Modulación del microbioma intestinal con nisina - Coastwise Ventures Group Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 7899 (2023) Citar este artículo

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La nisina es una bacteriocina de amplio espectro utilizada ampliamente como conservante de alimentos que se identificó en Lactococcus lactis hace casi un siglo. Mostramos que la nisina ingerida por vía oral sobrevive intacta al tránsito a través del tracto gastrointestinal porcino (como lo demuestra la actividad y la determinación del peso molecular) donde afecta tanto la composición como el funcionamiento de la microbiota. Específicamente, el tratamiento con nisina provocó una disminución reversible de las bacterias Gram positivas, lo que resultó en una remodelación de los Firmicutes y un aumento relativo correspondiente de las Proteobacterias Gram negativas. Estos cambios se reflejaron en la modificación de la abundancia relativa de las vías involucradas en la síntesis de acetato, butirato (disminución) y propionato (aumento), que se correlacionaron con reducciones generales en los niveles de ácidos grasos de cadena corta en las heces. Estos cambios reversibles que ocurren como resultado de la ingestión de nisina demuestran el potencial de las bacteriocinas como la nisina para dar forma a los microbiomas de los mamíferos e impactar en la funcionalidad de la comunidad.

Las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos producidos por muchas especies bacterianas1. La nisina es una bacteriocina producida por Lactococcus lactis que tiene un amplio espectro de actividad contra bacterias Gram-positivas2,3. La nisina A ha sido aprobada para su uso como conservante de alimentos por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) (Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU., 1988) y la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA; número E E234) y, por lo tanto, es consumida por humanos4. La nisina (en forma de Nisaplin comercialmente disponible) se ha administrado a ratas sin efectos adversos, en dosis de hasta 239 mg por kg de peso corporal5. La nisina tiene eficacia in vitro contra patógenos intestinales Gram positivos como Clostridioides difficile6 y, en combinación con cinamaldehído y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), se ha demostrado que controla el crecimiento de Escherichia coli enterotoxigénica Gram negativa (ETEC)7. También se ha demostrado que la nisina tiene eficacia in vivo en los microbiomas murinos8,9 y de pollo10, así como eficacia ex vivo en el microbioma humano11. No obstante, ningún estudio ha demostrado su eficacia in vivo en grandes mamíferos hasta el momento. Debido a su naturaleza proteica, se ha supuesto que la nisina se descompondrá en la parte superior del intestino debido a la exposición a enzimas proteolíticas, como hemos demostrado anteriormente para otras bacteriocinas, a saber, la lacticina 314712 y la turicina CD13. Si la nisina no llega intacta al TGI inferior14,15, no debería afectar a la microbiota intestinal cuando se ingiere por vía oral. En este estudio, alimentamos a lechones posdestete con nisina en alta concentración para determinar su impacto en la microbiota intestinal mediante secuenciación 16S, metagenómica (escopeta), GC-MS y Maldi-Tof MS. También incluimos una preparación a base de etilcelulosa para proteger (encapsular) la nisina contra una posible degradación en el GIT16 superior y compararla con la nisina no encapsulada, algo que no se probó en estudios anteriores.

Aquí, demostramos que la nisina intacta no encapsulada se entrega al TGI inferior de los cerdos y provoca cambios significativos pero reversibles en la composición microbiana, los niveles de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) y en vías metabólicas específicas durante todo el período de tratamiento.

El objetivo de este estudio fue evaluar si la nisina ingerida por vía oral podría llegar intacta al intestino y modular el microbioma intestinal de los cerdos (Fig. 1a). Debido a la naturaleza proteica de la nisina, utilizamos tanto nisina no encapsulada (Nis-pdr) como encapsulada (Nis-en), que se añadían directamente al pienso de los cerdos. Este estudio también contenía un grupo de control sin tratamiento (Ctl) y un grupo que recibió el material que se usó para encapsular la nisina (Encap). Finalmente, monitoreamos la composición y funcionalidad de la microbiota intestinal luego de la interrupción del tratamiento, para determinar cuánto tiempo persistieron los cambios.

Descripción general del experimento, resultados de espectroscopia de masas y metabolómica. (a) Descripción general de los grupos de tratamiento y el cronograma de muestreo. ( b ) Análisis de espectrofotometría de masas MALDI TOF y ensayos de actividad para detectar nisina (imágenes). Detección de nisina intacta (flechas rojas) en las heces de cerdo en el grupo tratado con nisina en polvo al inicio (BL), 24 h después del tratamiento inicial (T24), 48 h después del tratamiento inicial (T48), 72 h después del tratamiento inicial (T72 ), 72 h después de la interrupción del tratamiento inicial (3d PT) y 10 días después de la interrupción del tratamiento inicial (10d PT). Se encontraron zonas más pequeñas y masas de nisina en el día 7 y no se encontraron zonas ni masas en el día 14 (1 en 10 dil). ( c ) Actividad biológica de nisina y detección de picos de nisina en muestras fecales porcinas, utilizando espectrofotometría de masas Maldi TOF. (d) Concentración de SCFA (mM) en control (aquí Ctl y Encap agrupados juntos) versus grupos de nisina (aquí nis-en y nis-pdr agrupados juntos) sobre BL, T72 y 10d PT (prueba Wilcoxon Rank Sum, *p < 0.05 , **p < 0,01, ***p < 0,001).

Tanto la espectrometría de masas MALDI TOF como los ensayos de actividad confirmaron la presencia de nisina intacta y actividad antibacteriana en las heces de cada cerdo en los grupos tratados con nisina encapsulada y polvo de nisina durante todo el período de tratamiento (Fig. 1b). Este análisis reveló un pico correspondiente a la masa molecular de la nisina intacta (3331.05 Da) en los días de tratamiento en los dos grupos tratados con nisina (Nis-en y Nis-pdr) (ver la Fig. 5 complementaria para Nis-en). La bioactividad, medida mediante ensayos de difusión en pozos, se confirmó en las heces de todos los cerdos en los grupos de nisina encapsulada y polvo de nisina durante tres días después de la interrupción del tratamiento. Sin embargo, los tamaños de las zonas fueron más pequeños que los observados en los días de tratamiento con nisina (Fig. 1b, c). No se detectó nisina intacta y activa en ninguna de las muestras de referencia (BL), el grupo de encapsulado (Encap) o en el grupo de control sin tratamiento (Ctl), ni en ninguna de las muestras tomadas diez días después de que cesó el tratamiento (10d PT) .

