT) para colonizar la punta de la raíz de la alfalfa99.

A diferencia de las células tratadas con maíz, no se observó regulación positiva de genes relacionados con la síntesis de pili y flagelos en P482 tratadas con exudados de tomate. Todo lo contrario, los exudados de tomate aumentaron la expresión de un presunto regulador negativo del operón maestro flagelar flhDC en el locus BV82_3459. Se demostró que aunque los flagelos pueden proporcionar una ventaja a las células, su síntesis también puede generar algunas desventajas. El reconocimiento de antígenos flagelares específicos puede inducir una respuesta de hipersensibilidad y muerte celular como parte de la respuesta inmunitaria del huésped100. Una disminución en la síntesis de flagelos se considera un mecanismo importante para evadir la inmunidad de las plantas101. Los estudios sobre P. putida KT2440 sobre las compensaciones metabólicas de producir flagelos mostraron que una cepa mutante no flagelada presenta una fase de latencia más corta y es más resistente al estrés oxidativo que la cepa WT. Se sugirió que la falta del gasto metabólico en la producción de flagelos podría proporcionar a las células un excedente de energía (ATP) y reducir la potencia (NADPH) que las células pueden asignar a otras actividades, incluida la resistencia al estrés102. Por lo tanto, parece que las ventajas de tener una menor expresión de genes flagelares superan las posibles desventajas de aptitud en P482 tratado con exudados de tomate. Los exudados de tomate también regularon a la baja dos genes que codifican proteínas del dominio de señalización de quimiotaxis que aceptan metilo (MCP), que funcionan como los quimiorreceptores predominantes en bacterias y arqueas103.

En conjunto, los exudados de maíz aumentaron la expresión de funciones relacionadas con la motilidad en P482, mientras que se observó lo contrario en respuesta a los exudados de tomate. Queda por dilucidar si esas diferencias están relacionadas con la importancia variable de la motilidad en la colonización de estos dos huéspedes, o si fue el estado fisiológico del tomate muestreado para exudados en nuestro estudio lo que hizo que la expresión de esos genes fuera desfavorable.

Comprender las interacciones planta-microbio es un requisito clave para aprovechar el potencial de los microbios para apoyar la salud de las plantas. Estudiar esas interacciones en toda la complejidad de los sistemas naturales sigue siendo un desafío técnico. Por lo tanto, las configuraciones simplificadas que aíslan las interacciones seleccionadas continúan ayudando a obtener información valiosa31,104. Aquí, identificamos qué aspectos del metabolismo de P. donghuensis P482 se ven afectados de manera diferente por los exudados de las raíces de dos plantas hospedantes diferentes: tomate y maíz (Fig. 4). La composición de los exudados analizados y, por lo tanto, su influencia en P482, probablemente sean el resultado tanto del genotipo de las plantas muestreadas como de su estado fisiológico. Concluimos que el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada cambia a derivación de glioxilato, la resistencia al óxido nítrico, el uso flexible de la cadena respiratoria, la síntesis de metionina y la activación selectiva de bombas de eflujo de tipo RND merecen especial atención en términos de su papel en la forma en que la raíz promiscua las Pseudomonas colonizadoras se adaptan a diferentes huéspedes vegetales y cómo permanecen asociadas cuando se enfrentan a un cambio en el estado fisiológico del huésped.

Respuestas transcriptómicas compartidas y específicas del huésped de P. donghuensis P482 a los exudados de tomate y maíz. Las flechas rojas que apuntan hacia arriba indican la regulación al alza de una vía, mientras que las flechas azules que apuntan hacia abajo indican la regulación a la baja.

Mucha atención en relación con el ensamblaje del microbioma se dedica a la atracción entre los microbios y la planta. En contradicción con esta tendencia, la mayoría de las vías específicas del huésped que hemos descrito en P482 están relacionadas con la resistencia al estrés. A pesar de eso, los exudados estimularon y no inhibieron el crecimiento de P482. Una mayor resiliencia de algunos microbios a factores estresantes particulares puede conducir a cambios en las poblaciones microbianas asociadas a las plantas, particularmente en plantas con respuestas de estrés activadas. Paralelamente al comportamiento social humano, no ser molestado por los arrebatos de la pareja puede ser un factor subestimado en si uno decide quedarse.

Las lecturas de secuenciación sin procesar para este estudio están disponibles en la base de datos de lectura de secuenciación del NCBI (PRJNA868728). Los archivos de análisis de genes diferenciales se depositaron en NCBI Gene Expression Omnibus (GSE211040).

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Nos gustaría agradecer al Prof. Steven E. Lindow (Universidad de California-Berkeley, Berkeley, CA, EE. UU.) por su valiosa contribución a la mejora del manuscrito y la útil discusión, al Prof. Asociado R. Czajkowski (IFB UG & MUG, Gdansk, Polonia) por sus útiles comentarios sobre la versión casi final, y a Tomasz Krzyżanowski (especialista en TI, Varsovia, Polonia) por escribir un script para extraer datos de los archivos de GenBank. También apreciamos mucho el aporte de los Revisores anónimos.

Esta investigación fue financiada por el Centro Nacional de Ciencias (Polonia), proyecto No. 2017/25/B/NZ9/00513 a S. Jafra.

Laboratorio de Microbiología Vegetal, Facultad Intercolegial de Biotecnología UG y MUG, Universidad de Gdańsk, ul. A. Abrahama 58, 80-307, Gdansk, Polonia

Dorota M. Krzyżanowska, Magdalena Jablonska y Sylwia Jafra

Laboratorio de Bioquímica Estructural, Facultad de Química, Universidad de Gdańsk, ul. Wita Stwosza 63, 80-308, Gdansk, Polonia

Zbigniew Kaczynski y Małgorzata Czerwicka-Pach

Laboratorio de Espectrometría de Masas, Facultad Intercolegial de Biotecnología UG y MUG, Universidad de Gdańsk, ul. A. Abrahama 58, 80-307, Gdansk, Polonia

catalina macur

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DMK coordinó el trabajo experimental, participó en la recolección de exudados y cultivos de plantas, procesó los exudados para análisis, llevó a cabo cultivos bacterianos, aislamiento de ARN, RT-qPCR, experimento de colonización de raíces, enriquecimiento funcional y análisis de red de los datos de RNAseq, preparó todas las figuras y tablas, y redactó el manuscrito. MJ cultivó plantas en condiciones gnotobióticas y ayudó con la recolección de exudados. ZK realizó mediciones de RMN. MCP realizó GC-MS. KM realizó el análisis del contenido de aminoácidos por LC-SRM. SJ concibió el estudio, obtuvo financiación, supervisó y coordinó el proyecto y revisó el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

La correspondencia es Sylwia Jafra.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Krzyżanowska, DM, Jabłońska, M., Kaczyński, Z. et al. Rasgos adaptativos del huésped en la colonización de plantas Pseudomonas donghuensis P482 revelados por respuestas transcriptómicas a exudados de tomate y maíz. Informe científico 13, 9445 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36494-6

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Recibido: 24 enero 2023

Aceptado: 05 junio 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36494-6

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