Se analizaron muestras fecales tomadas al inicio (BL), después de cuatro días consecutivos de tratamiento (T72) y diez días después de que cesó el tratamiento (10d PT) para determinar la concentración de SCFA. Se utilizó un método específico para analizar las muestras en busca de 10 compuestos diferentes (acetato, ácido fórmico, ácido propiónico, butirato, ácido isobutírico, ácido isovalérico, ácido valérico, ácido 4-metilpentanoico, ácido hexanoico y ácido heptanoico). El ácido 4-metilpentanoico solo se encontró en cinco muestras, y en todos los casos a niveles muy cercanos al límite de detección. El ácido hexanoico y el ácido heptanoico se excluyeron de análisis posteriores porque los niveles en las muestras de referencia (BL) estaban por debajo del límite de detección para el 50 % o más de las muestras. Por lo tanto, se incluyeron seis compuestos en el análisis estadístico: butirato, acetato, ácido isovalérico, ácido isobutírico, ácido valérico y ácido propiónico (Tabla complementaria 2). Para evaluar las diferencias relacionadas con el tratamiento de los sujetos, se realizó la prueba Wilcoxon Rank Sum comparando los grupos de control (Ctl y Encap agrupados) y tratamiento (nis-en y nis-pdr agrupados) en los diferentes puntos temporales. Los resultados mostraron una disminución significativa en el nivel de acetato (p = 0,004, diferencia de 40,13 %), butirato (p = 0,0012, diferencia de 66,15 %), ácido isobutírico (p = 0,03, diferencia de 36,47 %) y ácido isovalérico (p = 0,035, diferencia del 36,36 %) en el grupo tratado con nisina en comparación con el grupo de control en T72 (Fig. 1d). No se observaron otras diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Diez días después de la interrupción del tratamiento, solo el nivel de butirato permanece significativamente más bajo (p = 0,048). La mayor variación en los niveles de SCFA entre las muestras se observó 10 días después del tratamiento.

El índice de conversión alimenticia (FCR) es un índice común utilizado para medir la eficiencia alimenticia en cerdos. La ganancia de peso diaria promedio y la ingesta diaria promedio de alimento aumentaron durante el período de prueba. No hubo diferencias en el peso vivo de los cerdos entre los grupos de tratamiento (Fig. S1a complementaria). Esto no fue inesperado dada la corta duración del estudio. El rendimiento de crecimiento de los cerdos se muestra en la Fig. S1b complementaria.

Evaluamos la composición de la comunidad microbiana de los diferentes grupos de tratamiento en tres puntos de tiempo diferentes (BL, T72, 10d PT) utilizando tanto la metagenómica de escopeta como el perfil de ARNr 16S. Firmicutes fue el filo más abundante en todos los grupos de tratamiento en las muestras de referencia (principalmente Bacillus, especies de Clostridium, Erysipelotrichia y Negativicutes), seguido de Bacteroidetes, mientras que Actinobacteria y Proteobacteria fueron menos abundantes (Fig. 2a, b). A lo largo del estudio, se observaron cambios en la composición de la microbiota entre los grupos de tratamiento. Después de tres días consecutivos de tratamiento (T72), hubo diferencias significativas en la composición general de la comunidad entre los grupos sin tratar y con tratamiento (p < 0,001, PERMANOVA). En particular, hubo una remodelación de la composición de la familia Firmicutes en los grupos tratados con nisina, con un aumento de Negativicutes y una disminución de las especies de Bacillus. También se observó un aumento de proteobacterias (principalmente gammaproteobacterias) en los grupos tratados con nisina, y el grupo Nis-pdr tuvo el mayor aumento (360 % en relación con BL). Este cambio observado en los grupos tratados con nisina revirtió a una composición similar a los niveles de referencia diez días después de que cesaron los tratamientos. La composición de la microbiota en los grupos de control y encapsulante se mantuvo relativamente estable durante el período de prueba, con un notable aumento continuo de Actinobacteria a lo largo del tiempo, así como pequeños cambios en Firmicutes (aumento de especies de Bacillus acompañado de una disminución de especies de Clostridium) en T72 en el grupo de los encapsulantes. En general, observamos los mismos resultados con el ARNr 16S (Fig. S2 complementaria).

La composición de la comunidad de microbiomas y la diversidad beta son significativamente diferentes en el tratamiento con nisina en T72, mientras que la diversidad alfa no lo es. (a) Gráfica de Sankey que muestra la abundancia relativa del microbioma en los diferentes grupos de control versus tratamiento con nisina en el nivel de Clase. Las flechas rojas y la línea de puntos corresponden a la dosis más alta de nisina en las muestras. (b) Gráfica de Sankey que muestra la abundancia relativa del microbioma en los diferentes grupos de control versus tratamiento con nisina en el nivel de Phylum. Las flechas rojas y la línea de puntos corresponden a la dosis más alta de nisina en las muestras. ( c ) Diversidad alfa, medida utilizando el índice de Shannon, que cambia significativamente entre grupos en T72 (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, * p < 0.05, ** p < 0.01). El área gris y rosa indican los grupos de control (Encap y Ctl) y los grupos de tratamiento con nisina (Nis-en y Nis-pdr), respectivamente. ( d ) Diversidad alfa, medida utilizando el índice de Shannon, que se muestra dentro de cada grupo. No se observaron diferencias significativas. ( e ) Ordenación de PCoA (distancia Bray-Curtis) que muestra que las muestras de Nis-en y Nis-pdr en T72 se agrupan principalmente (elipses azules y rosas, respectivamente). Las elipses representan un IC del 95 % alrededor del centroide del grupo para cada grupo del área de estudio en T72. ( f ) Ordenación de PCoA (distancia Unifrac) que muestra que las muestras de Nis-en y Nis-pdr en T72 se agrupan en su mayoría (elipses azul y rosa, respectivamente). Las elipses representan un IC del 95 % alrededor del centroide del grupo para cada grupo del área de estudio en T72.

La diversidad alfa, medida con el índice de Shannon, muestra que al inicio del estudio no hay diferencias significativas entre los grupos de tratamiento (Fig. 2c). Existen diferencias significativas al final del período de tratamiento (T72) entre los grupos tratados con nisina en comparación con el grupo de control sin tratamiento (prueba de Wilcoxon Rank Sum, p < 0,05 y p < 0,01 para el grupo Nis-en y Nis-pdr, respectivamente) ). Sin embargo, esta diferencia no se observó dentro de cada grupo al comparar T72 con el valor inicial y el PT de 10 días, lo que sugiere que el tratamiento con nisina no tuvo un impacto significativo en la diversidad alfa (Fig. 2d). No se observaron diferencias significativas entre los grupos de control y encapsulante después de tres días consecutivos de tratamiento.

Para investigar más a fondo las diferencias de diversidad de los grupos de tratamiento y los puntos de tiempo, se evaluó la diversidad beta basada en las distancias de Bray-Curtis (Fig. 2e) y Unifrac (Fig. 2f). Las muestras de referencia de todos los grupos de tratamiento se agruparon. Después de tres días consecutivos (T72) de alimentación de los tratamientos, hubo un cambio en la diversidad en los grupos tratados con nisina en comparación con los grupos no tratados con nisina (BH adj. p < 0,01, distancias PERMANOVA de Bray-Curtis y Unifrac). Diez días después de que cesó la alimentación de los tratamientos, la diversidad beta en los grupos tratados con nisina fue de nuevo comparable a la de los grupos no tratados con nisina.

Para identificar qué especies cambiaron más entre sí en el grupo tratado con polvo de nisina después de tres días consecutivos, se utilizó un análisis de abundancia diferencial utilizando el método de clasificación diferencial (DR) basado en abundancias relativas. Clasificación diferencial reformula la abundancia diferencial a nivel de especie como una regresión multinomial basada en el cambio de pliegue logarítmico. Las especies con coeficientes altos (Fig. 3a) (positivo (azul) o negativo (rojo); la referencia para la comparación son los grupos de tratamiento con nisina en T72) pudieron distinguir mejor las especies en el grupo de tratamiento con nisina durante el período de tratamiento en T72.

Las bacterias grampositivas disminuyen significativamente durante el tratamiento con nisina, mientras que las bacterias gramnegativas aumentan significativamente. ( a ) Coeficientes del modelo del análisis de regresión multinomial realizado con Songbird (modelo: especie ~ tratamiento con nisina x días) clasificados según nis-pdr en T72. Las especies con coeficientes altos (positivas y más abundantes en nis-pdr T72, azul, o negativas y menos abundantes en nis-pdr T72, rojo; rosado, grampositivo, púrpura, gramnegativo) fueron más capaces de distinguir nis-pdr grupo durante el tratamiento en T72. (b) Composición de la comunidad a nivel individual de las 10 especies principales con coeficientes positivos (gris, grupos de control, rosa, tratamiento con nisina). (c) Composición de la comunidad a nivel individual de las 10 especies principales con coeficientes negativos (gris, grupos de control, rosa, tratamiento con nisina). (d) Diagrama de caja que muestra la abundancia relativa de las especies que disminuyeron significativamente durante nis-pdr T72 solo en comparación con nis-pdr línea base y nis-pdr 10d PT (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, *p < 0.05, **p < 0.01 , *** p < 0,001). Todos son grampositivos (púrpura) excepto Prevotella sp CAG 520 (rosa).

De las 20 especies bacterianas que disminuyeron diferencialmente en los grupos de tratamiento con nisina en T72, dieciséis eran Gram-positivas (Fig. 3a, c). En particular, Anaerostipes hadrus, Bifidobacterium pseudocatenulatum y Dorea longicatena fueron indetectables durante el tratamiento con nisina en todos los cerdos y, por lo tanto, responden mejor a la nisina. Las bacterias Gram negativas que disminuyeron significativamente en el grupo de tratamiento en T72 eran todas del género Prevotella. Otras especies Gram-positivas como Catenibacterium mitsuokai, Collinsella aerofaciens, Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus reuteri fueron más significativas o solo disminuyeron en Nis-pdr en T72 (Fig. 3c, d). A pesar de las considerables variaciones a nivel individual, el tratamiento con Nis-pdr explicó la variabilidad entre muestras. Un enfoque en Nis-pdr reveló que las especies que disminuyeron significativamente en T72 volvieron a los niveles previos al tratamiento después de diez días (Fig. 3d).

De las veinte especies bacterianas que aumentaron diferencialmente en los grupos de tratamiento con nisina en T72, 17 eran Gram-negativas (Fig. 3a, b). Especies como Acidaminococcus fermentans¸ Esherichia coli, Phascolarctobacterium succinatutens y Prevotella copri aumentaron diferencialmente en casi todos los individuos tratados con nisina en T72. Las únicas especies Gram-positivas que fueron diferencialmente más abundantes en los individuos tratados con nisina en T72 fueron Dorea formicigenerans, Eubacterium callanderi y Ruminococcus sp. CAG 624.

En conjunto, los resultados muestran que las bacterias grampositivas estaban subrepresentadas en los grupos tratados con nisina, mientras que las bacterias gramnegativas estaban sobrerrepresentadas, especialmente en el grupo Nis-pdr en los días en que se administró nisina. Sin embargo, luego de la interrupción del tratamiento, estas comunidades microbianas en el grupo tratado con nisina volvieron a niveles similares a los niveles previos al tratamiento, como se observó 10 días PT.

El perfil funcional de la comunidad microbiana se evaluó mediante metagenómica de escopeta. El análisis de coordenadas principales (PCoA) de los recuentos de genes (recuentos por millón) reveló que el perfil funcional microbiano en los grupos tratados con nisina en T72 fue significativamente diferente de los otros grupos (PERMANOVA, BH adj. p <0,01) (Fig. 4a). Además, los grupos tratados con nisina exhibieron un perfil de vía metabólica divergente durante el período de tratamiento en T72 para la mayoría de las vías encontradas en los datos metagenómicos (vías MetaCYC, prueba Wilcoxon Rank Sum, p <0.01) (Fig. 4b). Vías como la biosíntesis de aminoácidos y la biosíntesis de nucleótidos no cambiaron entre los grupos de tratamiento y los puntos de tiempo. Estas vías son utilizadas por todas las bacterias, y esperamos que los cambios en la composición bacteriana no las afecten. Por el contrario, la abundancia relativa de vías como la biosíntesis de vitaminas, la biosíntesis de lípidos, el metabolismo del azufre, la degradación de ácidos grasos y lípidos y la degradación de compuestos aromáticos aumentó en los grupos tratados con nisina en T72, mientras que la vía de respiración disminuyó ( p < 0,01 basado en la prueba Wilcoxon Rank Sum de log2 fold change con BL como referencia). Algunas vías, como la vía de biosíntesis de estructura celular, probablemente estén directamente influenciadas por la nisina debido a su acción sobre las membranas celulares. Esta diferencia en la abundancia de las rutas también refleja el cambio en la composición bacteriana después del tratamiento con nisina. Para investigar esto más a fondo, observamos las vías metabólicas más diferencialmente abundantes en una jerarquía más baja, estratificadas por especies, utilizando la herramienta Songbird descrita anteriormente (Fig. 4c). Los grupos tratados con nisina mostraron perfiles de abundancia diferencial similares tanto en la línea de base como en el 10d PT. Las vías más asociadas con los grupos tratados con nisina en T72 (en azul en la Fig. 4c) pertenecen a bacterias Gram negativas que anteriormente se encontró que eran más abundantes en estos grupos en estos puntos de tiempo (es decir, Escherichia coli y Mitsuokella jalaludinii). De manera similar, las vías que estaban más asociadas con los grupos tratados con nisina al inicio y 10 días PT (y, por lo tanto, en su mayoría ausentes en T72) pertenecen a bacterias Gram-positivas previamente identificadas como más abundantes en estos grupos y en estos puntos de tiempo (es decir, Lactobacillus johnsonii y Roseburia sp CAG 471), a excepción de Butyricicoccus porcorum que no fue identificado previamente. Es de destacar que dos vías (biosíntesis de L-arginina y degradación de galactosa) se asociaron con grupos tratados con nisina en T72 y grupos tratados con nisina al inicio y 10d PT, pero son transportados por bacterias diferentes, lo que probablemente refleja el reemplazo de especies Gram-positivas por Especies gramnegativas que realizan, al menos en parte, funciones similares. No obstante, algunas funciones parecen ser exclusivas de los grupos tratados con nisina en T72. Por ejemplo, la vía más asociada con los grupos tratados con nisina en T72 fue la biosíntesis de enterobactina, un sideróforo que se encuentra principalmente en bacterias Gram negativas.

Análisis funcional de los grupos control versus tratamiento. ( a ) Ordenación de PCoA (distancia Bray-Curtis) de los recuentos de genes HUMAnN (recuentos por millón) para Nis-en y Nis-pdr en T72 versus los otros grupos. (b) Mapa de calor que muestra la composición funcional (log (recuento de HUMANN por millón)) en la jerarquía de nivel de ruta MetaCyc más alta de los diferentes grupos en los diferentes puntos de tiempo (área gris, grupos de control, área rosa, grupos de tratamiento; las flechas rojas corresponden a la dosis más alta de nisina en las muestras). Las rutas se agrupan jerárquicamente utilizando la distancia euclidiana. (c) Mapa de calor que muestra las 30 vías HUManN más diferencialmente abundantes según sus puntuaciones de Songbird (modelo: vías ~ tratamiento con nisina x días) para los grupos Nisina (Nis-en y Nis-pdr) en la línea de base versus T72 (izquierda) y 10d PT versus T72 (derecha). Estas rutas están estratificadas por especies (se muestran en la barra de la derecha). Mostramos aquí las 15 vías más positivas (es decir, más asociadas con la nisina en la línea de base (izquierda) o 10d PT (derecha)) y las 15 vías más negativas (es decir, más asociadas con la nisina en T72). (d) Abundancia (recuento de HUMANN por millón) de las vías involucradas en la producción de SCFA en los diferentes grupos en diferentes puntos de tiempo y sus diferencias (prueba de suma de rangos de Wilcoxon, *****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0,01, *p < 0,05, ns: no significativo). ( e ) Log2 veces los cambios de las 20 especies principales con la mayor y menor abundancia de genes log2 veces los cambios en los grupos tratados con nisina en relación con su línea de base respectiva.

Luego evaluamos la representación de los genes involucrados en la producción de SCFA en los diferentes grupos en diferentes momentos. Hubo una disminución significativa en la abundancia de genes involucrados en la producción de butirato en el grupo de nisina encapsulada y el grupo tratado con nisina en polvo entre la línea de base y T72 (prueba Wilcoxon Rank Sum, p < 0.0001 y p < 0.01 respectivamente) (Fig. 4d ). A los 10 días PT, hubo un aumento significativo en la representación de estos genes (prueba Wilcoxon Rank Sum, p < 0,05). De manera similar, este patrón se observó en los genes asociados con la producción de acetato. Se observó un aumento significativo en los genes involucrados en la producción de propionato entre la línea de base y T72 en Nis-en. Tras la interrupción del tratamiento, estos niveles volvieron a los niveles iniciales. También observamos la abundancia de genes involucrados en la producción de SCFA estratificados por las especies que los portan (Fig. 4e). Las 10 especies principales con el mayor y menor cambio log2 en la abundancia de genes en el tratamiento con nisina relacionado con BL mostraron que las especies responsables de la producción de SCFA cambiaron de mayoritariamente grampositivas a mayoritariamente gramnegativas para acetato y butirato durante el tratamiento con nisina. En particular, los Firmicutes son reemplazados por bacterias Gram-negativas como E.coli para acetato o Prevotella sp. para butirato. Sorprendentemente, se observó lo contrario para el propionato, con un aumento de la abundancia de genes portados por especies Gram-positivas durante el tratamiento con nisina, a saber, Ruminococcus sp. Esto podría estar relacionado con el aumento de algunas especies de Ruminoccocus durante el tratamiento con nisina mostrado anteriormente (Fig. 4a). En general, estos resultados muestran una estructura comunitaria funcionalmente alterada durante el tratamiento con nisina, principalmente debido al reemplazo de bacterias Gram-positivas por bacterias Gram-negativas. , que se restablece después de que ha cesado la alimentación del tratamiento.

Revelamos que la nisina, utilizada en una concentración muy por debajo del nivel sin efecto adverso observado (NOAEL)17, permaneció intacta durante el tránsito intestinal y modificó con éxito la microbiota intestinal porcina, reduciendo la abundancia relativa de muchos microorganismos Gram-positivos. Nuestra hipótesis es que las modificaciones postraduccionales presentes en los lantibióticos como la nisina protegen a estas bacteriocinas en el entorno intestinal. Por el contrario, los péptidos de pre-nisina sintetizados sin estas modificaciones son fácilmente digeridos por la tripsina y la quimotripsina (Fig. S4 complementaria). Los hallazgos de nuestro estudio desafían un dogma importante en la investigación de bacteriocinas: que las proteasas descomponen las bacteriocinas en el intestino, lo que las vuelve inactivas y, por lo tanto, inadecuadas para la administración oral a menos que se encapsulen. Por el contrario, demostramos que la nisina puede sobrevivir al tránsito gástrico en cantidades suficientes para modificar el microbioma intestinal cuando la ingiere un animal grande y destaca el potencial del uso de lantibióticos como herramienta para modificar el microbioma intestinal.

La composición de la microbiota intestinal se vio afectada en los grupos tratados con nisina durante el tratamiento, pero volvió a niveles similares a los de los grupos no tratados tan pronto como tres días después de que cesó el tratamiento, mientras que la diversidad no se vio afectada significativamente. También observamos que el polvo de nisina fue más eficiente que la nisina encapsulada. El tratamiento con nisina resultó en el agotamiento de bacterias Gram-positivas como Lactobacillus y un aumento en la abundancia relativa de bacterias Gram-negativas como Escherichia coli durante el tratamiento. El tratamiento con nisina tiene un efecto selectivo sobre las bacterias Gram-positivas, y estas bacterias posiblemente sean reemplazadas por especies Gram-negativas. Curiosamente, algunas bacterias Gram-negativas, especialmente Prevotella, son sensibles al tratamiento con nisina, como se mostró anteriormente con la nisina Z18, mientras que algunas bacterias Gram-positivas, por ejemplo Ruminococcus, parecen ser inmunes a la nisina. Además, se encontraron altos niveles de Catenibacterium tanto en el grupo de control con encapsulante como en el grupo de nisina encapsulada, en comparación con los grupos de control y nisina en polvo. Esto sugiere que Catenibacterium está degradando potencialmente el material encapsulante de celulosa y usándolo como fuente de energía.

También observamos cambios a nivel funcional en los grupos tratados con nisina durante el tratamiento con nisina, con las vías más diferencialmente aumentadas todas relacionadas con bacterias Gram-negativas y las vías más diferencialmente disminuidas todas relacionadas con bacterias Gram-positivas, lo que refleja los cambios en la composición taxonómica. Algunas vías de las especies Gram-positivas (p. ej., Roseburia) fueron reemplazadas por las mismas vías presentes en las especies Gram negativas (p. ej., E. coli), lo que apunta a posibles reemplazos de nichos ecológicos. Sin embargo, también aumentaron otras vías exclusivas de las bacterias Gram-negativas (p. ej., enterobactina asociada con E. coli), lo que demuestra que el reemplazo de bacterias Gram-positivas por Gram-negativas no fue completamente equivalente funcionalmente, algo que también se observa en el orden superior. vías de jerarquía que eran casi todas diferentes de BL (Fig. 4b). Además, observamos el aumento de las vías potencialmente relacionadas con las adaptaciones de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas al estrés inducido por la nisina. Por ejemplo, observamos un aumento en las vías asociadas con las vitaminas (especialmente la menaquinona, consulte la Fig. S3 complementaria). En muchas bacterias, la síntesis de menaquinona, moléculas solubles en lípidos que se insertan en la membrana celular bacteriana, puede verse afectada por el estado de la membrana celular19, lo que proporciona información sobre el impacto que la nisina puede tener en la microbiota en función de su mecanismo de acción. que implica la unión al lípido II.

Observamos una disminución general en los niveles de SCFA en los grupos tratados con nisina en T72. Estos se recuperaron diez días después de que el tratamiento había cesado en los grupos tratados con nisina, aunque volviendo a niveles más bajos que el grupo alimentado con el material encapsulante o el grupo de control sin tratamiento. Se ha demostrado que Lactobacillus y Catenibacterium metabolizan los carbohidratos, incluidos los oligosacáridos y el almidón, que se fermentan en el intestino grueso a SCFA y luego pueden ser utilizados por los cerdos20,21,22,23. Su disminución probablemente explica, al menos en parte, la disminución de SCFA. Este es especialmente el caso de la disminución de Catenibacterium por acetato, que no se compensa completamente con especies Gram-negativas como E. coli (Fig. 4e). Para el butirato, los Firmicutes Gram-positivos son reemplazados por Oscillibacter y Prevotella, pero como otras bacterias Gram-positivas continúan desempeñando un papel importante en la producción de butirato mientras disminuyen en abundancia relativa, la concentración general de butirato disminuye. Curiosamente, para el propionato, las bacterias Gram-negativas parecen ser reemplazadas por las bacterias Gram-positivas Ruminococcus que parecen ser resistentes a la nisina. Al afectar los SCFA luminales, la microbiota intestinal puede modular la excreción intestinal de incretina y, por lo tanto, ejercer otra influencia en la regulación de la glucosa24,25,26.

Este estudio destaca el potencial de la nisina para modular el microbioma cuando se toma por vía oral. El efecto temporal en el microbioma fue remodelar las proporciones de Gram positivos y negativos y, al hacerlo, reducir la producción de SCFA. Aunque la nisina A utilizada en este estudio es de amplio espectro, hemos podido cambiar la especificidad del lantibiótico a través de enfoques de ingeniería de péptidos27,28 Además de esto, el número en rápida expansión de bacteriocinas modificadas postraduccionalmente de tipo I con diferentes especificidades abre oportunidades para usarlos para aplicaciones de edición de microbiomas (Fig. S4 complementaria). Además, dado que la nisina mata una variedad de bacterias indeseables, incluidos los estreptococos patógenos y los clostridios, podría usarse como una alternativa a los antibióticos en algunos casos. Un beneficio adicional de la nisina, como se destaca en este estudio, es la capacidad de la microbiota para volver a la composición previa al tratamiento en comparación con el impacto más duradero de algunos tratamientos con antibióticos que pueden persistir hasta dos años después del tratamiento29.

Hubo cuatro grupos de tratamiento dietético de la siguiente manera: (i) una dieta de enlace estándar no medicada (grupo de control; Ctl); (ii) la dieta de enlace complementada con 150 mg/kg de peso corporal de nisina en polvo (Nis-pdr) (Handary, Bruselas, Bélgica; alto contenido de nisina en polvo ZP (95 % de contenido/ultrapuro; % peso/peso; potencia hidratada ≥ 38 000 UI/mg)); (iii) la dieta de enlace suplementada con 850 mg/kg de peso corporal de nisina ZP encapsulada (Nis-en) (Sublimy Therapeutics, Dublín, Irlanda); y (iv) la dieta de enlace suplementada con 110 mg/kg de peso corporal del material encapsulante (Encap). El material encapsulante fue etilcelulosa (98%) (DOW Chemical Company Limited, Staines, Inglaterra; cedida por Sublimity Therapeutics). La dosis de nisina administrada en la nisina encapsulada (Tratamiento 3) fue equivalente a la del grupo tratado con polvo de nisina (Tratamiento 2). La cantidad de encapsulante administrado en el Tratamiento 4 fue equivalente a la cantidad en la formulación de nisina encapsulada en el Tratamiento 3. Los tratamientos en forma de polvo se cubrieron con una pequeña cantidad de alimento con 5–10 ml de agua por la mañana para asegurar que todo el los tratamientos se consumieron cada día.

Este estudio se realizó en el Departamento de Desarrollo Porcino, Teagasc, Moorepark, Fermoy, Cork, Irlanda. En la Fig. 1 se presenta un esquema que representa la estructura del ensayo. Los lechones (Large White X Landrace) se destetaron a los 28 (± 3) días, se alojaron en grupos de camadas intactas y se alimentaron con una dieta de inicio durante 6 días con cada cerdo con etiqueta en la oreja. con un número único para fines de identificación. De este grupo de 150 cerdos, 40 machos fueron seleccionados y bloqueados por peso corporal y origen de la camada, y luego asignados aleatoriamente a uno de los cuatro tratamientos dietéticos detallados anteriormente (N = 10 cerdos/tratamiento). Los cerdos se alojaron individualmente en corrales totalmente enrejados (1,2 m × 0,9 m) y cada uno recibió una dieta de enlace no medicada durante un período de aclimatación de siete días. La temperatura ambiente se mantuvo entre 28 y 30 °C durante la primera semana posterior al destete y luego se redujo 2 °C cada semana hasta alcanzar una temperatura de 22 °C en la sala. Se proporcionó alimento y agua ad libitum, se aseguró iluminación durante ≥ 8 h/día y se proporcionó enriquecimiento ambiental. Después del período de aclimatación de siete días, comenzó el tratamiento dietético. Se brindó tratamiento dietético durante cuatro días, luego de lo cual los cerdos fueron nuevamente alimentados con la dieta de enlace común no medicada durante diez días hasta el final de la prueba. El análisis proximal y la composición de aminoácidos de las dietas utilizadas se presentan en la Tabla complementaria 1. Todos los cerdos se pesaron individualmente el día 0 (D0) (Fig. 1) antes del inicio de la prueba (línea de base (BL)). El rendimiento del crecimiento se evaluó pesando todos los cerdos en dos ocasiones más (i) a la mitad de la prueba (Día 6; dos días después de que cesó el tratamiento) y (ii) al final de la prueba (Día 14; diez días después del tratamiento). había cesado). La ingesta voluntaria de alimento se registró diariamente entre el inicio y el final de la prueba, y se utilizó para calcular la tasa de conversión alimenticia (FCR) dividida por la ganancia diaria promedio.

Se tomaron muestras fecales antes de que comenzara el tratamiento para determinar la microbiota de referencia (D0; BL). Se tomaron muestras fecales adicionales 24 h después de la alimentación del tratamiento inicial (T24), 48 h después de la alimentación del tratamiento inicial (T48) y 72 h después de la alimentación del tratamiento inicial (T72). Estas muestras se tomaron para evaluar el impacto inmediato del tratamiento en la microbiota intestinal porcina. También se tomaron muestras fecales hacia el final del ensayo, tres días después de que cesó el tratamiento (3d PT) y diez días después de que cesó el tratamiento (10d PT). Estas muestras se tomaron para observar la recuperación de la microbiota intestinal al finalizar el tratamiento. A partir de estas muestras también se determinó el destino de la nisina ingerida. Las muestras fecales se recogieron recién evacuadas, cuando estaban disponibles; de lo contrario, se recogieron después de la estimulación rectal. Las muestras se recogieron en recipientes estériles y se almacenaron brevemente en hielo (< 2 h) y se submuestrearon en tubos Eppendorf estériles de 2 ml. A continuación, las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para la extracción de ADN y el análisis SCFA o a -20 °C para detectar la presencia y actividad de nisina (para ensayos de difusión en pozos (WDA) y análisis de masa MALDI TOF). espectrometría (MALDI TOF MS)).

El ADN se extrajo de 200 mg de heces de cada cerdo en BL, T24, T48, T72, 3d PT y 10d PT utilizando el kit de ADN fecal Zymo Research ZR (Cambridge Biosciences, Cambridge, Reino Unido), de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

El ADN se extrajo de las muestras fecales tomadas en BL, T24, T48, T72, 3d PT y 10d PT. Los amplicones del gen 16S rRNA (región V3–V4) se generaron y secuenciaron utilizando la plataforma Illumina MiSeq™. La región variable V3-V4 del gen 16S rRNA se amplificó a partir de 240 muestras de ADN fecal utilizando el protocolo de biblioteca de secuenciación metagenómica 16S (Illumina San Diego, CA). Se cuantificaron las muestras y se prepararon bibliotecas para la secuenciación como se describió anteriormente35. En resumen, las bibliotecas de secuenciación de amplicón de ARNr 16S se prepararon de la siguiente manera: se completaron dos reacciones de PCR en el ADN molde. En primer lugar, se amplificó el ADN con cebadores específicos de la región V3–V4 del gen 16S rRNA, que también incorporan el adaptador saliente de Illumina (cebador directo 5′TCGT CGGC AGCG TCAG ATGT GTATAAGA GACA GCCT ACGG GNGG CWGCAG; cebador inverso 5′GTCT CGTG GGCTCGGA GATG TGTA TAAG AGAC AGGA CTAC HVGG GTAT CTAATCC). Después de esto, se realizó una segunda reacción de PCR con dos cebadores de indexación (cebadores de indexación Illumina Nextera XT) agregados para permitir la demultiplexación. Las muestras se analizaron en Illumina MiSeq en Teagasc Sequencing Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irlanda, utilizando el kit Miseq 600 Cycle v2 y siguiendo los protocolos de secuenciación estándar de Illumina. Después de la secuenciación, los datos se analizaron para establecer el efecto del tratamiento con nisina en la composición de la microbiota intestinal. El número promedio de OTU por muestra fue de 123 814 +/− 34 649 con un rango entre 24 578 y 231 778.

Se prepararon bibliotecas de secuenciación de extremos pareados a partir del ADN extraído de 120 muestras (BL, T72 y 10d PT) con el kit de preparación de bibliotecas Illumina Nextera XT (Illumina), seguido de la secuenciación en la plataforma Illumina NextSeq 500 con química de alto rendimiento (2 × 150 pb) según las instrucciones del fabricante en el Centro de Secuenciación de Teagasc.

La nisina se extrajo de las muestras fecales de la siguiente manera: las muestras se suspendieron en 1 ml de alcohol isopropílico al 70 % que contenía ácido trifluoroacético (TFA) y (IPA) al 0,1 %, se agitaron completamente y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos. min a 16.000 gy se retuvo el sobrenadante. El paso de centrifugación se repitió tres veces más reteniendo el sobrenadante cada vez. La masa molecular correspondiente al pico de nisina se observó usando MALDI TOF MS con un Axima TOF2 (Shimadzu Biotech, Kyoto, Japón), como se describió previamente25.

Se colocaron 400 miligramos de materia fecal congelada en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml. Se añadieron 800 microlitros de agua estéril al tubo de microcentrífuga de 2 ml. La muestra se agitó vigorosamente durante 30 s para generar una suspensión fecal. A continuación, las muestras se centrifugaron a 12.000 g durante 30 min a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y se transfirió a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml. Este paso se repitió. A continuación, el sobrenadante se volvió a centrifugar a 12.000 g durante 30 min a 4 °C. Este sobrenadante se transfirió a un tubo de centrífuga costar spin de 0,2 µM (Sigma-Aldrich, Reino Unido) y se filtró por centrifugación a 12.000 g durante 10 min a 4 °C. Se retiró el filtro del tubo y el agua fecal se almacenó a -20 °C antes del análisis metabolómico. Las muestras fueron analizadas por MS-Omics ApS, Frederiksberg, Dinamarca, para determinar los niveles de metabolitos, incluidos los SCFA.

La actividad antibacteriana en las muestras fecales porcinas se estimó mediante ensayos de difusión en pozos (WDA)30 en placas de agar sembradas con Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus LMG6901, como se detalló anteriormente31. En los ensayos se usó agua fecal, preparada como antes. Las muestras se dispensaron en los pozos del agar sembrado en alícuotas de 50 μL y las placas de agar se incubaron anaeróbicamente durante la noche a 37 °C. La actividad antibacteriana resultó en zonas de inhibición alrededor de los pocillos. Se utilizaron muestras de animales que no habían consumido nisina como controles negativos para garantizar que las zonas de inhibición se debieran a la inhibición de la nisina.

Las lecturas emparejadas se recortaron y la calidad se filtró utilizando PRINSEQ versión 0.20.432. Las secuencias resultantes tenían una puntuación de calidad media superior a 20. A continuación, las secuencias de extremos emparejados directos e inversos se unieron con una superposición mínima de 10 pb mediante fastq-join33. Las secuencias se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) utilizando un algoritmo de referencia cerrada en USEARCH versión 7.034 y las quimeras se eliminaron con la base de datos de referencia RDP Gold.

Las lecturas de secuenciación de escopeta metagenómica se calificaron y recortaron, y las lecturas humanas (genoma de referencia humano hg19) se filtraron con KneadData v0.10.0 con las opciones predeterminadas. Luego, las lecturas de secuenciación calificadas se perfilaron taxonómicamente a nivel de especie mediante MetaPhlAn v3.0.135 y las otras opciones con configuraciones predeterminadas. MetaPhlAn depende de un conjunto de genes marcadores específicos de clado únicos (~ 1,1 millones) identificados a partir de ~ 100 000 genomas de referencia (~ 99 500 genomas bacterianos y arqueales y ~ 500 genomas eucarióticos) para proporcionar una cuantificación panmicrobiana a nivel de especie, incluidas bacterias, arqueas, eucariotas microbianos y virus35,36. HUMAnN v3.0.035,37 logró anotaciones funcionales que incluyen vías MetaCyc y abundancias de familias de genes. Los archivos de la familia de genes se reagruparon con la función "humann_regroup_table" de HUMAnN a "go_uniref90" (Ontología de genes), "level4ec_uniref90" (Comisión de enzimas), "ko_uniref90" (Ortología KEGG) y vías de HUMAnN (recuento por millón) y genes de HUMAnN (recuento por millones) términos, respectivamente.

La matriz taxonómica obtenida con MetaPhlAn v3.0.1 se utilizó para el análisis de diversidad alfa (índice de Shannon) y diversidad beta de Bray-Curtis utilizando el paquete R "PhyloSeq" v1.34.038. Para la diversidad alfa, se realizaron comparaciones por pares entre los grupos utilizando una prueba de suma de rangos de Wilcoxon emparejada con el paquete R "Stats"39. El análisis de abundancia diferencial se realizó con Songbird v1.0.440. En resumen, Songbird es un método de abundancia diferencial consciente de la composición que proporciona clasificaciones de características en función de su cambio de pliegue logarítmico con respecto a las covariables de interés. Utiliza un método de clasificación diferencial (DR) que reformula el análisis de abundancia diferencial como un problema de regresión multinomial. En este caso, usamos la fórmula y los parámetros "songbird multinomial –formula "C (Group, Treatment ('nis_T72'))" –épocas 10,000—diferencial-anterior 0.5 –summary-interval 1 –min-sample-count 1" donde "nis_T72" corresponde a los grupos Nis-en T72 y Nis-pdr T72.

Seleccionamos las 20 especies de Metaphlan3 más altas y las 20 de menor rango asociadas con Nis-en y Nis-pdr en T72 y calculamos la relación logarítmica de estos conjuntos de taxones. Comparar las proporciones de los taxones de esta manera mitiga el sesgo de la carga microbiana total desconocida en cada muestra y tomar el logaritmo de esta proporción otorga el mismo peso a los aumentos y disminuciones relativos de los taxones. La evaluación del modelo Songbird para Nis-en y Nis-pdr en T72 frente a un modelo de referencia obtuvo un valor Q2 de 0,323.

Los genes asociados con SCFA se extrajeron de la tabla go_uniref90gene tanto estratificados por especies como no estratificados, normalizados para contar por millón (cpm). Se utilizaron los siguientes genes para los diferentes SCFA: acetato quinasa (ackA) para acetato, butirato quinasa (buk) y butiril-CoA: acetato CoA transferasa (but) para butirato y metilmalonil-CoA descarboxilasa (mmdA), lactoil-CoA deshidratasa ( lcdA), y propionaldehído deshidrogenasa dependiente de CoA (pduP) para propionato. Se agregaron lecturas de diferentes genes para cada SCFA para dar el valor representativo que se usó en el análisis. Se calcularon los cambios de log2 veces para cada grupo relacionado con BL. El análisis de abundancia diferencial de las vías HUMAnN (tanto estratificadas como no estratificadas) también se realizó con Songbird. Usamos la misma fórmula y parámetros que para el análisis taxonómico de abundancia diferencial descrito anteriormente. La evaluación del modelo Songbird para Nis-en y Nis-pdr en T72 frente a un modelo de referencia obtuvo un valor Q2 de 0,154.

La significación estadística se calculó mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (utilizando la función "wilcox.test" implementada en R 4.0.2), con opción pareada. Los valores de p se ajustaron por descubrimiento falso utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg.

El análisis de coordenadas principales (PCoA) se realizó en función de la abundancia relativa de especies bacterianas y los recuentos de genes HUMAnN (recuentos por millón) en cada metagenoma fecal evaluado mediante distancias de Bray-Curtis. La importancia del agrupamiento por variables (es decir, tratamiento con nisina frente a grupos de control) se determinó mediante análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA) con 1000 permutaciones (paquetes R "PhyloSeq", "vegan" y "pairwiseAdonis").

Para el análisis estadístico y visualización de los resultados se utilizó R versión 4.0.2.

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Animal de Teagasc (TAEC185-2018) y se obtuvo un número de licencia experimental (AE19132/P083) de la Autoridad Reguladora de Productos Sanitarios de Irlanda (HPRA). Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea 2010/63/UE sobre la protección de los animales con fines científicos. El estudio se informa de acuerdo con las pautas de ARRIVE (https://arriveguidelines.org).

Los códigos utilizados para la bioinformática y el análisis estadístico se depositarán en Github cuando el manuscrito sea aceptado para su publicación. Mientras tanto, los códigos se pueden compartir a pedido. Los datos de metagenómica de escopeta generados o analizados durante el estudio actual están disponibles en el NCBI con el nombre de proyecto PRJNA906489 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA906489).

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Descargar referencias

Los autores agradecen a Tomás Ryan y David Clarke (Departamento de Desarrollo de Cerdos, Teagasc) por su asesoramiento, ayuda técnica y muestreo antes y durante el ensayo. Los autores agradecen a Beatriz Gómez Sala (Departamento de Biociencias Alimentarias, Teagasc) y Gillian Gardiner (Universidad Tecnológica del Sureste, Waterford, Irlanda) por sus consejos antes del ensayo. Los autores también agradecen a Matthew Aijuka y Cecilia Soria (Departamento de Biociencias Alimentarias, Teagasc) por su apoyo durante el período de muestreo, y a Fiona Crispie (Centro de Secuenciación de Teagasc) por la secuenciación. Agradecemos a los revisores anónimos por sus útiles sugerencias.

Esta investigación fue financiada por Science Foundation Ireland en forma de una subvención del centro (APC Microbiome Ireland grant number SFI/12/RC/2273).

Estos autores contribuyeron por igual: Ghjuvan M. Grimaud y Mairéad Coakley.

APC Microbiome Ireland, University College Cork, Co. Cork, Irlanda

Catherine O'Reilly, Ghjuvan M. Grimaud, Mairéad Coakley, Paula M. O'Connor, Harsh Mathur, Veronica L. Peterson, Ciara M. O'Donovan, Paul D. Cotter, Catherine Stanton, Mary C. Rea, Colin Hill y R.Paul Ross

Departamento de Biociencias Alimentarias, Centro de Investigación Alimentaria Teagasc, Moorepark, Fermoy, Co. corcho, irlanda

Catherine O'Reilly, Ghjuvan M. Grimaud, Mairéad Coakley, Paula M. O'Connor, Harsh Mathur, Veronica L. Peterson, Ciara M. O'Donovan, Paul D. Cotter, Catherine Stanton y Mary C. Rea

Departamento de Microbiología, University College Cork, Co. Cork, Irlanda

Catherine O'Reilly, Paula M. O'Connor, Colin Hill y R. Paul Ross

Departamento de desarrollo porcino, Centro de innovación e investigación de animales y pastizales de Teagasc, Moorepark, Fermoy, Co. corcho, irlanda

Pedro G. Lawlor

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PR, CH, CS, MR, COR diseñaron el estudio. COR, MC, POC, HM, VP, PL realizaron los experimentos y la secuenciación. GG y COD realizaron la bioinformática y el análisis estadístico. COR, GG, PR escribieron el manuscrito con la contribución de todos los demás autores. Todos los autores aprueban el manuscrito actual para su publicación.

Correspondencia a R. Paul Ross.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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O'Reilly, C., Grimaud, GM, Coakley, M. et al. Modulación del microbioma intestinal con nisina. Informe científico 13, 7899 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34586-x

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Recibido: 21 noviembre 2022

Aceptado: 03 mayo 2023

Publicado: 16 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34586-x

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